益腸散結顆粒對結腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的調節作用及機制研究

侯愛畫， 戴玲玲， 孟鵬， 張曉妮， 譚松， 劉澤， 趙嘯虎

（1.煙臺市中醫醫院腫瘤科，山東煙臺 264000；2.煙臺市中醫醫院腫瘤四科，山東煙臺 264000；3.煙臺市中醫醫院腫瘤一科，山東煙臺 264000）

結腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率占全球惡性腫瘤的第3 位，死亡率占第5 位[1]。數據統計[2]顯示，我國每年約有120萬患者被診斷為結直腸癌，其中，因結腸癌死亡的患者超過60 萬。近年來研究[3-5]發現，腸道菌群失調可介導結腸癌的發生發展。腸道菌群失衡會導致腸道黏膜上皮細胞遺傳學改變，引發腸道炎癥反應和微環境紊亂，同時還可通過持續產生細胞毒素刺激腫瘤的發生和發展。目前，姑息手術、放化療、靶向治療、免疫治療和介入治療等是晚期結腸癌的主要治療手段，但由于晚期結腸癌患者正氣不足和免疫力低下往往難以承受，且藥物在殺傷腫瘤細胞的同時亦致機體免疫力降低，對患者毒副作用較大[6]。因此，尋找有效低毒的治療方法對臨床治療結腸癌具有重要意義。中醫治法在結腸癌的綜合治療中具有獨特的辨證論治和整體思想，不僅可以幫助患者增強正氣和免疫力，還可以減輕臨床癥狀，提高生活質量[7-8]。我院國家重點?？茖W術帶頭人、山東省名老中醫專家侯愛畫教授總結中醫學理論認識及多年的臨床實踐經驗，基于“扶正祛邪治癌”的學術觀點，以“益氣健脾、祛濕化濁、散結消積”為主要治法，擬定益腸散結方。本方治療結腸癌的臨床療效顯著，能減輕患者的臨床主癥，提高免疫功能及生活質量，但具體作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在探究益腸散結顆粒對結腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的作用及機制，以期為臨床應用提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級4~6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質量17~19 g，購自上海中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。將小鼠飼養于溫度21~25 ℃，相對濕度55%~65%的動物房內，光照晝夜交替12 h/12 h循環，標準鼠飼料及無菌水飼養，自由飲食飲水，適應性喂養7 d。本研究方案已通過煙臺市中醫醫院倫理委員會批準（編號：2021-013-KY）。

1. 2 藥物、試劑與儀器 益腸散結顆粒（黨參24 g、炒白術15 g、黃芪30 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、砂仁9 g、姜半夏9 g、女貞子15 g、陳皮15 g、郁金9 g、大青葉6 g、魚腥草9 g、浙貝9 g、甘草9 g），由煙臺市中醫醫院制劑室加工顆粒。葡聚糖硫酸鈉（DSS，美國Sigma 公司）；氧化偶氮甲烷（AOM，瑞典TdB 公司）；過表達黑色素瘤缺失基因2（AIM2）質粒（pcDNA-AIM2，美國賽默飛世爾科技公司）；免疫球蛋白（Ig）G、IgM、白細胞介素（IL）-1β、IL-18 酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（北京Solarbio 公司）；磁珠法土壤和糞便基因組DNA 提取試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；AIM2、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）等抗體（上海聯邁生物工程有限公司）；CD4+抗體、CD3+抗體、CD8+抗體（美國Abcam公司）。高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；PCR儀（美國ABI公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Illumina MiseqDNA 測序儀（美國Illumina Sandiego公司）。

1.3 分組、模型制備與給藥 將60只小鼠隨機分為6 組，即正常組、模型組，益腸散結顆粒低、中、高劑量組，pcDNA-AIM2干預組，每組10只。采用AOM/DSS誘導法制備結腸癌模型[9]。除正常組外，其余各組小鼠均一次性腹腔注射10 mg/kg的致癌劑AOM；正常組一次性腹腔注射生理鹽水10 mg/kg?；謴? d 后，除正常組外，其余各組小鼠灌胃質量分數為3%的DSS 水溶液，每日1 次，持續5 d，開始腸炎Ⅰ期造模，而后換回飲用水持續14 d 為腸炎恢復期，如此19 d 為1 個DSS 周期。結腸癌模型的建立一共需要3個DSS周期，之后正常飼養直至腫瘤成熟，整個模型周期約4個月。同期，正常組小鼠對應給予生理鹽水處理。

從腸炎恢復期Ⅰ期第11 天開始，各組給藥。根據成人臨床用量換算后的動物用量，益腸散結顆粒低、中、高劑量組分別灌胃含生藥0.56、1.11、1.67 g/kg的益腸散結顆粒水溶液，每日1次，直至實驗結束需8周；pcDNA-AIM2組給予一次性腹腔注射10 μg pcDNA-AIM2質粒；正常組和模型組小鼠一次性腹腔注射生理鹽水。各組均飲用高壓滅菌水直至實驗結束。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 小鼠一般狀況 在實驗周期中，觀察各組小鼠飲食、活動、精神、毛發、糞便性狀及生存情況，并繪制各組小鼠生存曲線。

1. 4. 2 小鼠成瘤情況 實驗結束前禁食8 h，用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將胸腔和腹腔剖開。從盲腸的末端開始，逐步分離結腸和直腸，一直到達肛門處。PBS漂洗結腸，觀察小鼠成瘤情況并計算腫瘤體積[（最長徑×垂直短徑2）/2]。

1.4.3 脾指數測定 實驗周期結束后，解剖各組小鼠取脾組織，吸水紙將組織表面的水分吸干，稱取質量，并計算脾指數。脾指數=脾質量（mg）/體質量（g）。

1.4.4 ELISA法檢測小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β和IL-18 水平 實驗結束前禁食8 h，小鼠麻醉滿意后，抽取腹主動脈血，離心取血清。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IgG、IgM 水平和炎癥因子IL-1β和IL-18水平。

1. 4. 5 流式細胞儀檢測外周血T 細胞CD3+、CD4+、CD8+水平 取各組小鼠全血100 μL，置于2 mL 不含肝素的EP 管中，分別加入2 μL 的CD4+抗體和5 μL 的CD3+、CD8+抗體，充分振蕩均勻，在室溫的環境中避光反應15 min。將1.5 mL的紅細胞裂解液加入到樣品中染色，混勻后，在4 ℃環境中避光孵育15 min，以離心機1 000 r/min（離心半徑15 cm）的速度離心5 min。收集并棄掉上清液，用PBS溶液洗滌沉淀1次，后將0.5 mL的PBS稀釋沉淀，于流式細胞儀上檢測各組小鼠全血中CD3+、CD4+、CD8+水平，并計算CD4+/CD8+比值。

1. 4. 6 HE 染色法檢測結腸組織病理學變化 取小鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后切片，經酒精脫水，二甲苯中透明。加入蘇木素染色，蒸餾水沖洗后酒精脫水，伊紅染色，于顯微鏡下觀察。

1. 4. 7 16S-rDNA 腸道菌群測序 收集各組小鼠糞便，使用磁珠法土壤和糞便基因組DNA 提取試劑盒抽提糞便中DNA，電泳質檢并定量DNA 定量。加入338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）-806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物，對16S rRNA 基因擴增。擴增條件：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共27 個循環。將提取的DNA于-80 ℃環境保存，將PCR產物構建測定文庫，用Illumina MiSeq 平臺測序并分析數據。使用QIIME程序對序列進行生物學分析，uPares軟件對有效數據在97%水平的操作分類單元（OTU）行聚類分析。根據OTU 結果（包括Observed 指數、Chao1 指數和Shannon 指數），以微生物多樣性分析比較組間菌群差異。

1. 4. 8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達 取結腸組織，提取總蛋白，用BCA 法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2 μg/mL，置于熱水中煮沸10 min，后保存在-20 ℃冰箱中。將30 μg的蛋白樣品用200 V 電壓電泳，轉移蛋白樣品于PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h。將一抗（1∶500 稀釋）加入到PVDF 膜上，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入HRP 標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。加入ECL 放光液，曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計方法 采用Graphpad priam 8.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數± 標準差（）表示。針對多組間的數據，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）來進行統計學比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，進行Log-Rank 檢驗比較生存率之間的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較 除正常組外，其余各組小鼠在腸炎Ⅰ期飲用3%DSS 第5 天起腸炎癥狀最為明顯，腹瀉嚴重且伴有出血，進食飲水量減少，毛色暗淡，精神狀態差，活動減少?；謴? d 后腸炎癥狀逐漸減輕，10 d 后體質量恢復平穩，此時給藥組開始給藥干預。腸炎Ⅱ、Ⅲ期小鼠癥狀較Ⅰ期癥狀有所減輕，此時為腸炎慢性期，可見藥物組小鼠的狀態明顯好于模型組。造模80 d 后小鼠結腸腫瘤逐漸形成，部分可見肛外瘤。

2.2 各組小鼠生存率及腫瘤體積比較 圖1 結果顯示：正常組小鼠生存率為100%；與正常組比較，模型組小鼠生存率顯著降低（P＜0.05），生存率為20%（2/10），腫瘤體積顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠生存率顯著升高（P＜0.05），分別為40%（4/10）、50%（5/10）、90%（9/10），腫瘤體積減少（P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠生存率[均為90%（9/10）]、腫瘤體積與pcDNA-AIM2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠生存率和腫瘤體積比較Figure 1 Comparison of survival and tumor volume in mice among various groups

2. 3 各組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β 和IL-18水平比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠血清中IgG、IgM水平顯著降低，IL-1β、IL-18水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠血清中IgG、IgM水平顯著升高，IL-1β、IL-18 水平顯著降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β 和IL-18 水平與pcDNA-AIM2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β和IL-18水平比較Figure 2 Comparison of serum levels of IgG，IgM，IL-1β，and IL-18 among various groups of mice

2.4 各組小鼠外周血T 細胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較 圖3結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值降低，CD8+水平升高（均P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值升高，CD8+水平降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值與pcDNA-AIM2 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠外周血T細胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較Figure 3 Comparison of levels of peripheral blood CD3+，CD4+，CD8+T cells among various groups of mice

2.5 各組小鼠脾指數比較 圖4 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠脾指數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠脾指數顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠脾指數與pcDNA-AIM2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組小鼠脾指數比較Figure 4 Comparison of splenic index among various groups of mice

2.6 各組小鼠結腸組織病理學變化比較 圖5 結果顯示：正常組小鼠結腸隱窩排列緊湊整齊，黏膜層和肌層結構完整；模型組小鼠有顯著的隱窩腺瘤，且伴有炎癥浸潤，隱窩分支且擴張；與模型組比較，益腸散結顆粒中劑量組、益腸散結顆粒高劑量組和pcDNA-AIM2 組結腸組織惡性程度顯著降低，隱窩腔雖有部分擴張，但大部分較為完整。

圖5 各組小鼠結腸組織HE染色結果（×200）Figure 5 HE staining results of mice colon tissue in each group（×200）

2.7 各組小鼠腸道菌群α 多樣性比較 圖6 結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠Observed 指數、Chao1 指數和Shannon 指數均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠Observed 指數、Chao1 指數和Shannon 指數均升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠Observed 指數、Chao1 指數和Shannon 指數與pcDNA-AIM2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 各組小鼠腸道菌群α多樣性比較Figure 6 Comparison of the α diversity of the intestinal flora in various groups of mice

2.8 各組小鼠腸道菌群群落結構比較

2.8.1 門水平上 圖7-A 結果顯示：與正常組比較，模型組擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）菌落相對豐度顯著降低，厚壁菌門（Firmicutes）、 放線菌門（Actinobacteria）和Patescibateria 菌落相對豐度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組擬桿菌門和變形菌門菌落相對豐度顯著升高，厚壁菌門、放線菌門和Patescibateria菌落相對豐度顯著降低（P＜0.05）；益腸散結顆粒高劑量組腸道菌群菌落相對豐度與pcDNA-AIM2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖7 各組小鼠腸道菌群結構圖Figure 7 Structure of intestinal flora in each group of mice

2.8.2 屬水平上 圖7-B 結果顯示：與正常組比較，模型組鼠桿菌科（Muribaculaceae）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae-NK4A136group）和瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）菌落相對豐度顯著降低，乳桿菌屬（Lactobacillus）、臭桿菌屬（Odoribacter）、別樣桿菌屬（Alistipes）、未培養的瘤胃球菌科（Ruminococcaceaeuncultured）和擬桿菌屬（Bacteroides）菌落相對豐度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組桿菌科、毛螺菌屬和瘤胃梭菌屬菌落相對豐度顯著升高，乳桿菌屬、臭桿菌屬、別樣桿菌屬、未培養的瘤胃球菌科和擬桿菌屬菌落相對豐度顯著降低（P＜0.05）；益腸散結顆粒高劑量組腸道菌群菌落相對豐度與pcDNA-AIM2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.9 各組小鼠結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1蛋白表達比較 圖8結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結顆粒低、中、高劑量組小鼠結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；益腸散結顆粒高劑量組小鼠結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達與pcDNA-AIM2 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖8 各組小鼠結腸組織中AIM2、ASC、caspase-1蛋白表達比較Figure 8 Comparison of protein expressions of AIM2，ASC，and caspase-1 in the colonic tissues among various groups of mice

3 討論

結腸癌歸屬于中醫學“積聚”“臟毒”“腸積”“鎖肛痔”等病癥范疇，病機特點為正虛為本，邪實為標。正氣不足，臟腑功能失調，加之各種致病因素導致痰凝、濕滯、血瘀、熱毒等證候要素出現，使得邪毒內侵，長期閉阻經脈，阻礙氣血暢通，精血和津液凝聚，邪毒在腸道內瘀結，最終演變成為腸癌[10]。故結腸癌以正氣不足、脾腎功能失調為根本病機，同時發生濕熱、瘀毒等證候要素相互結合[11]。侯愛畫教授認為，治療結腸癌應以中西醫結合的方式，二者取長補短，使臨床療效最大化，創立了中藥復方益腸散結方。全方注重扶正驅邪，共奏補脾燥濕、散結軟堅的功效。本研究采用AOM 和DSS 誘導結腸癌小鼠模型，結果顯示，模型組小鼠生存率和腫瘤體積顯著增加，不同劑量的益腸散結顆粒均可抑制小鼠生存率和腫瘤體積，提示益腸散結顆粒對結腸癌小鼠有較好的療效。

細胞免疫系統在機體免疫對抗腫瘤中扮演主要角色，而作為細胞免疫最重要的T淋巴細胞，則通過功能各異的T淋巴細胞亞群來發揮免疫調節作用。其中，CD3+細胞分布在每個T淋巴細胞中，代表T淋巴細胞的總數，還可以作為鑒別T淋巴細胞的指標。CD4+細胞主要是輔助體液免疫和細胞免疫，若CD4+細胞的表達水平降低，會通過降低免疫反應的誘導作用降低機體抗腫瘤的能力[12]。CD8+細胞是一種抑制性T淋巴細胞，可抑制自身抗體生成負性調控免疫反應[13]。當CD4+/CD8+比值較低時，機體的免疫系統的功能會受到影響，對外界病原微生物和突變細胞的識別和殺傷能力會降低，從而為腫瘤的迅速生長、轉移以及繼發感染等病理過程創造了條件[14]。本研究結果顯示，益腸散結顆?？稍黾咏Y腸癌小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值，降低CD8+水平，提示益腸散結顆?？稍鰪娊Y腸癌小鼠機體免疫功能，增強機體識別殺傷突變細胞的能力。

免疫球蛋白是機體免疫防御機制的重要組成部分，能識別并消滅外來病原體和異常細胞。當B淋巴細胞接觸到外來的病原體時，就會開始分泌免疫球蛋白，包括IgA、IgG、IgM等。這些抗體可以識別與病原體相關的物質，并對其進行結合與破壞，從而發揮體液免疫的作用[15]。其中，IgG 是血液中主要的免疫球蛋白，可以激活補體和促進吞噬功能，在機體再次遭受同樣病原體攻擊時，扮演著關鍵的角色[13]。本研究結果發現，益腸散結顆粒能夠增加結腸癌模型小鼠血清中IgG和IgM的含量，表明益腸散結顆粒有助于提高結腸癌小鼠自身的體液免疫能力，從而能更好地對抗結腸癌的侵襲。

脾指數是指脾臟大小在體內所占比例，可評估機體的免疫防御和造血功能[16]。本研究結果顯示，益腸散結顆?？梢种平Y腸癌小鼠脾指數，進一步證實益腸散結顆?？稍黾咏Y腸癌小鼠自身免疫力。

腸道菌群是一個復雜的微生態系統，在腸道結構、免疫及代謝作用中起重要作用，通過其代謝物參與碳水化合物和蛋白的水解發酵，影響腸上皮細胞增殖和分化[17]。腸道菌群微生物組成的改變有利于致癌細菌的滋生，影響結腸癌的相關微環境。α多樣性反應的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，其中，Observed和Chao1指數越高代表菌群豐度越高，Shannon 值越大代表菌群多樣性越高。謝輝等[18]研究證實，可通過增加小鼠腸道菌群豐度及多樣性抑制結腸癌的發展。本研究結果顯示，益腸散結顆?？稍黾幽c道菌群豐度和多樣性，且能抑制厚壁菌門、放線菌門和Patescibateria菌落及乳桿菌屬、臭桿菌屬、別樣桿菌屬、未培養的瘤胃球菌科和擬桿菌屬菌落相對豐度，糾正腸道菌群紊亂，通過調節菌群而抑制腸癌的發展。

AIM2 是一種細胞內模式識別受體，能夠激活炎癥小體的形成[19]。炎癥小體由3 種蛋白質組成，包括感受器、接頭蛋白ASC 和效應分子caspase 前體。炎癥小體的主要作用是激活caspase-1，將IL-1β、IL-18 等細胞因子的前體切割為成熟的細胞因子，從而發揮促進炎癥反應的作用。炎癥小體是炎癥反應關鍵的組成部分，其失調與多種慢性炎癥、感染和自身免疫性疾病密切相關[20]。Zhu等[21]研究證實，結腸癌易敏感的AIM2-/-小鼠因腸道微生物群失調而加重，但與健康小鼠腸道微生物群的交換改善了結腸癌易感性。因此推測，AIM2在結腸癌中起著保護作用，其可能通過炎癥小體獨立的方式發揮功能，控制腸道干細胞增殖，調節腸道微生物群。本研究結果顯示，益腸散結顆?？稍黾咏Y腸癌小鼠腸道組織中AIM2、ASC 和caspase-1 蛋白表達，抑制血清中IL-1β、IL-18 水平，提示益腸散結顆?？赡芡ㄟ^促進結腸癌AIM2炎性小體的激活，調節腸道菌群平衡，增加自身免疫力。為了進一步驗證本結果，本研究采用過表達AIM2質粒和高劑量益腸散結顆粒聯合干預結腸癌小鼠，結果顯示，過表達AIM2和高劑量益腸散結顆粒具有相似的作用，均能激活AIM2 信號，增強自身免疫力，改善腸道菌群結構。

綜上所述，益腸散結顆?？稍鰪娊Y腸癌小鼠自身免疫力，改善腸道菌群結構，其作用機制可能與激活AIM2炎性小體有關。由于時間和成本等因素，本研究尚未對AIM2炎性小體對益腸散結顆粒改善結腸癌小鼠腸道菌群的影響進行驗證，使本研究結果存在一定局限性，在今后的研究中會完善相關的實驗研究，為臨床治療結腸癌提供更多真實有效的實驗依據。