葡萄酒中非生物代謝來源有害物質的研究進展

孫曉涵,張雪,石寶暉,張會寧,馬雯,,4,5*

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021) 3(福建藍家渡酒莊有限公司,福建 龍巖,364201)4(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021) 5(寧夏葡萄與葡萄酒工程技術中心,寧夏 銀川,750021)

葡萄酒作為果酒的一種,是葡萄或葡萄汁在釀酒酵母的作用下經過酒精發酵形成的葡萄副產物。隨著中國葡萄酒市場的不斷擴大,葡萄酒這一產品也擁有了更多的消費者,人們也越來越重視葡萄酒的安全質量問題,開始更多關注葡萄酒生產過程中可能產生的有害物質尤其是非生物代謝來源的有害物質。這些物質往往產生于釀酒葡萄的種植、葡萄酒的釀造或陳釀過程,如種植期間噴灑的農藥、使用的加工助劑以及后期加工設備帶來的污染等,若沒有全產業鏈的安全生產標準規范、參考標準以及防控措施就極易造成葡萄酒的質量安全問題。

葡萄酒中非生物代謝來源的有害物質超標不但會嚴重影響葡萄酒的品質,對香氣、顏色、口感產生不良影響[1],還會危害人體健康。葡萄酒中常見的生物代謝來源有害產物有氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A和生物胺等物質[2];非生物代謝有害產物主要包括抗農藥殘留、重金屬污染和鹵代芳香族有機物等。這些物質會對人體造成傷害,農藥殘留在人體內蓄積導致慢性中毒,還存在致畸、致癌、致突變等風險[3];重金屬不僅危害葡萄的生長,也會隨著在葡萄中的富集進入葡萄酒[4];鹵代芳香族有機物很容易在葡萄酒的生產過程中出現[5]。

如果葡萄酒的品質不佳,消費者的健康難以保障,消費者就會喪失對產品的信任,從而造成客戶流失、銷量下降等負面影響,嚴重阻礙企業的生存與發展,甚至影響到國產葡萄酒品牌的樹立以及邁向世界的步伐。世界衛生組織將葡萄酒中某些對人體健康存在嚴重危害的物質列為關鍵監測物,這些物質成為國際貿易中的關鍵技術因素。因此,從這些非生物代謝來源有害產物的來源、檢測及防控措施方面總結闡釋,有助于為預防控制葡萄酒中過量的非生物代謝來源的有害產物提供理論參考。本文詳細闡述了農藥殘留、重金屬和鹵代芳香族有機物3種非生物代謝來源有害物質對葡萄酒質量和安全的影響,著重從它們的來源、危害、檢測方法及防控措施4個方面進行了闡釋。

1 農藥殘留

不易降解的農藥施用后在土壤及作物的部分殘留稱為農藥殘留,其在生物體內積累,會導致中毒反應。

1.1 農藥殘留的來源及危害

葡萄酒中的農藥殘留污染主要來源于葡萄原料。葡萄種植過程中經常發生病蟲害,為保證葡萄的品質和產量,在種植過程中,殺菌劑、殺蟲劑、除草劑的使用通常不可避免。常用于葡萄病蟲害防治的農藥包括有機氯農藥和有機磷農藥。比如,用于防治霜霉病的有機氯農藥百菌清,在植物表面具有良好的黏附性,不易被雨水沖刷,極易在植物表面殘留[6],使用不合理易造成葡萄農藥殘留超標,如使用農藥殘留超標的葡萄原料釀造葡萄酒,殘留農藥就可能轉移到葡萄酒中從而危害人體健康。

有機氯農藥能在人體脂肪、組織器官中蓄積從而引發中毒[3],還具有致畸、致癌、致突變的能力。有機磷農藥(如樂果)有神經毒素,可抑制膽堿酯酶活性,造成乙酰膽堿的過量蓄積,從而引起中樞神經中毒。這些農藥會通過與葡萄表面接觸以及根部和葉部吸收等途徑殘留在葡萄中,最終轉移到葡萄酒中[7],但是國家相關標準并未對葡萄酒中的農藥殘留限量做出有關限定,僅對于葡萄中的農藥殘留限量做出了限定[GB 2763—2021 《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》]。表1中是國家標準對葡萄農藥殘留限量規定,共涉及176種農藥。OIV組織也未對葡萄酒中農藥殘留做出相關規定,但是在一些進口葡萄酒中檢測到了部分農藥殘留[8]。研究發現,各種加工工藝都會影響葡萄酒中最終的農藥殘留度,大部分加工過程可降低農藥殘留,如一些水溶性較小的農藥殘留在澄清過濾過程中有所降低;但也存在某些農藥母體在微生物作用下代謝為比自身毒性更大的產物,如三唑酮在酵母發酵過程代謝為三唑醇[9]。如若在種植過程中噴施不合理,極易造成葡萄中農殘超標,這些農藥殘留及其代謝物最終通過飲用進入人體,在人體內蓄積對健康造成嚴重危害。

農藥殘留不但影響人體健康,還會抑制酵母菌等微生物的活性,從而抑制酒精發酵,影響香氣物質的產生和色澤變化,進而對葡萄酒的品質造成不良影響[7, 10]。BRIZ-CID等[10]對經農藥處理和未經農藥處理的葡萄釀制的葡萄酒中酚類成分、顏色和香氣變化進行了研究對比,發現在2013年的葡萄酒中,殺菌劑處理增加了葡萄酒中單體花色苷和黃烷-3-醇的含量,同時提高了亮度,但降低了成熟果香和新鮮果香。

1.2 農藥殘留的檢測及去除方法

色譜法是國標中常用的農殘的檢測方法,具有操作簡單、快速準確的優點。近年來,關于優化色譜檢測方法的研究探索也在持續進行。崔宗巖等[11]采用固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜法檢測葡萄酒中的農殘,通過優化萃取條件,使可檢測目標農藥達94種,檢出限<10 μg/L,操作簡單、快速。CASTRO等[12]采用超高效液相色譜-串聯質譜,為50種化合物中48種提供了低于1 ng/mL的定量限,線性響應度高達200 ng/mL,快速、準確,適用于葡萄酒中農殘的快速篩查檢測。周春紅等[13]用超高效液相色譜-質譜/質譜聯用法對葡萄酒中41種農藥殘留進行檢測,該方法前處理簡單,線性良好,適于廣泛應用。此外,還有一些關于傳感器法[14-15]、免疫分析法[16-17]和快速離子遷移譜檢測[18]等方法的研究。

減少農藥殘留可以從源頭和加工過程兩方面入手:一是從源頭上,科學合理使用農藥,減少農藥的用量和使用頻次,發展新型環保農藥;培育抗病害品種,利用葡萄自身的防御體系抵御病蟲害[3]。POZO-BAYN等[19]通過基因轉移,將二苯乙烯合成酶DNA植入到葡萄砧木來增強其抗菌性。二是從加工過程中除去,包括去皮、澄清等。DOULIA等[20]研究了7種不同的澄清劑對紅酒中農藥的吸附效果:活性炭>明膠>蛋清>聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)>酪蛋白>膨潤土,發現農藥疏水性越好,澄清效果越好,單一溶液中農藥的去除效果最好。劉振宇等[21]研究了脈沖電場法對農藥降解的作用,發現該方法能有效降解葡萄酒醪中的有機磷農藥,為脈沖電場在葡萄酒加工中的應用提供了理論支撐和參考。

2 重金屬污染

重金屬分為必需重金屬和非必需重金屬,具有較高的原子序數和密度,不易分解,攝入過量會危害人體健康。

2.1 重金屬的污染的來源及危害

葡萄酒中的金屬污染可能來源于原料、釀造過程、貯存過程和銷售過程等不同的階段,工藝設備的質量及組成是影響成品中金屬含量的關鍵[22]。原料中的金屬可能來源于土壤,受化學農藥、化肥使用和環境污染狀況的影響;加工過程的處理、包裝材料的質量以及葡萄酒中化學成分之間的相互作用對葡萄酒中的金屬含量也有重要影響;此外,摻假也會帶入一些不必要的金屬[22]。表2是國家標準GB/T 15037—2006《葡萄酒》、GB 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》與OIV標準葡萄酒重金屬污染物的限量值。

表1 葡萄中農藥殘留限量表Table 1 Limits of pesticide residues in grapes

表2 葡萄酒重金屬污染物限量Table 2 Heavy metal contaminant limits for wine

金屬濃度是影響葡萄酒消費和保存的一個重要參數,對葡萄酒的品質有著正面或負面影響。適量的金屬濃度可以去除酒中的異味,過量則會影響葡萄酒的品質和健康[22]。所以葡萄酒中某些金屬離子必須維持在一定的濃度水平。例如,酒精正常發酵需要低濃度的鋅,而過量的鐵、鈣、銅和錳等會影響葡萄酒的口感、產生沉淀,例如鐵過量會造成“藍色破敗病”或“白色破敗病”[3]。并且,有害重金屬在人體內攝入過量或累積會嚴重危害人體健康。例如鉛會影響亞鐵血紅素的產生、傷害腦細胞,導致癌變和突變[3],對鎘元素長期接觸會對腎臟有損傷,還會引起骨質疏松等癥狀,如果是孕婦,還會對胎兒造成不良的圍產期效應[23]。

2.2 重金屬的檢測及去除方法

原子吸收光譜法、原子發射光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法和離子色譜是常用的金屬分析方法[22],TUZEN等[24]采用色譜吸附劑108固相微萃取-火焰原子吸收光譜法測定葡萄酒中的金屬離子,方便,成本低,較富集痕量金屬離子的方法快速;色譜吸附劑108的再利用率高達200個循環以上;該方法的分析性能與其他預濃縮方法相當,且適用于大體積樣本金屬離子的富集,容易洗脫。此外,還有伏安法[25]、傳感器法[26]和熒光法[27]等。

葡萄酒中金屬離子的去除主要通過加工過程加入離子交換樹脂、碳酸鎂和碳酸鈣等來降低某些金屬離子的含量。PALACIOS等[28]研究了選擇性離子交換樹脂技術作為“藍色澄清”技術的一種替代技術應用于去除雪莉酒中的金屬離子,實驗結果證明,離子交換技術比“藍色澄清”技術穩定性好,更經濟、更有效,可以大幅減少金屬離子的含量,有利于品質的保持和加工方式的改進。BORNET等[29]研究發現真菌源殼聚糖、幾丁質、幾丁質葡聚糖和幾丁質葡聚糖水解產物可以降低金屬離子含量,并對其毒性進行了研究,為其在金屬離子去除中的應用提供了理論支撐。此外,以下措施也可以減少金屬含量合理選擇葡萄園址,正確使用農藥化肥,盡量選用有機肥,適當進行土壤改良;選用優質設備和包裝,避免加工過程金屬的混入;加強培訓,增強生產者的安全責任意識等。

3 鹵代芳香族有機物

芳香族有機物中一個或多個官能團被鹵素原子取代而形成的新有機物就是鹵代芳香族有機物,這些物質結構穩定,不易分解,可以通過日常接觸進入人體,危害人的身體健康。

3.1 鹵代芳香族有機物污染的來源和危害

葡萄酒中的鹵代芳香族有機物污染經常是由生產過程的污染引起的,也可能由設備、添加劑、加工助劑引起。葡萄酒中鹵代芳香族有機物污染主要為木材來源和水來源。木材來源主要是指鹵代苯酚因其殺滅生物的性能而被廣泛用作木材防腐劑,葡萄酒陳釀過程中所用的橡木桶或是其他木制品通常會使用鹵代苯酚做防腐處理,所以鹵代苯酚例如2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-trichlorophenol,TCP)和TCP的溴化等價物2,4,6-三溴苯酚(2,4,6-tribromophenol,TBP)也是常見的污染物。除木材防腐作用外,軟木塞漂白(即次氯酸鹽洗滌)也是TCP的常見來源,但是目前多數軟木塞制造商也已經不再采用這個方法。水來源主要是指葡萄酒生產用水所帶來的鹵代有機物。葡萄酒生產過程中的水,無論是直接接觸的水,或是間接接觸的水都必須是生活飲用水,這些水通常都需要進行消毒處理。氯化消毒法由于其效率高、成本低,已經廣泛用于水的消毒中,然而氯化消毒法所用的消毒劑在消毒過程中會與水中有機物與Br-和I-等發生反應,從而形成一系列鹵代消毒副產物(disinfection byproducts,DBPs)[30-31]。這些鹵代消毒副產物有些已經被監管,而有些還未被監管。目前水中報道的鹵代芳香族有鹵代硝基酚、鹵代酚、鹵代羥基苯甲酸、鹵代羥基苯甲醛和最近新發現的鹵羥基苯甲腈等。在葡萄酒的生產過程中,木材和水源都是不可缺少的部分,如果木材和水源質量不達標,葡萄酒就極有可能發生鹵代有機物物污染。

鹵代有機物尤其是鹵代芳香族有機物對人體危害極大,這些物質大部分可以被人體吸收并累積,引發膀胱癌[32],免疫功能障礙。這些物質很多都具有遺傳毒性[5],還可能導致胎兒先天性心血管疾病[33-34]和小于胎齡兒出生的幾率上升等。除引發疾病外,TCP這種鹵代產物還可以作為三氯苯甲醚的前體[2],經過微生物甲基化作用后就可以轉化為三氯苯甲醚污染葡萄酒的香氣。

3.2 鹵代芳香族有機物的檢測和去除方法

鹵代芳香族有機物的檢測可以采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)、超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀(UPLC-QqQ-MS/MS)等方法,其中越來越多DBPs被檢測出,LI等[31]用磁性固相萃取與UHPLC-MS/MS結合的方式測得了水的消毒副產物中11種新興的鹵代芳香族有機物,FANG等[35]設計了一種基于銀納米棱鏡改性的自調控熒光探針對DBPs進行檢測等。除對水源的檢測外,李昕穎[36]也直接對葡萄酒中的鹵代芳香族有機物進行了檢測,用頂空固相微萃取-氣相色譜串聯質譜(HS-SPME-GC-MS/MS)共檢測出9種鹵代苯甲醚與鹵代苯酚。

鹵代芳香族有機物主要是通過水源和木材進入葡萄酒,所以最有效的方式就是解決木材和水源的污染問題,木材目前主要靠自然降解,更好的方式是選擇品質優良木材供應商。水源中去除方式包括使用生物炭進行吸附[37]和膜過濾[38],例如微濾、超濾、納濾、反滲透等膜過濾方式,或是使用強氧化劑[39-40](例如臭氧、過氧化氫)等方式氧化處理。

4 結論與展望

盡管相關的檢測技術和安全標準在不斷完善與更新,但目前還是缺乏經濟、簡便、準確、及時高效的檢測方法,不利于對葡萄酒中的有害物質進行及時精準的監測;同時國內缺乏相應的標準體系,規范不足加上生產者安全知識匱乏及利益至上的生產方式,使得葡萄酒的質量安全狀況不容樂觀,造成各生產企業產品良莠不齊。所以,葡萄酒中有害物質的檢測及防控亟待得到重視和改善?；诖?本文主要對葡萄酒中常見的3種非生物代謝來源危害進行了闡釋和歸納并提出了檢測與預防措施(見表3),這些危害主要來源于原料、釀造和陳釀過程。防控危害也應從葡萄園管理出發,嚴格把控原料品質,嚴格控制整個釀造和陳釀過程;并加快完善葡萄酒相關的限量標準及檢測技術,為葡萄酒質量安全的全產業鏈防治提供較為系統、全面的標準規范和技術支持,以釀造出優質健康的葡萄酒,推動我國葡萄酒產業長足健康發展。

表3 葡萄酒中非生物代謝來源有害物質的 來源及檢測方法Table 3 Sources of chemically harmful substances in wine and methods of detection