基于TLR4/NF-κB信號通路探究壯藥雙路通腦方對缺血性腦卒中大鼠腸組織損傷及腸道菌群的影響

翟陽 莫雪妮 鄭光珊 王凱華 胡躍強 鄒敏 梅小平 舒建龍 馬威 謝婷婷

(1廣西國際壯醫醫院腦病科,廣西 南寧 530200;2廣西中醫藥大學;3廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科)

缺血性腦卒中發生由腦動脈閉塞引起,血流量的驟減導致氧氣和能量衰竭,通過級聯反應導致神經炎癥和腦損傷,且伴隨全身性免疫反應〔1〕。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號通路與腦缺血等的神經炎癥密切相關,缺血區域壞死的腦細胞會刺激TLR4受體活化,并促進下游NF-κB入核活化,引起炎癥因子釋放,進一步加重神經損傷〔2,3〕。而阻斷TLR4/NF-κB信號傳導能顯著減輕腦缺血引起的組織損傷〔4〕。

缺血性腦卒中可引起腸道菌群構成改變,破壞腸道屏障結構,激活腸道免疫反應,引起全身性免疫反應〔5〕。而腸道菌群紊亂又能通過腸-腦軸加重神經炎癥,進一步促進缺血性腦卒中病情進展〔6〕。另外,有益的腸道菌群還能通過調節T細胞免疫、釋放短鏈脂肪酸(SCFA)等調節膠質細胞和神經元等生長和存活,減輕神經炎癥程度和神經元損傷,有利于腦卒中后的恢復〔7〕。然而,除糞菌移植外,目前尚無其他療法通過重塑腸道菌群實現對缺血性腦卒中的治療。

雙路通腦方(STP)為廣西國際壯醫醫院基于壯藥壯飲通自主研發的復方制劑,在院內用于缺血性腦卒中的治療,臨床效果顯著〔8〕。然而其對缺血性腦卒中的治療作用是否與腸道菌群相關,且其對TLR4/NF-κB信號通路的影響均不明確。本研究給予缺血性腦卒中大鼠STP治療,觀察其對大鼠腸道菌群、腸組織損傷及腦TLR4/NF-κB通路的影響,以探討其治療缺血性腦卒中的作用機制。

1 材料和方法

1.1動物 50只雄性SD大鼠,SPF級,體質量200～230 g,購自北京維通利華公司,許可證號:SCXK(京)-2016-0011。實驗大鼠統一在12 h光/暗周期、溫濕度恒定的標準動物房中由專人飼養,保證進食和飲水自由。

1.2主要試劑和儀器 STP顆粒由扶芳藤、桂枝尖、蒼術、法半夏、茯苓、南山楂、田七、陳皮、黃花倒水蓮、肉蓯蓉、火麻仁、生姜、炙甘草組成(廣西國際壯醫醫院自制)。腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、干擾素(INF)-γ試劑盒(上海生工生物公司);閉合蛋白(Claudin)-1、密封蛋白(Occludin)、TLR4、髓樣細胞分化因子(MyD)88、p-NF-κB p65(Ser 536)、NF-κB p65、p-核因子κB抑制蛋白(IκB)、IκB(CST公司);緊密連接蛋白(ZO)-1、GAPDH、羊抗兔或小鼠IgG二抗(Abcam公司);Quant-iTTMdsDNA分析試劑盒(Invitrogen公司);瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen公司);糞便DNA提取試劑盒(天根生化科技公司);DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(New England BioLab公司);分光光度計(Thermo公司);顯微鏡、超薄切片機(Leica公司)等。

1.3缺血性腦卒中模型的制備〔9〕SD大鼠稱重后,用2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉,麻醉后固定(仰臥位)在大鼠板上。將頸部中線皮膚切開,暴露左頸總動脈(CCA),并進一步分離頸內(ICA)、外動脈(ECA)。用4號尼龍線將CCA和ECA的近心端系緊,并在遠心端穿上尼龍線。接著,在距與CCA與ICA分叉點約5 mm處對CCA做一個“V”字切口,將尼龍絲線(直徑0.26 mm)從切口插入ICA約18 mm,維持2 h,以阻斷腦中動脈血流,實現腦缺血。2 h后小心抽出尼龍絲線,認真縫合傷口。造模成功標準:清醒狀態下大鼠的Zea Longa評分為1～3分。假手術(S)組僅進行暴露動脈的操作,不阻塞腦動脈血流。

1.4分組和給藥 造模成功的IS大鼠隨機分為低(7.16 g/kg)、中(14.33 g/kg)、高(28.66 g/kg)劑量STP組和模型(M)組,各10只。同時取10只大鼠為S組。根據STP臨床成人劑量和人與動物體表面積等效計算法,得到大鼠的等效劑量為14.33 g/kg作為中劑量組的劑量,給藥前將STP顆粒在溫無菌水中充分溶解。在制作模型前30 min予以相應劑量壯藥STP顆粒溶液灌胃,在大鼠成模清醒后1 h給予該顆粒灌胃,連續6 d,每天上、下午各1次。M組和S組同步灌胃無菌水。

1.5樣本采集 各組大鼠,麻醉后通過頸總動脈取5 ml血液(n=10),處死大鼠并迅速在超凈臺中取結腸內容物進行腸道微生物群分析(n=10)。接著,每組隨機選5只取結腸組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Western印跡檢測,取缺血側腦組織進行Western印跡檢測。剩下5只大鼠測量腦梗死體積。

1.6腦梗死體積測量 麻醉大鼠后斷頭取腦,洗凈后放入腦模具中,以視交叉為起點,冠狀位等距切出6片2 mm的腦片。置于2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中避光孵育30 min,時間進行一半時翻轉1次切片,以保證切片均勻染色,再將腦片轉移至4%多聚甲醛中固定,拍照。紅色為正常腦組織,白色為梗死組織。使用ImageJ軟件測量計算腦梗死比例。腦梗死比例(%)=缺血側梗死腦組織面積/對側大腦組織面積×100%。

1.7血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平檢測 將血液樣品離心收集上清,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平。

1.8Western印跡檢測 將腦組織或結腸組織轉移至RIPA裂解液中制作勻漿液,離心后將上清分裝至1.5 ml離心管中,即為總蛋白。測定濃度后,各組取20 μg腦組織或結腸組織蛋白與上樣緩沖液煮沸后,上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),恒壓電泳分離。電泳結束后切膠,恒流轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜浸泡在5%脫脂奶粉中搖床孵育1 h,轉移至一抗(GAPDH、ZO-1、Occludin、Claudin-1、TLR4、MyD88、p-IκB、IκB、p-NF-κB p65、NF-κB)稀釋液中搖床孵育1夜,第2日轉移至二抗稀釋液中搖床孵育1 h,隨后轉移至現配的ECL化學發光液中顯影,在蛋白凝膠成像儀上曝光、拍照并分析條帶灰度值。

1.9HE染色 將結腸組織固定后制作石蠟切片(4 mm/片),脫蠟、至水后分別放在蘇木素、伊紅染液中染色3 min,沖洗干凈、脫水、透明、封片,在顯微鏡下拍照分析。

1.10微生物群DNA測序及分析 用糞便DNA提取試劑盒提取結腸內容物中微生物的總DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所提DNA的完整性。使用Quant-iTTMdsDNA分析試劑盒對細菌16 S rRNA V3-V4區序列進行擴增反應,正向引物:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;反向:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。隨后回收擴增產物,使用DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒構建文庫,并使用Illumina MiSeq PE300測序平臺進行高通量測序(由上海美吉生物公司完成)。按照97%的相似度對測序所得序列進行OTUs聚類分析和物種注釋,并基于OTUs聚類結果分析腸道菌群的構成。

1.11統計學處理 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1STP對腦梗死比例的影響 與S組〔(0.00±0.00)%〕比較,M組腦梗死比例〔(15.61±2.59)%〕顯著增加(P<0.05);與M組比較,中、高劑量STP組腦梗死比例〔(11.72±1.96%)%、(9.48±1.65)%〕顯著降低(P<0.05),低劑量STP組〔(13.58±2.14)%〕無明顯變化(P>0.05);高劑量STP組最低,后續以28.66 g/kg STP進行研究,見圖1。

1～5:S組、M組、低劑量STP組、中劑量STP組、高劑量STP組

2.2STP對血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平的影響 與S組相比,M組血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平顯著較高(P<0.05);與M組相比,STP組血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平顯著較低(P<0.05),見表1。

表1 3組TNF-α、IL-6、INF-γ水平比較

2.3STP對腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響 與S組相比,M組腦TLR4、MyD88蛋白表達及p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著較高(P<0.05);與M組相比,STP組腦TLR4、MyD88蛋白表達及p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著較低(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測各組TLR4/NF-κB通路蛋白表達

2.4STP對結腸組織結構的影響 S組結腸黏膜完整連續,上皮細胞緊密、整齊排列,杯狀細胞豐富,沒有炎性細胞浸潤。與S組相比,M組結腸黏膜部分破裂,上皮細胞分布疏松、不連續,杯狀細胞形態變異、數量較少,伴有較多炎性細胞浸潤。與M組相比,STP組結膜連續性及上皮細胞分布均有所恢復,杯狀細胞形態和數量趨于S組,僅少量炎性細胞浸潤,見圖3。

圖3 3組結腸組織結構(HE染色,×100)

2.5STP對結腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表達的影響 與S組相比,M組結腸ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平顯著較低(P<0.05);與M組相比,STP組結腸ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平顯著較高(P<0.05),見表2、圖4。

表2 3組TLR4/NF-κB通路蛋白、ZO-1、Occludin、Clauclin蛋白水平比較

圖4 Western印跡檢測ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平

2.6STP對腸道菌群的影響

2.6.1菌群多樣性 M組香農多樣性(Shannon)、辛普森多樣性(Simpson)、物種多樣性(Observed species)和Chao1指數均較S組顯著降低(P<0.05);STP組Shannon、Simpson、Observed species和Chao1指數均較M組顯著升高(P<0.05)。S組、M組和STP組菌群覆蓋度(Goods coverage)指數均高于0.98,表明本研究的測序覆蓋率較高,見表3。

表3 3組Shannon、Simpson、Observed species、Chao1及Goods coverage指數比較

2.6.2菌門相對豐度的差異性 與S組相比,M組厚壁菌門豐度顯著升高,而擬桿菌門顯著降低,厚壁菌門與擬桿菌門的比值(F/B)顯著較高(P<0.05);與M組相比,STP組厚壁菌門豐度顯著降低,而擬桿菌門顯著上升,F/B值顯著降低(P<0.05),見表4。

表4 3組各菌門相對豐度及F/B值比較

2.6.3菌屬相對豐度的差異性 與S組相比,M組瘤球菌屬、擬桿菌屬、異桿菌屬、艾克曼菌屬豐度明顯較高(P<0.05),雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、羅姆布茨菌屬、梭菌屬豐度明顯較低(P<0.05)。與M組相比,STP組雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬、瘤球菌屬和異桿菌屬豐度顯著上調,艾克曼菌屬豐度顯著下調(P<0.05),見表5。

表5 3組優勢屬菌群相對豐度的比較

3 討 論

缺血性腦卒中發生時,血流的突然中斷會導致缺血區域神經元壞死或死亡,并導致臨近區域發生血流減少、神經元萎縮變性等繼發損傷,表現為腦梗死〔10〕。本研究表明,STP為治療缺血性腦卒中的有效方劑,STP可改善缺血性腦卒中大鼠全身性炎癥免疫反應,但其機制不明。缺血腦組織易產生大量炎癥因子,這些炎癥因子和壞死的腦細胞能激活TLR4,進一步通過MyD88將損傷信號傳遞至細胞內的核因子κB抑制物激酶(IKK),進而催化IκB磷酸化并使其與NF-κB解離,游離出來的p-NF-κB被活化,并在核定位序列的引導下進入細胞核,結合并啟動細胞核內靶基因的轉錄和表達〔11,12〕。NF-κB的激活可導致TNF-α等的合成和釋放,招募更多的免疫細胞向損傷部位聚集,增強神經中樞甚至全身的炎癥免疫反應,進一步加重腦損傷〔13〕。本研究提示,STP的抗炎作用可能與抑制TLR4/NF-κB通路活化有關。

缺血引起的腦組織損傷及隨后的修復過程,均涉及局部和全身性的炎癥免疫反應參與〔14〕,因此,免疫調節可能是治療腦卒中的新策略。腸道菌群作為腸道免疫系統的重要組成部分,可通過調節糖脂代謝,分泌蛋白、多肽、短鏈脂肪酸等調節機體的免疫反應〔15〕。缺血性腦卒中可導致腸道菌群失調,破壞腸道屏障,增加腸道通透性,促進腸黏膜免疫系統活化,釋放炎癥因子〔5,6,16〕;而腸道菌群紊亂也可通過“腸道菌群-腸-腦”軸促進腦卒中進展〔7〕。本研究表明,腦卒中可造成腸損傷和腸道菌群紊亂。而STP可恢復腸道菌群的多樣性并減輕腸損傷。據報道〔17〕,F/B值增高會加重腦卒中小鼠的全身炎癥和神經損傷程度。本研究提示,STP可有效降低F/B值,可能有利于減輕腦卒中后炎癥反應。

腸道環境改變能引起腸道菌群改變及代謝紊亂,在炎癥性腸道中,艾克曼菌的豐度與IL-6等促炎因子的含量同步增加,雙歧桿菌干預則可有效減輕腸道炎癥〔18,19〕。Chen等〔20〕發現,腦缺血猴腸道中擬桿菌屬豐度增高,乳桿菌屬豐度降低,伴隨外周血中IFN-γ等炎癥因子含量增高。研究已證實,外源性補充雙歧桿菌、乳桿菌有助于減輕神經炎癥、改善認知功能〔21〕。本研究STP干預下調了艾克曼菌屬等促炎菌屬的豐度,上調了雙歧桿菌屬等抗炎菌屬的豐度,有利于減輕腸道免疫反應,進而通過腸-腦軸調節大腦微環境。另外,瘤胃球菌屬、異桿菌屬、艾克曼菌屬、擬桿菌屬等還可釋放丁酸、丙酸等短鏈脂肪酸(SCFA)代謝物,而SCFA可進入腦組織,促進腦內神經營養因子的合成,有利于神經元及其他神經細胞的存活,減輕腦卒中相關損傷〔22〕。本研究結果提示,STP可能通過重塑腸道菌群,恢復腸道屏障,調節腸道免疫反應,抑制TLR4/NF-κB通路活化,減輕腦卒中后大腦及全身的炎癥反應。