環狀RNA在急性缺血性腦卒中發生發展中的調控機制

郭舒琪 于志君 陳潤吉 姜愛華 晏丹 袁瓊

(武漢科技大學醫學院新藥創制研究所 職業危害識別與控制湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430065)

缺血性腦卒中(IS)是導致死亡和殘疾的主要原因之一,其病理機制復雜,涉及能量代謝障礙、氧化應激損傷、炎癥反應、細胞內鈣超載、自噬、血腦屏障破壞、細胞凋亡等〔1〕。近年來隨著測序技術和生物信息技術的飛速發展,缺血性腦卒中發病機制研究不斷深入,環狀RNA(circRNA)在IS發生、發展及預后修復中發揮著重要的作用。本文主要從circRNA概述、circRNA與IS相關性及circRNA作為競爭性內源RNA(ceRNA)在急性IS發生發展中的調控機制進行綜述。

1 circRNA概述

circRNA是一類經過反向剪接,通過上、下游剪接位點以共價連接閉合形成環狀結構的內源性單鏈非編碼RNA〔2〕。與普通線性RNA相比,因缺少5'帽子及3'polyA 尾,可有效抵抗RNA外切酶的降解,因此穩定、廣泛的分布在不同組織、細胞中,具有典型的組織特異性、細胞特異性〔3〕和時空特異性等特點〔4〕。 circRNA可根據剪接來源不同,分為外顯子衍生的circRNA(ecircRNAs)、內含子衍生的circRNA(ciRNAs)和外顯子-內含子衍生的circRNA(EIciRNA)〔5〕3類,其中外顯子衍生的 circRNA 最為豐富。研究發現,大多數circRNA 定位于細胞質,少數circRNA 定位于細胞核內,他們可通過調節可變剪接、充當 microRNA(miRNA)海綿、隔離功能蛋白甚至編碼蛋白等方式,在轉錄、轉錄后和翻譯水平等多層面調控基因表達,參與重要病理生理進程〔3,6〕。circRNA的異常表達在腫瘤〔7〕、神經系統疾病〔8〕、心血管疾病〔9〕、糖尿病(DM)〔10,11〕等多種疾病的發生、發展中起關鍵的調解作用,目前circRNA已經成為疾病早期診斷、預后預測和靶向治療研究的新熱點。

2 circRNA異常表達與IS相關性

腦組織中存在大量特異性表達的circRNA,它們的存在與大腦發育、神經遞質功能、神經元成熟和突觸活動等密切相關〔8〕。越來越多的研究〔12～22〕發現,在IS細胞和動物模型及患者血樣中存在circRNA異常表達,見表1。且其異常表達與IS發生、發展及預后密切相關。Lin等〔12〕對氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)的 HT22細胞進行微陣列芯片檢測發現,15個circRNA 發生2倍以上的顯著改變。Liu等〔13〕采用高通量測序技術對OGD/R處理的大鼠腦微血管內皮細胞(BMECs)中circRNA的表達進行檢測,發現1 288個circRNA發生差異性改變,其中211 個上調和 326 個下調,功能富集分析表明circRNA異常表達與鈣離子相關通路和環狀鳥苷 3′,5′-單磷酸依賴性蛋白激酶信號通路相關。局灶性大腦中動脈阻塞/再灌注(MCAO/R)動物模型檢測結果也發現circRNA存在不同程度的改變。腦缺血90 min再灌注6、12、24 h的缺血半影區有283個circRNA至少在一個再灌注時間點發生2倍以上的改變,其中16 個circRNA在所有時間點都發生改變〔16〕。急性IS患者血樣檢測中同樣發現了circRNA的異常表達。Dong 等〔20〕發現,患者外周血中有521個circRNA 發生差異性改變,異常表達的circRNA主要富集MAPK、炎癥、免疫等信號通路。Zuo等〔22〕對急性IS患者靜脈血進行基因芯片檢測,發現circFUNDC1,circPDS5B及circCDC14A表達顯著上調,其表達水平與腦梗死體積正相關。研究還發現,3種circRNA在預后好及差的患者中變化趨勢相反,于是推測他們可作為急性IS診斷及預后的生物標志物。隨著測序技術的發展,越來越多的circRNA被發現在IS的異常表達,然而,目前對測序結果的分析仍存在弊端,這主要由于樣本來源、測序方式、測序時間點及測序平臺不同,致使獲得的circRNA表達譜及可能參與的信號通路復雜、多樣,無統一標準。如果完善數據庫后能將細胞、動物以及患者血樣的檢測結果進行有效的結合,有望篩選出更多有價值的IS診斷標志物及功能靶標。

表1 circRNA在IS中異常表達

3 circRNA通過ceRNA機制調控IS損傷

3.1ceRNA調控機制 ceRNA機制是在各種RNA之間相互作用的一種全新的基因表達調控模式,主要指某些ncRNA,如長鏈非編碼 RNA(lncRNA)、假基因和circRNA,可作為 miRNA的海綿通過與miRNA 反應元件(MREs)競爭性結合,最終影響 miRNA的靶基因mRNA的表達及功能。以往研究揭示circRNA作為ceRNA可通過調控細胞增殖〔23,24〕、炎癥〔25〕、凋亡〔26,27〕、自噬〔28〕、血管新生〔29〕等病理生理進程參與多種疾病的發生發展。IS病理機制復雜,目前研究顯示,circRNA 作為ceRNA可通過影響神經元凋亡、自噬、氧化應激、炎癥及其他多種途徑參與急性IS病理生理進程。

3.2circRNA調控IS細胞凋亡 細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種方式,是腦卒中后的主要病理現象。研究表明腦缺血損傷后數小時或腦缺血再灌注后,缺血半影區主要以凋亡為主。抑制細胞凋亡對IS患者的預后有較大幫助,被認為是IS防治的最為重要的途徑。研究〔30～38〕顯示,大量的circRNA可通過ceRNA 機制促進或抑制IS引起的細胞凋亡過程,見表2。

表2 circRNA作為ceRNA調控細胞凋亡

Chen等〔30〕發現,在IS體內、外損傷模型中circUCK2表達顯著降低,過表達circUCK2可抑制miR-125b-5p活性,促進生長分化因子(GDF)11表達,從而激活下游轉化生長因子(TGF)-β/Smad3信號通路減少細胞損傷,提高細胞存活率,抑制細胞凋亡。最新研究發現〔33〕,circTLK1在小鼠MCAO/R損傷模型及OGD/R 處理的N2a細胞中表達上調。敲除circTLK1顯著減少梗死體積,改善神經功能。機制研究發現,敲低circTLK1 通過 miR-26a-5p/PTEN軸減輕OGD/R誘導的 N2a 細胞的凋亡,減輕神經元損傷。Xu等〔34〕在人腦BMECs缺氧處理后還發現,circPHC3高表達,敲低circPHC3抑制 OGD誘導的 BMECs細胞凋亡。進一步研究發現,circPHC3吸附miR-455-5p激活腫瘤壞死因子受體作用因子(TRAF)3,促進細胞死亡和凋亡。Dai等〔35〕也發現circHECTD1及TRAF3在OGD處理的HT22細胞及MCAO 小鼠中,表達上調,miR-133b表達下調。敲除circHECTD1可緩解OGD引起的HT22細胞死亡,改善MCAO小鼠腦梗死體積及神經元凋亡。下調circHECTD1可通過靶向miR-133b抑制TRAF3的表達,降低caspase-3和NF-κB活化,從而影響神經元凋亡。綜上,circPHC3和circHECTD1盡管靶向不同的miRNA,但均可通過調節TRAF3的表達來影響細胞凋亡?？梢?在ceRNA調控模式下不同circRNA還可通過吸附不同miRNA靶向調控同一或不同的mRNA在IS引起的細胞凋亡中發揮生物功能。

3.3circRNA調節IS細胞自噬 自噬是細胞組分的正常降解過程,是細胞中高度保守的分解代謝途徑,在維持內環境穩定中發揮重要作用〔39〕。研究發現,適度自噬可抵抗IS造成的缺血缺氧環境,維持存活狀態,但是過度自噬可導致細胞死亡〔40〕。隨著對IS circRNA研究的深入,越來越多的研究發現,circRNA作為ceRNA 參與了IS細胞自噬的調節。

Han等〔41〕發現,在IS小鼠模型和患者血漿中circHECTD1表達均顯著增加。敲低circHECTD1可顯著減少腦梗死面積,減輕神經元損傷,抑制星形膠質細胞的活化。機制研究發現,circHECTD1可作為miR-142海綿,抑制TCDD誘導多聚ADP核糖聚合酶(TIPARP) 的表達,促進自噬。Zhou等〔42〕研究發現,circ-0025984 和TET1蛋白在IS星形膠質細胞中表達顯著降低,miR-143-3p表達增加。抑制miR-143-3p 或過表達circ-0025984顯著降低星形膠質細胞凋亡和自噬,減輕腦損傷和神經元丟失。進一步研究發現,這種神經保護作用主要與定位于細胞質中的circ-0025984充當miR-143-3p的海綿,靶向上調TET1表達有關。上調的TET1轉位入核后,與ORP150啟動子結合,將5-甲基胞嘧啶(5mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),導致DNA去甲基化,引起ORP150表達增加,進而增加LC3-Ⅱ表達,激活自噬。Xu 等〔43〕發現,在小鼠MCAO/R模型中circAkap7表達下調,當外源性給與脂肪來源間充質干細胞修飾的circAkap7外泌體(exo-circAkap7)可減輕腦損傷。研究發現exo-circAkap7可作為ceRNA海綿吸附miR-155-5p,促進ATG12介導的自噬,抑制 NRF2 介導的氧化應激,減輕神經細胞損傷。這表明circAkap7至少可部分通過促進自噬發揮保護作用。與此研究相似,星形膠質細胞外泌體來源的circSHOC2,可吸附 miR-7670-3p,調節沉默信息調節因子(SIRT)1的表達,通過調節自噬,改善神經元損傷〔44〕。

3.4circRNA調節細胞器膜穩態 細胞質膜(PM)與內質網(ER)之間的動態平衡,對維持細胞的正常功能至關重要。PM/ER之間的非囊泡脂質轉移被認為在膜穩態維持中起主要作用〔45〕。 Shang等〔46〕發現,IS會打破PM和ER之間的脂質穩態,引起PM和ER之間的磷脂酰肌醇(PIs)和磷脂酰絲氨酸(PS)分布異常。其中ORP5 參與了PIs〔PI(4)P,PI(4,5)P2,PI(3,4,5)P3〕及PS在PM及ER的重新分配過程。進一步研究發現circRNA 0001449作為ceRNA通過競爭性結合miR-124-3p及 miR-32-5p,靶向調控氧固醇結合蛋白l5(Osbpl5)mRNA 的翻譯過程,促使ORP5 蛋白表達增加。上調的ORP5促進PI(4)P或PI(4,5)P2從PM到ER的轉運,從而消除了PM中PI(3,4,5)P3來源,進而減少PI(3,4,5)P3募集和AKT激活,最終加速細胞的損傷。因此認為 circRNA 0001449作為ceRNA 在IS PM及EM膜穩態的調節中起重要作用。

3.5circRNA多靶點、多通路調節血腦屏障(BBB)、炎癥、氧化應激等 circRNA作為ceRNA在IS發生發展中的作用并非單一的,越來越多的研究顯示,它可通過調節血腦屏障、炎癥、氧化應激、增殖分化等多通路、多靶點的發揮調節功能。

BBB是神經血管單元的重要組成部分,它控制血液和大腦之間各種生物物質的交換。 在急性IS時BBB完整性被破壞,滲透性增高,血液成分滲入大腦,引起血管源性腦水腫、顱內壓增高等一系列病理反應,損害正常的神經元。IS時,內皮-間質轉化導致BBB破壞,Bai等〔47〕發現,在急性IS患者和小鼠IS模型中,circDLGAP4表達下調,上調circDLGAP4可顯著抑制緊密連接蛋白和間充質細胞標志物表達,進而抑制內皮-間質轉化。機制研究發現,circDLGAP4可作為內源性 miR-143 海綿,靶向抑制E6-APC末端結構域E3泛素蛋白連接酶(HECTD)1功能,通過調節BBB完整性相關的內皮-間質轉化發揮保護作用。與此研究相似,Qiu 等〔48〕在OGD處理的HCN2細胞中也發現circDLGAP4表達下調。過表達circDLGAP4 可充當miR-503-3p 的海綿,促進神經生長調節因子(NEGR)1 mRNA及蛋白表達,增加細胞存活率,抑制細胞死亡和炎癥反應,發揮保護作用?？梢奵ircRNA的作用可以是多靶點的,即同一circRNA可吸附不同miRNA發揮不同的生物功能。見表3。

表3 通過多通路、多靶點參與調控的circRNA

另外,Ren等〔49〕研究表明,circ-Memo1、SOS1在IS患者外周血及缺氧/復氧處理的人腦微血管內皮細胞(HBMEC)中表達上調,miR-17-5p表達下調。沉默circ-Memo1可通過調節miR-17-5p/SOS1軸促進了細胞活力,抑制了ERK/NF-κB信號通路的激活,減少了氧化應激和炎癥反應,并抑制了細胞凋亡,減輕缺氧/復氧引起的HBMEC細胞損傷。Yang等〔50〕研究發現,在OGD誘導的HBMEC細胞中,過表達circPHKA2可通過miR-574-5p/超氧化物歧化酶(SOD)2軸,促進增殖、遷移、血管新生,抑制凋亡、氧化應激、ER應激等減輕OGD誘導的HBMEC損傷,發揮保護作用。因此,circRNA發揮作用的途徑還可以是多通路的,即同一circRNA可通過調節增殖、氧化應激、炎癥等多個通路發揮生物功能。綜上,circRNA作為ceRNA通過多靶點、多通路在IS的病理進程中發揮著十分重要的作用,這為其治療指明了新的研究方向。

TLR4:Toll樣受體4

4 展 望

大量的研究發現,circRNA不再是轉錄副產物,它可作為IS診斷標志物和分子靶點在疾病的發生、發展及預后發揮重要的生物功能。circRNA的ceRNA機制在IS的作用不是孤立的,它可以通過多靶點、多通路、多機制參與疾病發生發展的病理進程,從而為IS的診斷、治療及藥物研發提供重要理論依據。目前IS circRNA還有大量的circRNA有待發現,更多重要的機制有待進一步挖掘。