發酵稻殼通過增強氮代謝途徑影響煙草幼苗的生長發育

張 斌,袁志輝,彭陸軍,周向平,周德英,王錫春,*

(1.湖南科技學院 湖南省銀杏工程技術研究中心,湖南 永州425199; 2.永州市思源農業科技有限公司,湖南 永州 425000; 3.湖南省煙草公司永州市公司,湖南 永州425000)

育苗是煙葉生產的重要環節,而漂浮育苗是當前我國育苗的主要方式之一[1]。煙草漂浮育苗技術的應用促進了煙草育苗工廠化。炭化稻殼具有容重小、質量輕、孔隙度高、通氣性好和保水力強等優點,目前已成為煙草漂浮育苗基質的主要成分[2],僅永州市每年就需要5 000 m3。然而,制備炭化稻殼的煅燒過程中會產生大量煙霧,近來引起了環保部門關注,因此,尋找煙草漂浮育苗基質中炭化稻殼的替代物成為集約化煙草育苗急需解決的問題。近年來,我國各大煙區開展了一些利用農業廢棄物開發漂浮育苗基質的研究,如蔗渣[3]、花生糠[4]、藥渣[5]等,并取得到了較好的效果,但由于原料的產地限制難以進行大面積推廣。

稻殼的主要成分為纖維素、木質素和硅[6],對離子具有良好的吸附能力[7],它能夠提高土壤透氣性,具有改良土壤結構的功能。我國稻殼資源豐富,取材方便,卻未得到充分利用[8]。稻殼發酵后可消除致病菌,且含有豐富的有機質和礦質元素,理論上可以作為育苗基質,有較大的推廣價值。陳雪嬌等[9]對稻殼和油枯進行發酵,認為添加40%磷石膏的基質更適合用于作物栽培;于艷輝等[10]研究表明,發酵后稻殼營養元素含量變化不明顯;尚秀華等[11]研究表明,稻殼經過腐熟處理后容重和持水量等理化性能有所改良,其有機物得到不同程度的降解;韓道杰等[12]研究了基質中發酵稻殼添加量對西瓜幼苗生長的影響,發現添加50%(體積分數)的發酵稻殼可達到優秀基質的標準;謝曉梅等[13]研究表明,發酵稻殼對Fe2+和S2-具有較好的吸附能力和環境適應性,吸附態Fe2+和S2-穩定性好,不易再釋放;徐經年等[14]研究表明,發酵稻殼、高溫消毒熟土和膨化珍珠巖按體積比6.0∶2.5∶1.5混合制成的基質可以替代煙漂浮育苗的商品基質;徐昱松等[15]研究表明,腐熟稻殼、蛭石和珍珠巖體積比為6∶2∶2時適宜黃瓜育苗。雖然周德英等[16]研究發現,含40%(體積分數)發酵稻殼的基質對煙苗生長具有促進效果,但是,有關發酵稻殼對煙苗生長發育影響的相關分子機理研究還鮮有報道。本研究以發酵稻殼為材料,對煙苗生長發育與相關生理指標進行了測定,對相關代謝途徑進行分析,鑒定了代謝通路中的關鍵基因,并對其進行了驗證,研究結果可為發酵稻殼的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試供煙草品種為湘煙7號;發酵助劑由永州市煙葉生產技術中心提供;發酵稻殼為自制,將稻殼、尿素、玉米粉、發酵助劑按質量比1 000∶5∶5∶4配制發酵液,稻殼粉碎后過3目篩,摻水達60%后拌勻發酵液,用塑料膜覆蓋,堆垛發酵30 d,其間翻堆3次,待稻殼呈棕褐色即可。漂浮育苗基質由永州市思源農業科技有限公司按照表1生產。

表1 基質組成

1.2 試驗設計

試驗于2021年12月至2022年3月在湖南省煙草公司永州公司技術中心基地玻璃鋼架育苗棚內進行,共設置6個處理(基質配方見表1),每個處理設3次重復,每個重復1個育苗盤(100孔穴),每穴基質用量為10 cm3。將飽滿種子在室溫浸泡4 h后播種至育苗盤(每孔穴1粒),漂浮育苗。除栽培基質外進行常規管理,其他環境條件保持一致。

1.3 測定指標與方法

栽培60 d后,參照YC/T142─2010《煙草農藝性狀調查測量方法》的方法,每個處理隨機取15株苗,測量株高、根長、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重。株高為幼苗根部至主莖頂點的距離,根長為最長根的長度,用0～10 cm的直尺測量。莖粗為栽培基質處莖的直徑,用游標卡尺測量。幼苗洗凈吸干水分后測量地上部鮮重和地下部鮮重;120 ℃烘干至質量不變,用萬分之一電子天平測量地上部干重和地下部干重。根冠比=根鮮重/地上部分鮮重;壯苗指數=(莖粗/株高+根干重/地上部干重)×全株干重。按照試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量;采用中晶科技掃描儀(MRS-9600TFU2L)測定根系指標。按照硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒和亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測試劑盒說明書(合肥萊爾生物科技有限公司)測定NR和NiR活性;在連續流動分析儀上測定根系總氮含量。

1.4 轉錄組測序和分析

1.4.1 樣品處理

以CRH處理為對照,選擇FRH1處理進行轉錄組測序,每個處理設3次重復,每個重復隨機采集6株幼苗根系,快速混合均勻,標記為FRH1-1、FRH1-2、FRH1-3和CRH-1、CRH-2和CRH-3。用鋁箔紙包扎后放入液氮,送北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序;剩余樣品保存在-80 ℃,測定SOD、CAT、NR和NiR活性,以及Pro、MDA和總氮含量。

1.4.2 測序和數據分析

使用百邁客云平臺提供的分析流程分析測序后的數據。參考基因組為(Nicotiana_tabacum.Ntab_K326),采用HISAT 2.0軟件進行序列比對?；虮磉_量采用FPKM值,用DEseq 2軟件篩選顯著差異表達基因,參數設定為差異倍數|log2(fold-change)|≥1.5且Pvalue≤0.05。利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行顯著差異表達基因功能注釋。

1.4.3 關鍵基因qRT-PCR驗證

采用試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)提取剩余樣品RNA,并反轉錄成cDNA,進行qRT-PCR檢測。在NCBI網站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)設計基因特異引物,內參基因為β微管蛋白基因(基因ID為gene_1665)(表2),在美國伯樂CFXConnect上進行擴增。反應體系10 μL:上下游引物各0.4 μL,1 μL cDNA,SYBR greenMix 5 μL,ddH2O 3.2 μL;反應程序:94 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,45個循環。每個樣品3次重復,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表2 qRT-PCR分析的基因與引物

1.5 數據分析

試驗數據采用Excel軟件(2019版)進行統計分析,用t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵稻殼對幼苗生長勢和形態指標的影響

不同處理煙草幼苗栽培60 d時的生長勢和形態指標見圖1。相同處理的煙草幼苗生長比較齊整,6個處理間整齊度差異不大,但FRH處理的煙草生長勢優于CRH處理(圖1-A);FRH處理的幼苗高度、根冠比和壯苗指數優于CRH處理。與CRH處理相比,FRH1、FRH2、FRH3、FRH4和FRH5處理的幼苗高度分別提高了51.7%、37.9%、34.5%、20.7%、31.0%,除FRH4的株高外,其他處理都顯著性高于CRH處理(圖1-B)。各處理中根冠比和壯苗指數排序為FRH1>FRH3>FRH4>FRH2>FRH5>CRH處理,FRH1和FRH3的根冠比和壯苗指數顯著大于CRH處理(圖1-C和圖1-D)。綜合比較,FRH1處理在株高、根冠比和壯苗指數方面優于其他處理。

A,生長勢。CRH,炭化稻殼;FRH,發酵稻殼。柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A, Growth potential. CRH, Carbonized rice husk; FRH, fermented rice husk. Bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.

2.2 發酵稻殼對幼苗一級側根和根系生理指標的影響

如表3所示,FRH1處理的煙草一級側根的數量、長度、直徑和表面積分別為292根、39.7 mm、0.066 mm和4.9 cm2,除直徑外,其他指標都顯著(P<0.05)高于CRH處理。與CRH處理相比,FRH1處理的煙草脯氨酸含量顯著下降33.5%,CAT和SOD活性分別顯著(P<0.05)上升13.6%和68.5%,根系MDA含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 轉錄組測序數據的質量

經過凈化和質量過濾后的轉錄組數據如表4所示,所有樣品堿基百分比(Q30)≥94.29%,GC含量不低于43.12%,測序質量較高。測序數據與參考基因組的比對率和單一比對率分別為95.29%～93.89%和93.21%～91.68%,比對質量比較高。

表4 轉錄組測序數據質量分析

2.4 樣本中基因表達一致性檢驗

主成分分析顯示,2個處理的特征向量分別為75.71%、15.46%和8.04%,不同處理之間具有一定的差異(圖2-A);相關性分析顯示,處理內樣本間相關系數r超過0.90,處理間相關系數低于0.20,樣本CRH-1、CRH-2和CRH-3聚在一起,FRH1-1、FRH1-2和FRH1-3聚在一起,說明處理內樣本間生物學重復的相關性較強,處理之間具有一定的差異(圖2-B)。

A,主成分分析圖;B樣品相關性分析圖。A, Principal component analysis chart; B, Sample correlation analysis chart.

2.5 顯著差異表達基因功能注釋、關鍵基因鑒定和驗證

對2個處理進行差異表達基因分析,共有476個顯著差異表達基因,其中311個基因表達上調、165個基因表達下調(圖3-A)。在KEGG數據庫中共鑒定出294個基因,它們參與20個代謝通路(圖3-B)。其中氮代謝途徑(ko00910)數據以鮮重計。

A,火山圖;B,KEGG富集分析。A, Volcano diagram; B, KEGG pathway enrichment analysis.

富集差異最顯著(Qvalue=2.01×10-8),含有12個基因;其次是戊糖和葡萄糖醛酸轉化途徑(ko00040)(Qvalue=0.004);參與異喹啉生物堿生物合成、酪氨酸代謝等代謝途徑的差異性也比較大。

在氮代謝途徑中6個硝酸鹽轉運蛋白基因、3個亞硝酸鹽還原酶基因、2個硝酸還原酶基因和1個谷氨酸脫氫酶基因獲得了顯著富集(表5)。RNA-Seq結果表明,下調表達基因FPKM比值的log2(fold-change)在-1.06～-1.89,上調表達基因FPKM比值的log2(fold-change)在0.60～1.16。qRT-PCR結果表明,關鍵基因的表達趨勢與測序結果基本一致,下調基因相對表達量比值(FRH1/CRH)為0.29～0.43,上調基因相對表達量比值(FRH1/CRH)為1.56～2.28?；騨ewGene_31743在2個處理中的相對表達量都比較高,而且CRH處理高于FRH1處理?；騨ewGene_21354、newGene_24233和newGene_26504的表達量在FRH1處理中高于CRH處理,其余基因表達量在FRH1處理中均低于CRH處理。

表5 氮代謝途徑差異基因表達水平

2.6 根系中硝酸還原酶活性、亞硝酸還原酶活性和總氮含量

由圖4可知,FRH1處理中煙苗根系硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性分別比CRH顯著提高8%和7%,煙苗根系氮含量提高1.7%,但未達到顯著差異。

圖4 根系硝酸還原酶活性、亞硝酸還原酶活性和總氮含量Fig.4 Nitrate reductase activity, nitrite reductase activity and total nitrogen content of root

3 討論

稻殼具有改良土壤結構的功能,我國稻殼資源豐富,卻未得到充分利用。本研究結果顯示,煙草漂浮育苗基質中用發酵稻殼替代炭化稻殼可增加幼苗一級側根的數量、長度和表面積,提高煙草幼苗株高、根冠比、生長勢和壯苗指數,還提高了幼苗根系的CAT和SOD活性,降低了脯氨酸的含量,這與已有研究結果一致[16]。稻殼深施土壤后可以降低土壤容重,提高土壤孔隙度和通透性能,增加土壤有機碳、速效氮、磷、鉀等的含量[17-18]。土壤理化性質的改變會影響微生物群落特征[19]。研究還表明,增施稻殼可以提高土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性,對煙草的生長發育有明顯的后發效應[20]。

土壤理化性狀對煙草碳氮代謝有很重要的影響[21-22],稻殼施入土壤后可以釋放氮素。FRH1和CRH處理共有476個顯著差異表達基因,其中294個在氮代謝途經得到顯著富集。張玉寧等[23]認為,氨基酸、碳氮代謝途徑是響應不同氮營養條件的重要代謝途徑。在氮代謝途經中挖掘到12個關鍵基因,其中6個為硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運體基因。高等植物有4類硝酸鹽轉運體家族負責硝酸鹽的吸收和轉運,除了負責轉運硝酸鹽外,還負責氨基酸、多肽、硫配糖體、生長素和脫落酸等轉運[24]。煙草硝酸鹽轉運家族基因存在多個成員,目前,主要對NRT1.1、NRT1.2、NRT2.1進行了功能研究[25]。此外,煙草硝酸鹽轉運蛋白NtNRT 1.7在非生物脅迫條件下參與硝酸鹽的再利用[26];NtNRT1.5基因在煙草氮素的吸收和轉運中發揮重要功能[27]。硝酸還原酶是植物氮同化和根系結構重塑的關鍵酶之一,在一氧化氮穩態中發揮作用[28-29],水稻硝酸還原酶基因OsNR2的等位基因可以提高水稻氮素利用效率和產量[30]。亞硝酸還原酶是一氧化氮介導翻譯后修飾的靶標[31],一氧化氮可以通過誘導水稻側根形成來提高氮吸收能力[32]。此外,12個關鍵基因中還含有2個硝酸還原酶基因、3個亞硝酸鹽還原酶基因和1個谷氨酸脫氫酶基因;與CRH處理相比,FRH1處理中根系硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性和氮含量上升。植物吸收的銨態氮可直接與有機物結合生成氨基酸或者其他含氮化合物,而硝態氮需經硝酸還原酶、亞硝酸還原酶和谷氨酸脫氫酶的催化作用才能形成含氮化合物[33]。凡聰等[34]研究表明,增施氮肥能提高煙葉硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和蔗糖轉化酶活性和總氮含量。綜上,筆者認為基質中發酵稻殼的降解,促進了煙草對氮素的吸收、轉運和同化,影響了幼苗的氮代謝途徑,從而促進煙苗生長。本研究的不足之處是缺少栽培基質中發酵稻殼的降解研究、各氮源轉運體如何相互協調發揮作用,以及12個關鍵基因的功能研究。

4 結論

用發酵稻殼替換漂浮育苗栽培基質中的炭化稻殼后,可以有效改善湘煙7號煙苗生長勢,幼苗株高、根冠比和壯苗指數更優,根系脯氨酸含量顯著降低,CAT和SOD活性顯著升高。294個顯著差異表達基因參與了氮代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化等20個KEGG代謝通路,并挖掘出參與氮代謝的12個關鍵基因。FRH1處理中煙苗根系硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性顯著高于CRH處理,氮含量無顯著差異。