亞致死劑量氰戊菊酯對家蠶生長發育的影響

俞瑞鮮,胡秀卿,柳新菊,湯 濤,吳 珉,吳聲敢,趙學平,*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所,浙江 杭州 310021; 2.農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室,浙江 杭州 310021)

在蠶繭生產季節,由于桑園周邊的農藥漂移、施藥設備農藥殘留或直接在桑園中進行害蟲防治,桑葉極易受到農藥污染[1]。近年來,隨著現代農業的發展,蠶區周邊經濟作物的大面積種植,農藥的使用頻率不斷增加,用藥種類也不斷增多。國內每年因桑園農藥使用不當或桑園周圍其他農作物使用農藥污染導致家蠶中毒的情況時有發生,嚴重影響蠶農的收入和蠶桑產業的發展[2-6]。如2018年廣西因桑園周邊柑橘園施用農藥導致大面積家蠶發生不同程度的不吐絲不結繭的情況,蠶農損失約1 000萬元[7]。因此,有關農藥對家蠶的研究也越來越受到重視,農藥對家蠶生長發育毒性的研究也逐漸成為了熱點。已有研究表明,隨著農藥的不斷攝入,低劑量的藥劑雖然不足以導致家蠶急性中毒,但對家蠶的發育歷期、眠蠶體重、化蛹率、全繭量、繭層量、繭層率、結繭率等方面均有不同程度的影響,且存在一定的劑量-效應關系[8-11]。

氰戊菊酯(fenvalerate)是擬除蟲菊酯類農藥的主要品種之一,因其高效、低毒、適用范圍廣,被廣泛用于棉花、果樹、蔬菜、大豆、小麥等作物的害蟲防治。研究表明,氰戊菊酯對魚類、蚯蚓等非靶標生物具有發育毒性、免疫毒性、神經毒性、生殖毒性,并能誘導產生氧化應激、細胞凋亡、DNA損傷以及組織病理學的改變[12-18]。近年來氰戊菊酯也被證實是一種潛在的環境污染物和內分泌干擾物,在人體和大部分的環境介質中均可檢出[19]。盡管已有研究表明,氰戊菊酯對家蠶具有較高的急性毒性,且持效期較長[20-21],但目前尚未明確其對家蠶生長發育的影響。隨著氰戊菊酯在農?；煸詤^的廣泛施用,可能通過水源、霧滴漂移、噴霧器械等途徑污染桑園。其污染濃度通常低于田間實際施用濃度,但隨著時間的推移家蠶仍然有可能接觸到亞致死濃度的氰戊菊酯。因此,本研究采用浸葉法測定了亞致死劑量氰戊菊酯對家蠶的生長發育影響,以闡明氰戊菊酯對家蠶的亞致死效應,以期為農?；煸詤^殺蟲劑的合理使用提供科學依據,確保蠶桑產業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶(Bombyxmori),品種為芙蓉、湘輝和皓月,由浙江省農業科學院蠶桑與茶葉研究所提供。用常規方法催青并飼養至2齡起蠶供試。桑樹品種為農桑12號,采自浙江省農業科學院蠶桑與茶葉研究所桑園,未接觸農藥。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:PL203-IC型電子天平[感量0.001 g,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司],MLR-351 H植物培養箱(日本三洋電機株式會社),JWS-A5溫濕度表(北京寶力馬傳感技術有限公司)。

試劑:90%氰戊菊酯原藥,杭州慶豐農化有限公司;分析純丙酮,永華化學股份有限公司;分析純吐溫-80,國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 急性毒性試驗

參照國家標準GB/T 31270.11—2014[22],采用“浸葉法”,選擇健康且大小一致的2齡起蠶進行試驗。先將氰戊菊酯原藥以丙酮為溶劑,配制成一定濃度的母液,冷藏備用。在預試明確有效濃度范圍的基礎上,將配制好的母液用含0.1%吐溫-80的水以等比級差稀釋至6個系列梯度濃度。將桑葉于不同濃度的藥液中浸漬10 s,取出在通風處懸掛自然晾干,然后將桑葉放入直徑15 cm的培養皿內供試。每個濃度重復3次,每重復20頭蠶,同時設計空白對照和助劑對照(以最高濃度組所含丙酮量一致的含0.1%吐溫-80的水處理)。處理后的家蠶置于溫度為24～26 ℃、相對濕度為70%～85%、光周期為16 L∶8 D的人工氣候箱內,觀察并記錄處理24、48、72和96 h后家蠶的中毒癥狀和死亡數。用鑷子輕觸蟲體不動作為判斷死亡的標準。對照組死亡率小于5%的試驗為有效試驗。

1.4 亞致死效應試驗

根據急性毒性試驗結果,選擇較為敏感的品種皓月用于亞致死效應試驗。按照氰戊菊酯96 h-LC50值的1/4、1/12、1/36、1/108、1/324設置5個試驗濃度(0.062 8、0.020 9、0.006 98、0.002 33和0.000 775 mg·L-1),采用“浸葉法”,選擇健康且大小一致的2齡起蠶進行氰戊菊酯對家蠶的亞致死效應試驗。參照1.3節的藥液處理方法配制各濃度藥液,將桑葉于不同濃度的藥液中浸漬10 s,取出在通風處懸掛自然晾干。每個濃度為1個處理,每處理3個重復,每重復15頭2齡起蠶,同時設計空白對照和助劑對照(以最高濃度組所含丙酮量一致的含0.1%吐溫80的水處理)。處理后的家蠶置于光周期16 h(L)∶8 h(D)、相對濕度70 %～85 %的人工氣候箱內微光飼養,直至上蔟結繭。2齡家蠶的飼養溫度為26 ℃～28 ℃,隨著齡期的增長,每一齡期的溫度降低1 ℃。家蠶上簇后移至人工氣候室中,溫度24 ℃,濕度75%,自然光偏暗均勻。

試驗期間,2～3齡蠶每2 d更換一次藥液處理的桑葉,4～5齡蠶每天更換有毒桑葉,持續飼喂至家蠶成熟,整個試驗飼養至結繭、化蛹為止。每天觀察并記錄家蠶的異常行為和死亡數,同時記錄各齡期家蠶的發育歷期和存活眠蠶體重。上蔟開始時統計上蔟的家蠶數,結繭后第8天稱取全繭量、繭層量、蛹重,統計良蛹數量,計算繭層率、死籠率和化蛹率;凡繭內的死蠶、死蛹、病蠶、病蛹、半蛻皮蛹(包住胸部或尾部2個以上環節)、不蛻皮蛹、尾部3個環節呈黑色的蛹和雖然健康但未化蛹的毛腳蠶,均記為死籠繭。

1.5 數據統計

用DPS 數據處理系統18.10 高級版計算氰戊菊酯對家蠶72 h和96 h的半致死濃度值(72 h-LC50和96 h-LC50)及其95%置信限,采用Duncan新復極差法對各個生物學指標進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 氰戊菊酯對3個不同品種家蠶的急性毒性

90%氰戊菊酯原藥對芙蓉、湘輝和皓月3個不同品種家蠶的急性毒性結果見表1。結果表明:90%氰戊菊酯原藥對皓月的急性毒性最高,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分別為0.299(0.257～0.331)mg·L-1和0.251(0.179～0.299)mg·L-1,為劇毒;對湘輝的急性毒性次之,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分別為0.348(0.315～0.411)mg·L-1和0.323(0.299～0.366)mg·L-1,為劇毒;對芙蓉的急性毒性略低,其72 h和96 h的LC50(95%置信區間)分別為0.743(0.687～0.828)mg·L-1和0.570(0.469～0.667)mg·L-1,為高毒。在本次試驗條件下,3個品種的家蠶對氰戊菊酯的敏感性依次為皓月>湘暉>芙蓉。

表1 氰戊菊酯對家蠶的急性毒性結果

在試驗過程中,不同品種的家蠶經氰戊菊酯處理后均出現了一定程度的中毒癥狀,如拒食、體扭曲和吐水等。

2.2 亞致死劑量的氰戊菊酯對家蠶的生長發育毒性

2.2.1 對家蠶眠蠶體重的影響

用亞致死劑量的氰戊菊酯藥液處理的桑葉飼喂2齡起蠶,各眠期家蠶幼蟲的體重變化如圖1。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組的2眠蠶體重均略低于空白對照組和助劑對照組,其中0.062 8 mg·L-1氰戊菊酯處理組的2眠蠶體重顯著低于空白對照組,但與助劑對照組差異不顯著,其余處理組2眠蠶體重與對照組均無顯著差異(P<0.05)。而各處理組的3眠和4眠蠶體重與對照組均無顯著差異(P<0.05)。

數據間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。Values with different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).

可見,亞致死劑量的氰戊菊酯對眠蠶體重有一定的影響,隨著家蠶齡期的增長,對眠蠶體重的影響也逐漸減弱。

2.2.2 對家蠶發育歷期的影響

用亞致死劑量的氰戊菊酯藥液處理的桑葉飼喂2齡起蠶,各齡期家蠶發育歷期總體呈現先縮短再延長的變化趨勢(表2)。各處理組家蠶2齡發育歷期均短于對照組,除0.006 98 mg·L-1處理組外,其余處理組家蠶2齡的發育歷期均與對照組存在顯著差異(P<0.05)。與對照組相比,各處理組家蠶3齡發育歷期均有所延長,其中0.000 775 mg·L-1處理組家蠶3齡的發育歷期顯著長于對照組(P<0.05)。0.000 775 mg·L-1處理組家蠶4齡的發育歷期顯著短于對照組(P<0.05),其他各處理組家蠶4齡和5齡的發育歷期均與對照組無顯著差異(P<0.05)?？梢?亞致死劑量的氰戊菊酯對家蠶發育歷期有一定的影響,其中0.000 775 mg·L-1處理組對家蠶發育歷期的影響尤其明顯,但隨著家蠶齡期的增長,對發育歷期的影響也逐漸減弱。

表2 亞致死劑量氰戊菊酯對家蠶幼蟲發育歷期的影響

2.2.3 對家蠶蛹重的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續飼喂對家蠶蛹重的影響見表3。各處理組蛹重與對照均無顯著差異(P<0.05)。

表3 亞致死劑量氰戊菊酯對家蠶經濟學性狀的影響

2.2.4 對全繭量和繭層量的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續飼喂對家蠶全繭量和繭層量的影響見表3。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的全繭量略低于對照組,但與對照均無顯著差異(P<0.05)。而0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的繭層量顯著低于對照組(P<0.05),呈現劑量-效應關系?？梢?亞致死劑量的氰戊菊酯對家蠶繭層量有顯著影響。

2.2.5 對家蠶幼蟲死亡率、結繭率、化蛹率和死籠率的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續飼喂對家蠶幼蟲期死亡率、結繭率和化蛹率的影響見表3。亞致死劑量的氰戊菊酯處理后,家蠶幼蟲期的死亡率范圍為2.22%～6.67%,結繭率范圍為93.33%～97.78%,各處理間均無顯著差異(P<0.05)。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的化蛹率和死籠率與助劑對照無顯著差異(P<0.05);0.002 33和0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的化蛹率和死籠率與助劑對照組差異顯著(P<0.05)?？梢?亞致死劑量的氰戊菊酯對家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響,且0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理對化蛹率和死籠率的影響尤為明顯,蛹體發黑、變形、長霉(圖2)。

A, 發黑;B和C,變形;D,長霉。A, Black; B and C, Out of shape; D, Mouldy.

3 討論

目前對于亞致死劑量并沒有統一的界定,其取值也因研究對象和研究目的不同而有所差異,大多數選擇的劑量范圍為LC10～LC30[23-25]。本研究中的氰戊菊酯通過外源污染到達桑葉上的劑量要遠低于施用濃度,故選擇對家蠶的存活影響較小,但可能影響家蠶正常的生長發育的試驗劑量(0.000 775～0.062 8 mg·L-1)作為本研究的亞致死劑量。

農藥對家蠶的生長發育毒性效應通常包括對家蠶幼蟲眠蠶體重、發育歷期、化蛹率、蛹重、結繭率、全繭量、繭層量、繭層率等敏感指標的影響[26],并且不同藥劑對家蠶生物學指標的影響因藥劑的不同而有所不一致,且受影響的程度也不同。已有研究表明,在家蠶2～3齡階段暴露于0.16 mg·L-1三唑磷后,幼蟲死亡率為0,但全繭量、繭層量和繭層率顯著降低[27];亞致死劑量的吡蟲啉對家蠶的生長發育和產繭量都有較大影響[28];亞致死劑量的溴蟲腈對家蠶的發育歷期、蛹重和繭層量無不良影響,其中全繭量反而有所增加[28];在2～3齡階段暴露于0.40 mg·L-1戊唑醇后,全繭量、繭層量和繭層率分別顯著降低6.8%、11.8%和4.4%[8];亞致死劑量的甲氧蟲酰肼對家蠶眠蠶體重、全繭量、繭層量、繭層率和結繭率等指標均具有顯著影響[29]。本研究結果表明,亞致死劑量的氰戊菊酯處理對眠蠶體重和發育歷期有一定的影響,但隨著家蠶齡期的增長其影響逐漸減弱;對家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響(P<0.05);0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組對家蠶繭層量有顯著影響(P<0.05)?？梢?亞致死劑量的氰戊菊酯處理對家蠶的生長發育造成了明顯的影響。繭層量是家蠶重要的生長發育指標和經濟性狀,也是家蠶吐絲功能的表現。有研究報道,不同農藥處理導致家蠶結繭率顯著降低,對家蠶絲腺進行組織病理學觀察發現家蠶絲腺顯著受損,絲腺體膜受損、管腔空泡化,進而影響家蠶吐絲[8,30]。本研究中亞致死劑量的氰戊菊酯處理對家蠶繭層量的影響是否與絲腺組織的受損有關還有待進一步研究。

本研究中,0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組對家蠶3齡和4齡發育歷期有顯著影響(P<0.05),0.002 33、0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組對家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響(P<0.05),呈現非單調劑量-效應關系,可能與氰戊菊酯的內分泌干擾作用有關。越來越多的研究表明一些內分泌干擾物的活性被證明具有復雜的非單調劑量-效應關系,而不是單調的劑量-效應關系[31-32],如滴滴伊在10-12～10-8mol·L-1的劑量范圍內,誘導垂體瘤細胞分泌催乳素的效應呈倒U型曲線,硫丹、咪酰胺也表現出相似的劑量-效應曲線[33-34]。阿特拉津津對兩棲動物變態的影響也被證明是非單調劑量-效應關系[35],75 μg·L-1的阿特拉津處理能抑制虎皮蠑螈變態,而250 μg·L-1時卻促進變態[36],在1 mg·L-1時促進南美蟾蜍變態,而5 mg·L-1時抑制變態,其他劑量時效應不明顯[37]。高劑量(25 μg·kg-1·d-1)和低劑量(25 ng·kg-1·d-1)的雙酚A 降低雌鼠的生殖能力,而中間劑量(250 ng·kg-1·d-1)對雌鼠的生殖能力沒有明顯影響[38]。雙酚A經消化道途徑給藥后,低劑量組小鼠子宮腔面積增大,子宮上皮增生明顯,但隨著雙酚A劑量的逐步增大,其子宮上皮增生作用反而逐漸減弱[39]。隨著內分泌干擾物非單調劑量-效應研究的不斷深入,學者們開始從細胞毒性、細胞和組織特異性的受體和共因子、受體選擇性、受體下調和脫敏、受體競爭、內分泌負反饋等機制上對非單調劑量-效應進行了解釋[40-41]。而本研究中獲得的氰戊菊酯對家蠶發育歷期、化蛹率和死籠率的非單調劑量-效應結果,其作用機制目前尚不清楚,有待進一步深入探索。另外,本研究中獲得的非單調劑量-效應未能呈現完整的非單調劑量-效應關系,可能與本研究選擇的劑量范圍有關,未能完全覆蓋整個劑量效應關系。有觀點認為即使很低劑量的內分泌干擾物也能對生物的內分泌系統產生干擾作用,所以內分泌干擾物像致癌物一樣不存在安全閾值[42-43]。因此,今后針對此類內分泌干擾物研究設計時,應該充分考慮劑量范圍,便于精準掌握重點評價指標。

此外,氰戊菊酯對家蠶的急性毒性為高毒或劇毒,在生產中通常不會在桑園內使用,但往往容易忽略其在農?；煸詤^的使用。根據本研究結果,亞致死劑量的氰戊菊酯對家蠶眠蠶體重、發育歷期、繭層量、化蛹率、死籠率等指標均有不同程度的影響。因此,在農?；煸詤^使用氰戊菊酯時應與桑園保持足夠的距離,避免霧滴漂移或其他農事活動污染桑園引起家蠶中毒。