臺灣獨蒜蘭組培繁育及其假鱗莖的化學組成分析

孫 健,任江劍,王海閣,江建銘,王志安,俞旭平

(浙江省中藥研究所有限公司,浙江 杭州 310023)

臺灣獨蒜蘭(PleioneformosanaHayata) 是蘭科(Orchidaceae)獨蒜蘭屬(Pleione)植物,作為重要的觀賞及藥用植物,市場對獨蒜蘭屬植物資源的需求很大。臺灣獨蒜蘭分布于臺灣、福建西部至北部、浙江南部和江西東南部[1],主要生長在林下或林緣腐殖質豐富的土壤或巖石上,生長的小環境條件苛刻。臺灣獨蒜蘭可以通過種子繁殖和假鱗莖增殖的方式繁育。但自然群體中,臺灣獨蒜蘭結實率極低,且種子無胚乳,萌發率極低,同時,通過假鱗莖無性繁殖的比率也很低。低繁殖率和苛刻的生存環境使得臺灣獨蒜蘭自然居群生存極易受到威脅。目前,獨蒜蘭屬所有物種被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ和 2021 年版《國家重點保護野生植物名錄》的二級保護植物。

同屬的植物獨蒜蘭[P.bulbocodioides(Franch.) Rolfe]和云南獨蒜蘭[P.yunnanensis(Rolfe) Rolfe]被《中華人民共和國藥典》作中藥材“山慈菇”的基原植物。獨蒜蘭和云南獨蒜蘭以假鱗莖入藥,被稱為“冰球子”,具有清熱解毒、化痰散結、平喘止咳、消炎、鎮痛、止血等功效,用于治療癰腫疔毒、瘰疬痰核、淋巴結結核、蛇蟲咬傷、氣管炎、百日咳、哮喘、咳血、跌打損傷和化膿性骨髓炎等疾病[2]。近二十年,國內外學者對獨蒜蘭屬植物假鱗莖的化學成分進行了系列分離鑒定,包括聯芐類、菲醌類、木脂素類、黃酮類和簡單酚類等化合物,這些次生代謝產物或提取物具有抗癌、保肝、抗炎、神經保護和抗氧化等活性[2-4],其中所含的芐酯類是一類存在于蘭科植物中且結構較新穎的化學成分,具有益智、延緩衰老、保護神經等作用[5]。但目前云南獨蒜蘭資源急劇減少,以致面臨枯竭,而臺灣獨蒜蘭和獨蒜蘭是同屬的近緣物種,具備潛在的近似功效的藥用價值。但是目前未見有關臺灣獨蒜蘭藥用方面的報道,本研究通過分析栽培臺灣獨蒜蘭假鱗莖化學組成,以臺灣獨蒜蘭的果莢為材料,探索臺灣獨蒜蘭的組培繁育技術體系,同時應用代謝組學和HPLC技術分析臺灣獨蒜蘭的主要成分組成,并應用組培技術繁育得到臺灣獨蒜蘭的植株,對擴大“冰球子”的入藥材料來源有一定指導價值。

1 材料與方法

1.1 儀器

Exactive-UltiMate 3000超高壓液相超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司),ACQUITY UPLC BEH C18色譜分析柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國沃特世公司);Agilent 1100液相色譜(美國安捷倫公司),ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm,美國波士頓公司);AB204-S型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);Heraeus Fresco17離心機(美國賽默飛世爾科技有限公司);Milli-Q型超純水系統(美國密理博公司)。

1.2 試劑和材料

臺灣獨蒜蘭的果莢于2019年8月上旬采集于浙江省景寧自治縣東坑鎮。培養20個月,選取大于0.5 g的假鱗莖,60 ℃烘干,獲得干燥藥材。1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯購自成都曼思特生物科技有限公司(Must-22021511,純度≥99.85%);乙腈、甲醇(色譜純,美國賽默飛世爾科技公司),其他化學試劑為分析純。

1.3 組織培養條件

1.3.1 外植體消毒

臺灣獨蒜蘭蒴果置于濃肥皂水中刷洗干凈,在超凈工作臺上將洗滌后的蒴果用75%(體積分數)乙醇表面消毒處理1 min,再用0.1%(質量分數)的HgCl2消毒20 min,用無菌水沖洗6次,用無菌濾紙吸干蒴果表面的水分。

1.3.2 種子接種和原球莖培養

在超凈工作臺上縱向剖開蒴果,將種子均勻撒播在培養基上。然后將其置于25 ℃暗培養,此階段培養基為:1/2MS+活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6.8 g·L-1),pH值5.8。在播種20 d后種子明顯萌發,形成圓球狀莖。待種子萌發出原球狀莖后更換培養基并采用光照培養,溫度為25 ℃,光照時間12 h·d-1,光照強度1 200 lx。換用原球狀莖繼代培養的培養基為:1/2MS+6-BA(1 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)+活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6.8 g·L-1),pH值5.8。

1.3.3 假鱗莖分化增殖

原球狀莖經增殖培養60 d后長出第1片葉芽,但叢生芽數量相對較少,葉片細弱,此時,需對繼代增殖原球狀莖進行葉芽誘導、叢芽增殖,選擇大小適合的原球狀莖接種于添加不同激素配比(表1)的培養基上,基礎培養基為1/2MS活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6 g·L-1),pH值5.8,培養100 d左右繼代培養1次。采用光照培養,溫度為25 ℃,光照時間12 h·d-1,光照強度1 200 lx。

表1 不同激素處理對球狀莖的影響

1.3.4 壯苗培養

將叢芽增殖的小苗接種于不同激素種類和濃度的生根培養基上,所選材料為大小和長度,以及生長狀況一致的帶葉的叢芽小苗。完成接種后將材料移至培養室中,采用光照培養,溫度為25 ℃,光照時間12 h·d-1,光照強度1 200 lx。培養100 d左右繼代培養1次?；A培養基為1/2MS活性炭(1 g·L-1)+蔗糖(30 g·L-1)+瓊脂(6 g·L-1),pH值5.8,不同激素及濃度組合的處理見表2。

表2 不同激素及濃度組合對壯苗的影響

1.4 HPLC色譜分析

柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈溶液(B),梯度洗脫;檢測波長:224 nm;進樣量10 μL。梯度洗脫程序:0～36 min,A為90%～83%;36～48 min,A為83%～76%;48～60 min,A為76%～73%;60～62 min,A為73%～69%;62～80 min,A為69%～60%;80～81 min,A為60%～10%;81～85 min,A為10%;85～86 min,A為10%～90%;86～91 min,A為90%。理論板數按1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰計算應不低于4 000。

樣品制備:稱取50 ℃烘干的假鱗莖粉末約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,稱定質量,超聲處理(功率300 W,頻率45 kHz)30 min,取出,放冷,再穩定質量,用稀乙醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。3次重復。

1.5 代謝組分析

質譜條件:液相條件為,進樣量為4 μL,柱溫35 ℃,流速為0.4 mL·min-1。采用的流動相為A相:水(0.1%甲酸);B相:乙腈(0.1%甲酸)。液相梯度設置為0～0.5 min 5% B;0.5～7 min 5%～100% B;7～8 min 100% B;8～8.1 min 100%～5% B;8.1～10 min 5% B。應用Q-Exactive (Thermo Scientific) 高分辨質譜儀,正、負離子檢測模式,噴霧電壓3.5 kV,毛細管溫度350 ℃,霧化室溫度 320 ℃,鞘氣流速 45 arb,輔助氣流速 15 arb,掃描模式為Full MS/dd-MS,Full MS分辨率 70 000,dd-MS分辨率 17 500,掃描范圍為m/z70～1 050。MS/MS模式時所用碰撞能量為 30 eV。

樣品制備:稱取假鱗莖粉末100 mg,向樣品加入 120 μL 50%甲醇,震動充分混勻,提取樣品中的代謝物,常溫靜置10 min;提取液放-20 ℃過夜,沉淀樣品中的蛋白質;4 000×g離心20 min,轉移上清液代謝物提取液。

1.6 數據統計

應用CD3.1軟件處理本研究所得的質譜數據,應用KEGG數據庫 https//www.genome. jp/kegg/pathway.html和HMDB 數據庫 https//hmdb.ca/metabolites 進行代謝物代謝通路注釋。

2 結果與分析

2.1 臺灣獨蒜蘭組培體系構建

臺灣獨蒜蘭種子培養基上播種15～20 d,發芽率超過90%。經過60 d的原球狀莖培養,獲得長有1個葉尖的原球狀莖。然后進行假鱗莖誘導和增殖培養200 d,此階段以6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的激素配比繼代培養效果最佳,增殖倍數達到5.7,臺灣獨蒜蘭組培苗球狀莖生長粗壯(表1)。

假鱗莖生根壯苗培養以添加NAA 0.5 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+2.4-D 0.01 mg·L-1的培養基生根壯苗的效果最佳,生根率最高,為100%,獨蒜蘭組培苗生長粗壯(表2)。本研究接種5個臺灣獨蒜蘭蒴果,平均每個蒴果可以得到1 050個含有1個葉片的假鱗莖幼苗,即通過組培條件繁育可以達到快速繁育臺灣獨蒜蘭的目的。

2.2 臺灣獨蒜蘭假鱗莖化學成分分析

通過非靶向代謝組數據分析鑒定出不同單株假鱗莖材料的共有化合物1 229種(圖1),包括羧酸及其衍生物236種、苯及取代衍生物110種、有機氧化合物106種、脂肪?；衔?4種、黃酮類化合物43種、甾體及甾體衍生物42種,其中以化合物1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(C34H46O17)為代表的芐酯類化合物在諸多蘭科藥用植物假鱗莖中發現,如白及、手參、竹葉蘭等[6-8],具有肺A549細胞損傷功效[9]。

A、B,主要化合物類型組成;C,依據KEGG注釋和文獻檢索確定的芐酯類化合物。A, B, Composition of major compound types; C, Benzyl esters identified according to KEGG annotations and published articles.

鑒于芐酯類化合物為具有近似功效蘭科植物所特有的標志性化合物,因此,構建臺灣獨蒜蘭假鱗莖化學成分檢測的HPLC檢測體系(圖2),該體系獲得特征峰13個,同時對其代表性物質1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯進行定量分析。以峰面積為縱坐標(y)、對照品質量濃度為橫坐標(x)進行線性回歸?；貧w方程為:y=15 409.22x+9.03,R2=0.999 9,在0.034 028～0.136112 μg·mL-1線性關系良好。臺灣獨蒜蘭假鱗莖部位的1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯含量為0.53%±0.01%。

A, 標準品1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯圖譜;B,臺灣獨蒜蘭樣品圖譜。A, Standard 1,4-bis[4-(glucooxy)benzyl]-2-isobutyl malate pattern; B, Atlas of P. formosana samples.

3 討論

獨蒜蘭屬植物果實為蒴果,透水透氣性較差,同時獨蒜蘭種子細小,無胚乳,種子沒有貯藏足夠的營養物質,在自然條件下很難萌發成苗,有性繁殖率較低。獨蒜蘭的組培繁育一般需要經過種子萌發、原球狀莖增長、假鱗莖增殖、生根壯苗4個階段。本研究利用臺灣獨蒜蘭種子進行組培發芽,不需要添加激素,接種2周后種子萌發;其他研究亦發現獨蒜蘭屬植物種子可以在MS、B5、VW等培養基上萌發,萌發率通常高于90%[10]。原球狀莖增長、假鱗莖增殖、生根壯苗培養需要激素的干預,在種子萌發形成原球狀莖后適當添加6-BA和NAA有利于原球莖的發育和假鱗莖的增殖。陳光芬[11]研究表明,在使用6-BA和NAA的基礎上配合使用KT有利于原球狀莖的發育;王躍華等[10]研究表明,在假鱗莖誘導培養過程中使用TDZ和KT可以誘導產生叢生苗,后續可以進一步嘗試應用苯基噻二唑基脲(TDZ)和激動素(KT)等激素提高臺灣獨蒜蘭的繁殖系數。

目前,國內外對于獨蒜蘭化學成分的研究主要集中在獨蒜蘭和云南獨蒜蘭兩種植物,分離鑒定的化合物主要包括菲類、萜類、甾體類和聯芐類化合物[2,4-5,12-13],聯芐類化合物在蘭科植物中分布較多,具有抗腫瘤、降血糖等功效[2]。獨蒜蘭屬植物在世界范圍約有33種,我國為該屬植物的分布中心,約有29種,其中16種為特有種[14]。諸多近緣的物種與獨蒜蘭和云南獨蒜蘭含有近似的化學成分組成[15]。本研究發現,臺灣獨蒜蘭的假鱗莖含有萜類、甾體類和聯芐類化合物,表明其可能與同屬其他植物具有近似的藥理作用。臺灣獨蒜蘭中1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯的含量為0.53%,與已報到的獨蒜蘭的假鱗莖中的同一物質含量近似。后續實驗可以進一步開展藥理實驗驗證獨蒜蘭屬其他植物的藥理作用,擴大“冰球子”的入藥材料來源,結合快速繁育和人工栽培,緩解藥材對于瀕危植物的原料需求壓力。