利用CRISPR/Cas9系統制備斑馬魚cbsb敲除模型

陳福海 蔣林 曹建斌 蔣偉青 項略 顧珊燁 劉犇

硫化氫（H2S）作為一種有毒氣體，早先被認為在非硫生物體內無特殊生理功能。然而近幾十年的研究發現絕大部分哺乳動物中都含有編碼H2S 生成酶的基因，暗示其可能作為內源性氣體遞質發揮重要的細胞功能[1]。胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）是在哺乳動物中鑒定得到的3 個H2S 合成酶之一，當受維生素B6催化時能使絲氨酸與同型半胱氨酸合成胱硫醚，后者進一步代謝產生H2S 分子[2]。目前已有實驗室構建了穩定的CBS 編碼基因（Cbs）敲除小鼠[3-4]，證實了CBS 在正常生理狀態和疾病中都發揮著重要功能，包括心血管、神經、免疫、腫瘤等[5-8]。斑馬魚Danio rerio 作為低等脊椎動物研究模型，具有個體小、易養殖、體外受精且早期發育快、幼魚透明易于活體成像、遺傳操作方法豐富且高效等諸多研究優勢[9]，已逐漸成為全球第三大模式動物，并已開發出多種熒光標記的遺傳品系供活體觀察和研究，涉及的組織器官有心血管系統、免疫系統、骨骼系統、神經系統等[10]。為了更深入細致地研究CBS 的功能，尤其是在發育過程中和正常生理情況下，本研究擬構建斑馬魚中CBS 同源的胱硫醚-β-合成酶b 基因（cystathionine beat-synthase b gene，cbsb）的敲除品系，旨在為后續深入研究胱硫醚-β-合成酶b（cystathionine beta-synthase b，Cbsb）的功能提供基礎動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗用AB/WT 斑馬魚品系飼養于中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺，采用北京愛生科技發展有限公司公司斑馬魚集中養殖和繁育系統養殖，養殖條件為水溫28.5 ℃、pH 7～8 和14 h 光/10 h 暗的光照周期。收集受精卵：前1 天的傍晚將性成熟的斑馬魚按1∶1 性別比放入交配盒中，并用擋板將雌雄魚分開；次日上午取出擋板，并在20 min 內收集剛受精的胚胎（1-cell 期）用于顯微注射。

1.2 Cbsb 序列保守性分析 從國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中獲取人（序列號：AAA98524.1）、小鼠（序列號：AAH13480.1）、大鼠（序列號：AAB02042.1）、斑馬魚（序列號：AAW78657.1）的CBS 的蛋白序列，利用ClustalX軟件分析CBS 的同源性，并利用NCBI-Blast 分析CBS的保守結構域。

1.3 敲除靶點設計 使用成簇的規律性間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9 系統建立斑馬魚基因敲除品系：利用ChopChop 網站（http://chopchop.cbu.uib.no/）在線設計斑馬魚cbsb 的CRISPR/Cas9 敲除靶點，選擇位于第4、第5 和第6 個外顯子中的4 個向導RNA（guide RNA，gNRA）靶點，用于后續測試并篩選有效的切割靶點。為了驗證上述設計的靶點序列在AB/WT斑馬魚基因組中的正確性，從Ensembl 數據庫中獲取這4 個靶點處的基因組序列，根據NCBI Primer-Blast設計擴增引物；采用PCR 法從AB/WT 斑馬魚基因組中擴增中這4 個靶點處的基因組序列，測序，驗證基因組中實際的靶點序列。引物序列見表1。

表1 斑馬魚cbsb 的引物

1.4 Cas9 mRNA 和gRNA 制備 根據T7 mMESSAGE Ultra?試劑盒（Ambion，美國，批號：AM1345）方法體外轉錄斑馬魚中密碼子優化的Cas9 mRNA（體外轉錄質粒模板由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺提供），并測定濃度；加入gRNA 靶點序列和T7 啟動子，使用PCR 法（擴增質粒模板由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺提供）制備gRNA 合成的DNA 模板，根據MAXIscript?T7 試劑盒（Ambion，美國，批號：AM1312）方法體外轉錄為gRNA；根據mirVana?miRNA Isolation試劑盒（Ambion，美國，批號：AM1561）方法回收和純化gRNA，并測定濃度。

1.5 顯微注射及gRNA 切割效率檢測 將Cas9 mRNA（400 mg/L）和gRNA（100 mg/L）混合物導入拉制好的顯微注射玻璃電極中，通過顯微注射儀（PICOSPRITZER?Ⅲ，Parker，美國；注射參數為30 psi，200 ms）將1 nL 的RNA 混合物注入1-cell 期細胞的動物極中。使用Hanks 溶液培養（根據Zebrafish Book 配置），并在3 d 后選取20 枚正常發育的胚胎提取基因組，使用對應的檢測靶點序列的引物擴增靶點處基因組序列并測序，引物序列見表1。如果測序結果中發現靶點處出現亂峰，說明基因組該靶點處有切割，進一步將PCR 產物做T-A 克隆，多個克隆的測序結果與AB/WT 基因組序列比較，通過統計序列不一致的克隆數量計算靶點切割效率。

1.6 穩定品系篩選和鑒定 將注射Cas9 mRNA和gRNA混合物的胚胎養殖至成年（F0 代），并與AB/WT 成年斑馬魚外交，收集子代胚胎，并選取20 枚3 d 齡子代斑馬魚基因組擴增靶點處序列，通過測序檢測靶點處是否出現亂峰，出現亂峰的親本斑馬魚為敲除Founder。進一步將出現亂峰的PCR 產物做T-A 克隆，測序分析后將發生移碼突變的Founder 于AB/WT 外交并養殖F1代。F1 代成年后通過剪尾提取基因組，通過PCR 和測序篩選cbsb 有移碼突變的斑馬魚，含有移碼突變的F1代斑馬魚進一步外交養殖，同樣方法剪尾篩選獲得F2代穩定敲除品系的雜合子。將F2 代雜合子內交可有1/4 的概率獲得cbsb 敲除的純合子。

2 結果

2.1 斑馬魚Cbsb 保守性分析 ClustalX 和NCBI-Blast比對序列發現，斑馬魚Cbsb 序列與人的CBS 序列一致性為76.32%，與小鼠的CBS 序列一致性為74.69%，與大鼠的CBS 序列一致性為75.94%。與哺乳動物相似，斑馬魚Cbsb 中間同樣含有一個保守CBS 結構域，見圖1?？梢奀BS 在包含斑馬魚在內的脊椎動物中都非常保守，在該保守結構域的編碼序列處設計敲除靶點將會有效破壞該基因產物的正常功能。

圖1 斑馬魚Cbsb 同源性分析

2.2 gRNA 靶點設計及合成 利用ChopChop 在線設計斑馬魚cbsb 的敲除靶點，4 個靶點均位于Cbsb 保守結構域編碼序列的上游，其中靶點1#位于第4 個外顯子上，靶點2#位于第5 個外顯子上，靶點3#和4#位于第6 個外顯子上。以AB/WT 斑馬魚基因組為PCR 模板，使用表1 引物序列擴增，測序發現AB/WT 斑馬魚基因組中包含與設計靶點一致的序列，見圖2A。擴增獲得約120 bps 的PCR 產物，即為gRNA 轉錄的DNA 模板，見圖2B。使用體外轉錄試劑盒轉錄gRNA 并回收，獲得的gRNA 的濃度分別為209、290、331 和222 mg/L。

圖2 gRNA 靶點基因組序列測序驗證及其體外轉錄gRNA 的模板制備（A：基因組測序結果與設計的gRNA 靶點序列比對；B：gRNA 模板電泳圖）

2.3 檢測靶點的切割效率 將體外轉錄的Cas9 mRNA 分別和gRNA 混合，注入1-cell 期細胞的動物極中，并獲得注射過的胚胎約100 枚，培養3 d。每組取20 條左右發育正常的幼魚，提取基因組并測序。結果發現4#靶點gRNA 的斑馬魚胚胎基因組中該位點的序列出現亂峰，其余靶點未發現亂峰，表明4#靶點被Cas9/gRNA 混合物切割，見圖3A。T-A 克隆并測序，序列分析表明4#靶點處基因組序列被切割，切割效率為33.33%（5/15），見圖3B。上述結果表明設計的gRNA 4#可高效切割斑馬魚cbsb 中對應的基因組上靶點，可通過該靶點來制備斑馬魚cbsb 敲除品系。

圖3 不同gRNA 注射后檢測基因組切割效率（A：注射Cas9/gRNA 混合物后幼魚基因組測序結果與設計的gRNA 序列比對；B：4#靶點序列改變及切割效率）

2.4 F0 代養殖和Founder 篩選 從gRNA 4#注射后的剩余胚胎中取40 條正常發育的幼魚繼續培養至F0 代性成熟，優先使用F0 代雄魚外交；取20 條子代幼魚的混合基因組進行PCR 擴增并測序，選取在靶點處出現亂峰的樣本，即為Founder。首批共9 條雄魚外交，篩選后發現其中7 條出現亂峰，暗示該位點切割后產生的插入/刪除序列遺傳至下一代斑馬魚，見圖4。其中Founder 5#、10#、12#和13#在靶點處出現顯著亂峰，推測這些Founder 子代中出現cbsb 破壞的斑馬魚概率較高。選擇Founder 5#和10#的子代幼魚進一步養殖，以篩選穩定的cbsb 敲除雜合子品系。

圖4 F0 子代幼魚基因組測序篩選cbsb 敲除Founder

2.5 F1 代鑒定及穩定品系傳代 剪尾篩選發現，25條Founder 5#和10#的成年子代（F1 代）中，17條基因組該位點都出現亂峰，進一步分析峰圖和亂峰起始位置可見，F1代含有3種不同的基因組改變方式，見圖5A；對這些F1 代斑馬魚的PCR 產物克隆后測序，鑒定確認為-8 bp、-3+13 bps 和-228 bps 處基因組改變，見圖5B。選擇-3+13 bps 和-228 bps 的兩種子代傳代，得到-3+13 bps 改變的穩定品系，命名為Ko（cbsb）a，-228 bps改變的穩定品系，命名為Ko（cbsb）b。將這兩種品系各自內交并養殖F2 代，剪尾測序篩選并驗證基因組序列，結果發現該位點突變可穩定遺傳，即可獲得cbsb 敲除斑馬魚的純合子，見圖5C。序列分析表明，Ko（cbsb）a品系可產生長為285 個氨基酸的Cbsb 截斷產物，Ko（cbsb）b品系整個6#外顯子幾乎全部刪除，其轉錄本出現移碼突變，產生長為216 個氨基酸的Cbsb 截斷產物，見圖5D。

圖5 穩定cbsb 敲除品系篩選和鑒定（A：F1 代剪尾測序篩選cbsb 敲除雜合子；B：F1 代T-A 克隆并測序確認基因組改變方式；C：F2 代剪尾測序鑒定cbsb 敲除純合子；D：編碼序列分析穩定cbsb 敲除品系產生截斷的Cbsb）

3 討論

對人類遺傳疾病的研究發現，Cbs 的突變與胱硫醚尿癥相關，臨床表現為眼、骨骼、大腦、血管等組織的病變[11-12]。在小鼠模型中，敲除Cbs 導致小鼠血漿中同型半胱氨酸水平上升為正常小鼠的40 倍，并導致嚴重的生長遲緩表型，多數模型小鼠在出生后5 周內死亡。這些結果表明小鼠完全缺乏CBS 可導致嚴重同型半胱氨酸血癥[13]。

血漿中同型半胱氨酸水平升高被認為是心血管相關疾病的危險因素。研究發現Cbs 敲除小鼠表現出明顯的高血壓和血管舒張性降低，提示H2S 是一種生理性血管擴張劑和血壓調節劑[13]。Cbs 敲除的老年小鼠中，主動脈環對乙酰膽堿的舒張選擇性受損，血栓調節蛋白抗凝血活性降低[14]，其肺部的血管生長也顯著降低[15]。同時敲除Cbs 和apolipoprotein E 則導致無飲食誘導下的動脈粥樣硬化的發生[16]。敲除Cbs 還會導致高血壓以及血管的不良重塑[17-18]?？梢奀BS 對于血管的正常生長和功能起到了重要作用。

CBS 還在其它多種生理和病理過程中發揮作用。如Cbs 敲除小鼠表現出貧血，血清、肝臟、脾臟和心臟中的鐵含量顯著增加，肝臟嚴重受損，出現血色素沉著癥樣表型，表明CBS 參與了體內的鐵離子穩態[19]。斑馬魚發育模型中，cbsb 瞬時敲降會導致部分胚胎出現體軸彎曲，暗示其可能在體軸發育中也發揮關鍵的作用[20]。在小鼠炎癥模型中，敲除小膠質細胞的Cbs可導致炎癥和神經元凋亡增加，而過表達Cbs 降低了炎癥及其相關因子的表達水平，表明其對免疫系統也有調節作用[7]。另外，Cbs 在腎臟系統、肝臟系統、生殖系統、骨骼系統、神經系統、紅細胞生成、腫瘤發生等中發揮特定的功能[12，21-24]?？梢奀BS 涉及的功能十分廣泛。

CRISPR 是原核生物所特有的一種抵御外源性遺傳物質的免疫系統，CRISPR/Cas9 基因編輯技術被廣泛應用于斑馬魚基因敲除品系建立。本研究基于CBS在斑馬魚中的保守性，使用CRISPR/Cas9 建立了斑馬魚cbsb 敲除模型。本研究通過測序和精細序列分析來檢測敲降效率、篩選穩定品系、鑒定雜合子/純合子等，減少了技術環節，簡化了敲除品系方法和流程，為后續斑馬魚敲除品系的制備和傳代提供借鑒的方法。本研究成功構建的cbsb 敲除穩定品系可與現有的斑馬魚多種熒光標記品系（如血管內皮細胞、神經細胞、心肌細胞、腎臟細胞等）雜交，從而獲得cbsb 穩定敲除且具熒光標記的模型，借助斑馬魚活體成像技術和高通量技術的優勢，為進一步研究cbsb 在生理和病理過程中的精細功能提供基礎。