雪上一枝蒿生物堿可溶性微針制備

陳 瑤，鄧鉍莉，萬 靜，2，董娜娜，陳曉蘭*，張永萍

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025； 2.畢節醫學高等?？茖W校，貴州 畢節 553302）

雪上一枝蒿為毛茛科烏頭屬植物短柄烏頭AconitumbrachypodumDiels、鐵棒錘Aconitum pendulumBusch、宣威烏頭AconitumsubrosullatumH.-M.的干燥塊根，功效祛風除濕、消炎鎮痛，用于治療風寒濕痹所致筋骨、關節疼痛，療效顯著［1］，但其毒性較大。經皮給藥為毒性中藥常用給藥途徑，其操作方便，可直接作用于治療部位，降低進入循環系統的藥物濃度，并能隨時停藥，從而降低毒副作用發生，同時避免了肝臟首過效應，提高了藥物生物利用度［2-4］，故將雪上一枝蒿制成透皮吸收制劑是較理想的方案。

微針是一種具有微米級尺寸針尖陣列的經皮給藥制劑［5］，分為固體微針［6］、涂層式微針［7］、空心微針［8］、可溶性微針［9-10］、水凝膠微針［11-13］，其中可溶性微針以能生物溶解或降解的高分子材料為基質制備而成，針體刺入皮膚后藥物開始釋放，基質材料也會在體內自行降解，具有安全、有效、無痛的優勢［14］。研究表明，它通過全載藥方式來實現藥物的有效透皮遞送，并能增大載藥量［15-16］。本實驗制備雪上一枝蒿生物堿可溶性微針，以期為相關經皮給藥制劑開發利用提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器 PDMS 陰模（針長550 μm，浙江臺州微芯醫藥科技有限公司）； TD5A-120 型高速離心機（常州金壇良友儀器有限公司）； 101-3AB 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SH-50N 型推拉力計（樂清市艾德堡儀器有限公司）； szx7 型攝影體式顯微鏡、BX53 型正置生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； E-1045 型離子濺射裝置（日本株式會社日立高新技術那珂事務所）；Inspect 型掃描電子顯微鏡 （美國FEI 公司）；AE240 型電子天平（十萬分之一）、AUY220 型電子天平（萬分之一） ［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］； 安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； RQJ-12B 型藥物透皮擴散試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）； RM2016 型病理切片機（德國Leica 公司）； R35 型切片刀 （日本Feather 公司）； JK-6 型生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司）； 載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.2 試劑與藥物 雪上一枝蒿甲素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110895-200404）； 雪上一枝蒿生物堿對照品［自制，生物堿含量＞70%（以雪上一枝蒿甲素計） ］。雪上一枝蒿購于云南雪上一枝蒿制藥有限公司，經貴州中醫藥大學鐘可副教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物短柄烏頭Aconitum brachypodumDiels 的干燥塊根。聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP K30，北京索萊寶生物科技有限公司，批號511D031）； 聚乙烯吡咯烷酮K90 （PVP K90，批號B01A10S84446）、聚乙烯吡咯烷酮K120（PVP K120，批號G13M11B113099） （上海源葉生物科技有限公司）； 硫酸軟骨素（CS，西安拉維亞生物科技有限公司，批號20180222）。食用酒精（重慶江川化工有限公司）； 蘇木素（貨號H9627，美國Sigma 公司）； 伊紅Y （水溶性） （貨號71014544）、無水乙醇（貨號10009218）、二甲苯（貨號10023418）、鹽酸（貨號10011018）、包埋石蠟 （ 貨號 69019361）、中性樹膠 （ 貨號10004160） 均購自國藥集團化學試劑有限公司。甲醇（批號20201224）、乙腈（批號20200507）、三氯甲烷（批號20200402） 均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 動物 SD 大鼠，體質量250 ～280 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK （湘） 2019-0014。所有動物實驗均遵循貴州中醫藥大學倫理委員會實驗動物管理和使用規定，符合3R 原則，倫理審查編號20210046。

2 方法與結果

2.1 生物堿含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Agilent 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相磷酸鹽緩沖液（pH ＝7.3） -乙腈 （5 ∶ 95）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長200 nm； 進樣量5 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取雪上一枝蒿甲素對照品0.005 0 g，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，制成每1 mL 含0.50 mg 該成分的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取可溶性微針1 片，精密稱定質量，加入80 倍量甲醇超聲提取30 min，離心，除去不溶性基質材料，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，雪上一枝蒿甲素色譜峰峰形理想，基質材料對測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 雪上一枝蒿甲素HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of bullatine A

2.1.5 線性關系考察 精密吸取對照品溶液適量，甲醇依次稀釋至0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.50 mg/mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝10 094X-108.44 （r＝0.999 4），在0.031 25 ～0.50 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，同一天內在“2.1.1” 項色譜條件下每1 h 進樣測定1 次，連續6 次； 同法隔天測定1 次，連續6 d，測得雪上一枝蒿甲素日內、日間峰面積RSD 分別為0.62%、1.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得雪上一枝蒿甲素峰面積RSD 為0.90%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 制備供試品溶液6 份，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得雪上一枝蒿甲素峰面積RSD 為0.71%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取6 批樣品，制成雪上一枝蒿甲素質量濃度為0.09 mg/mL 的供試品溶液，加入同體積0.09 mg/mL 對照品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，雪上一枝蒿甲素平均加樣回收率為102.4%，RSD 為2.03%。

2.2 可溶性微針制備 采用離心法，稱取基質材料適量，加入一定體積分數乙醇，在水浴鍋上充分攪拌至溶解并呈透明狀，加入藥物攪拌至完全溶解，注入微針模具中，4 000 r/min 離心20 min，取出，置于35 ℃烘箱中干燥6 h，脫模，即得。

2.3 處方優化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 評價指標確定

（1） 外觀形態。肉眼觀察微針背襯是否平整，在體式顯微鏡下觀察微針陣列完整性。

（2） 溶解性。將微針扎在保鮮膜上并使針尖全部穿透，覆蓋在裝滿37 ℃水的燒杯上，于3、5、8、10 min 取下微針，在體式顯微鏡下觀察針尖溶解情況，記錄其溶解時間。

（3） 機械強度。將大鼠脫頸椎處死并脫毛，剝離皮膚，去掉皮下脂肪后生理鹽水反復沖洗干凈，保存在生理鹽水中，使用前擦干表面水分，將角質層側向上放置并固定在泡沫板上，微針用20 N壓力垂直作用于皮膚上30 s，立即用1%臺盼藍溶液對微針作用處的皮膚進行染色，30 s 后棉簽擦掉多余染液，生理鹽水清洗干凈，觀察并記錄皮膚表面染色小孔數量，計算刺孔率，公式為刺孔率＝（皮膚上針孔數/微針陣列數） ×100%，其中微針陣列數為400 （即微針陰模陣列數）。

（4） 評價標準。見表1。

表1 指標評價標準Tab.1 Evaluation criteria for indices

2.3.1.2 基質材料篩選 硫酸軟骨素是關節炎治療過程中常用的營養補充劑，其耐受性好，副作用小，藥物相互作用少，文獻［17］ 報道它可用于制備可溶性微針。前期預實驗發現，硫酸軟骨素與聚乙烯吡咯烷酮按一定比例混合制成的微針成型性良好，并具有一定的穿刺能力，故本實驗選擇兩者作為微針基質材料。

乙醇體積分數越大，對雪上一枝蒿生物堿的溶解度越大。通過前期預實驗結合溶劑對基質、藥物的溶解情況，本實驗選擇40%乙醇作為溶劑。

分別稱取硫酸軟骨素90 mg，PVP K30、PVP K90、PVP K12 各270 mg，加入40%乙醇2.5 mL，按“2.1” 項下方法制備可溶性微針，計算外觀形態、刺孔率、針尖溶解時間的綜合評分，結果見表2。由此可知，硫酸軟骨素與PVP K120 混合制成的微針外觀形態好，溶解快，機械強度優。

表2 基質材料篩選結果（分）Tab.2 Results for matrix material screening （score）

2.3.1.3 硫酸軟骨素用量篩選 稱取270 mg PVP K120，共3 份，分別加入硫酸軟骨素60、90、120 mg，再加入40% 乙醇2.5 mL，按“2.1” 項下方法制備可溶性微針，計算外觀形態、刺孔率、針尖溶解時間的綜合評分，結果見表3。由此可知，硫酸軟骨素用量為120 mg 時綜合評分最高。

表3 硫酸軟骨素用量篩選結果（分）Tab.3 Results for chondroitin sulfate consumption screening （score）

2.3.1.4 PVP K120 用量篩選 稱取120 mg 硫酸軟骨素，共3 份，分別加入180、270、360 mg PVP K120，再加入40% 乙醇2.5 mL，按“2.1”項下方法制備可溶性微針，計算外觀形態、刺孔率、針尖溶解時間的綜合評分，結果見表4。由此可知，PVP K120 用量為270 mg 時綜合評分最高。

表4 PVP K120 用量篩選結果（分）Tab.4 Results for PVP K120 consumption screening（score）

2.3.1.5 40%乙醇用量篩選 分別稱取硫酸軟骨素、PVP K120 各3 份，前者用量均為120 mg，后者用量均為270 mg，分別加入40% 乙醇2、2.5、3、3.5 mL，按“2.1” 項下方法制備可溶性微針，計算外觀形態、刺孔率、針尖溶解時間的綜合評分，結果見表5。由此可知，40% 乙醇用量為2.5 mL 時綜合評分最高。

表5 40%乙醇用量篩選結果（分）Tab.5 Results for 40% ethanol consumption screening（score）

2.3.1.6 加藥量篩選 稱取基質材料3 份，分別加入雪上一枝蒿純化物15、20、25 mg，按“2.1”項下方法制備可溶性微針，計算外觀形態、刺孔率、針尖溶解時間的綜合評分，結果見表6。由此可知，不同加藥量下綜合評分相同，但為25 mg 時離心后有沉淀，而為15、20 mg 時外觀形態、溶解性、機械強度均較好，最終確定為20 mg。

表6 加藥量篩選結果（分）Tab.6 Results for addition dosage screening （score）

2.3.2 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，以硫酸軟骨素用量 （A）、PVP K120 用量（B）、40% 乙醇用量（C） 為影響因素，刺孔率（Y） 為評價指標，Box-Behnken 響應面法優化處方，因素水平見表7，結果見表8。

表7 Box-Behnken 響應面法因素水平Tab.7 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表8 Box-Behnken 響應面法設計與結果Tab.8 Design and results for Box-Behnken response surface method

采用Design Expert 10.0 軟件對表8 數據進行擬合，得方程為Y＝97.20＋2.62A＋7.50B-1.63C-1.50AB- 1.75AC- 4.00BC- 12.48A2- 13.22B2-7.48C2，方差分析見表9。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明模型能較好地反映綜合評分與各影響因素之間的關系； 變異系數為2.78，表明模型較穩定； 決定系數、校正決定系數分別為0.985 3、0.966 4，表明模型擬合程度良好。響應面分析見圖2。

表9 方差分析結果Tab.9 Results for analysis of variance

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

最終確定，最優處方為硫酸軟骨素用量123.025 mg，PVP K120 用量297.794 mg，40%乙醇用量2.399 mL，刺孔率為98.954%，結合實際情況，將其修正為硫酸軟骨素用量123 mg，PVP K120 用量298 mg，40%乙醇用量2.4 mL。按上述優化處方制備3 批樣品，測得刺孔率分別為97%、98%、100%，平均值為98.3%，RSD 為1.3%，表明該工藝穩定可靠，重復性良好。

2.4 可溶性微針表征

2.4.1 形態 用數碼相機拍攝按“2.3” 項下最優處方制備的可溶性微針外觀形態，并在掃描電子顯微鏡下觀察，結果見圖3。由此可知，該制劑為正方形貼片（2.79 cm2），黃色，表面光滑，陣列完整，共有400 顆針，間距為400 μm； 針體呈圓錐形，長度為550 μm，底部直徑為300 μm。

圖3 雪上一枝蒿生物堿可溶性微針形態Fig.3 Morphology for soluble microneedles of A.brachypodum alkaloids

2.4.2 穿刺性能

2.4.2.1 鋁箔穿刺試驗 將鋁箔平整鋪于泡沫上，用大拇指按壓鋁箔上的微針30 s 后移走，發現能清晰地看見孔洞，見圖4A。

圖4 雪上一枝蒿生物堿可溶性微針穿刺性能圖Fig.4 Images for piercing performance of soluble microneedles of A.brachypodum alkaloids

2.4.2.2 離體大鼠皮膚穿刺試驗 按“2.3.1.1”項下方法對穿刺性能進行表征，發現大鼠皮膚表面留下針尖樣藍色印跡，見圖4B。

2.4.2.3 離體大鼠皮膚穿刺組織學檢查 大鼠以10%水合氯醛麻醉，腹部去毛擦干，將微針以20 N的壓力施于脫毛皮膚處，保持30 s 后移除微針，1 min 內立即剝離穿刺后的皮膚，置于4%多聚甲醛中固定24 h，經脫水、浸蠟、包埋、切片、干燥、HE 染色后拍照，發現它成功刺破皮膚角質層后進入表皮層，并且未觸及到真皮層神經末梢，能起到無痛給藥的效果，見圖4C。

2.4.3 含藥量測定 取3 批樣品，精密稱定質量，加80 倍量甲醇超聲提取30 min，離心，除去不溶性基質材料，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得雪上一枝蒿甲素平均含量為（0.94±0.025） mg。

2.5 體外透皮試驗 參考文獻［18］ 報道制備雪上一枝蒿生物堿凝膠膏劑，組成為甘油、純水、NP-700、Al （OH）3、酒石酸 （比例0.647 5 ∶0.171 2 ∶0.144 6 ∶0.016 3 ∶0.006 8），含雪上一枝蒿甲素0.94 mg/g。取1 g 均勻涂布在背襯層上，涂布面積同微針面積一致。

大鼠以10% 水合氯醛麻醉，先用剃毛器剃去大部分鼠毛，再用電動剃須刀剃去剩下鼠毛，取下皮膚，剝離脂肪組織和筋膜，生理鹽水反復清洗，濾紙吸干，錫箔紙包裹后置于-80 ℃冰箱中，使用時取出，放入生理鹽水中浸泡30 min。

采用改良的Franz 擴散池，以凝膠膏劑組為對照考察可溶性微針體外透皮性能。將1 片微針置于處理好的離體大鼠皮膚上，并施加20 N 的力，1 min后用醫用膠帶固定，其間需保證皮膚完整性。將皮膚固定在供給池與接受室連接處，角質層朝向供給池，真皮層與接受室連接，向接受室內注入生理鹽水6.5 mL，排凈氣泡以使接收液面與皮膚完全接觸； 另設1 組，皮膚不做任何處理，給予等量凝膠膏劑，貼敷在皮膚角質層上側，可溶性微針組、凝膠膏劑組分別平行3 次。固定供給池和接收室，將擴散池置于磁力攪拌器上，37 ℃恒溫水浴攪拌（轉速300 r/min），于透皮0、1、2、4、6、8、12、18、24 h 吸取接受液各1.5 mL，置于2 mL PVC 管中，同時補充等體積、等溫度生理鹽水，取樣液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，繪制累積滲透曲線，計算累積滲透率，公式為累積滲透率＝ （Qn/載藥量） ×100%，Qn＝ （Cn×V＋∑n-1i＝1Ci×V0） /S，其中Qn為第n個取樣點藥物單位面積累積滲透量，Cn為第n個取樣點接收液中藥物質量濃度，Ci為第i（i≤n-1） 個取樣點接收液中藥物質量濃度，V0為取樣體積 （1.5 mL），S為藥物有效透過面積 （2.8 cm2），V為接收池體積（6.5 mL），結果見圖5。

圖5 生物堿體外透皮曲線Fig.5 In vitro transdermal curves for alkaloids

由此可知，1 h 內可溶性微針組透過藥物量多于凝膠膏劑組，6 h 內累積滲透率大于50%，24 h內達91.4%，而凝膠膏劑組僅為41.8%； 可溶性微針組藥物累積滲透量明顯高于凝膠膏劑組，表明該制劑可有效刺進皮膚并經皮釋藥，還能明顯提高藥物經皮滲透效果。

2.6 模型擬合 分別采用零級、一級、Higuchi 方程對圖5 數據進行擬合，結果見表10。由此可知，可溶性微針滲透符合Higuchi 方程，而凝膠膏劑滲透符合零級方程； 兩者穩態透皮速率Jss分別為9.27、6.13，表明可溶性微針滲透性更強。

表10 模型擬合結果Tab.10 Results for model fitting

3 討論

課題組前期查閱文獻［19-20］ 發現，微針打開的通道能維持4～6 h，并且其背襯層藥物可沿該通道繼續釋放。因此，本實驗制備全載藥微針以快速建立有效血藥濃度，并在一定時間內維持穩定。

離體皮膚滲透結果顯示，與凝膠膏劑組比較，可溶性微針組給藥1 h 內滲透較快，累積滲透率達22%左右，1 h 后有所減緩，2 h 內累積滲透率達40%左右，之后在2～8、8～24 h 逐步減慢，但這2個時間段都比較平穩； 可溶性微針組6 h 內累積滲透率達50%以上，24 h 內基本釋放完全，釋藥過程符合 Higuchi 方程，累積滲透量達306.79 μg/cm2。由此可知，可溶性微針經皮給藥后藥物可在較短時間內快速透過皮膚，并且針尖藥物釋放完后背襯層可繼續釋藥，以期維持一定的藥物濃度，從而達到持續治療的作用。

另外，硫酸軟骨素是目前常用的可溶性微針基質材料，已被日本和歐洲批準用于治療骨性關節炎［21-23］。因此，本實驗選擇硫酸軟骨素作為雪上一枝蒿生物堿可溶性微針的基質，從而達到“藥輔合一” 的效果。