基于液質聯用技術比較郁香忍冬花蕾與金銀花化學成分

金 瑩，熊樂文，蒲高斌，張 芳，李 佳，張龍霏，張永清

（山東中醫藥大學，濟南 長清 250300）

金銀花來源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花［1］，含有酚酸類、黃酮類、環烯醚萜類等成分［2］，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理活性［3］，是中醫臨床清熱解毒的首選藥物。郁香忍冬LonicerafragrantissimaLindl.et Paxt.為半常綠或有時落葉灌木，與忍冬同為忍冬亞屬，親緣關系較近。有研究表明，郁香忍冬花中含有綠原酸［4］等成分，而此類成分與抗炎、抗氧化活性［5］相關，推測郁香忍冬花蕾具有一定藥用價值，但目前對郁香忍冬的研究主要集中在花粉萌發、栽培技術、資源分布、耐鹽性等方面［6-10］，化學成分種類及含量的研究報道較少。本實驗對郁香忍冬花蕾與金銀花化學成分進行了系統的比較研究，以評估郁香忍冬花蕾的藥用價值，為其植物資源開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC/6230 型飛行時間液質聯用儀 （美國 Agilent 公司）； Agilent 1260 HPLC/6420 型串聯四極桿質譜儀（美國Agilent 公司）； LE204E 型、XS105DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； BAG-9246A型電熱鼓風干燥箱 （上海市齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 試劑 綠原酸（批號Y22M8K36544，純度≥98%）、隱綠原酸 （批號M06GB147634，純度≥98%）、新綠原酸 （批號D23GB172337，純度≥98%）、異綠原酸A （批號Z05M10X87215，純度≥98%）、異綠原酸B （批號P17N11L131404，純度≥98%）、異綠原酸C （批號Y03S10H95976，純度≥98%）、咖啡酸（批號Y09J8C28349，純度≥98%）、原兒茶酸 （批號H21J9Z64031，純度≥98%）、阿魏酸 （批號 L03A9D57744，純度≥98%）、木犀草苷 （批號Y13J10H93050，純度≥98%）、木犀草素（批號C29N10Q104574，純度≥98%）、金絲桃苷（批號J16GB143379，≥98%）、蘆?。ㄅ朤27F10Z81699，純度≥98%）、槲皮素（批號O29HB199514，純度≥98%）、馬錢酸（批號M07HB177364，純度≥98%）、馬錢子苷（批號J29GB156028，純度≥98%）、斷馬錢酸 （批號S28HB196435，純度≥98%）、斷氧化馬錢子苷（批號S11GB160646，純度≥98%）、獐牙菜苷（批號O29GB166073，純度≥98%）、獐牙菜苦苷（批號M31HB181437，純度≥98%） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司； 甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自美國Fisher Scientific 公司； 純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 藥材 郁香忍冬花蕾及金銀花（大白期花蕾） 各8 批，采自山東中醫藥大學藥用植物園、濟南市植物園、山東中平藥業有限公司金銀花種植基地等，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為郁香忍冬LonicerafragrantissumaLindl.et Paxt.及忍冬LonicerajaponicaThunb.?；ɡ俨烧髸窀?，粉碎，過60 目篩，干燥器保存備用。8 批郁香忍冬花蕾分別編號1～8，8 批金銀花分別編號9～16。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取20 種對照品適量，分別用70% 甲醇溶解，使質量濃度分別為綠原酸507.6 μg/mL、新綠原酸8 μg/mL、隱綠原酸14 μg/mL、異綠原酸A 280 μg/mL、異綠原酸B 3 μg/mL、異綠原酸 C 130.2 μg/mL、咖啡酸1 μg/mL、原兒茶酸1 μg/mL、阿魏酸0.5 μg/mL、木犀草苷126 μg/mL、木犀草素1 μg/mL、金絲桃苷1 μg/mL、蘆丁120 μg/mL、槲皮素0.05 μg/mL、獐芽菜苷10 μg/mL、獐牙菜苦苷8 μg/mL、馬錢苷250 μg/mL、馬錢酸160.5 μg/mL、斷馬錢子酸525 μg/mL、斷氧化馬錢子苷30 μg/mL。

2.2 供試品溶液制備 精密稱定郁香忍冬花蕾與金銀花粉末0.2 g，精密加入70% 甲醇6 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷至室溫，70%甲醇補足減失的質量，取上清液，0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜和質譜條件

2.3.1 UPLC-TOF-MS 色譜： Hola C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）； 流動相0.08%甲酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～12 min，5% ～12% B； 12 ～32 min，12% ～15% B； 32 ～46 min，14% ～28% B； 46 ～65 min，28% ～95% B； 65 ～70 min，95% B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫25 ℃；進樣量3 μL。

質譜： 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子掃描；毛細管電壓正、負離子均為3 000 V； 氮氣體積流量8.0 L/min，溫度350 ℃； 碎片電壓175 V； 霧化器電壓35 psi （1 psi＝6.895 kPa）； 掃描范圍m/z50～1 500。

2.3.2 HPLC-QQQ-MS 色譜： Hola C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）； 流動相0.08%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～5 min，3% ～8%B； 5 ～15 min，8% ～16% B； 15 ～30 min，16% ～19% B； 30 ～40 min，19% ～27% B； 40 ～45 min，27% ～90% B； 45～50 min，90% B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量3 μL。

質譜： 電噴霧離子源； 正、負離子掃描； 多反應監測（MRM） 模式； 毛細管電壓正、負離子均為4 000 V； 氮氣體積流量11.0 L/min，溫度300 ℃； 霧化器壓力15 psi； 掃描范圍m/z100 ～1 200。20 種成分特征信息見表1，MRM 色譜圖見圖1。

圖1 20 種成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 20 components

表1 20 種成分特征信息Tab.1 Characteristic information of 20 components

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取“2.1” 項下對照品溶液，在“2.3.2” 項條件下進樣測定，連續進樣0.1、0.5、1、3、5、8 μL，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，以信噪比（S/N） 為3 和10 倍計算對照品檢測限（LOD） 及定量限（LOQ），結果見表2。

表2 20 種成分線性關系及加樣回收率Tab.2 Linear relationships and recovery rates of 20 components

2.4.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.2” 項條件下在1 d 內進樣測定6 次，計算日內精密度； 連續3 d 分別進樣，計算日間精密度；測得20 種成分RSD 均小于3.33%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一份本品適量，按“2.2” 項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.3.2” 項條件下進樣測定，測得20 種成分峰面積RSD 均小于3.37%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一份本品適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.3.2” 項條件下進樣測定，測得20 種成分峰面積RSD 均小于3.56%，表明室溫下溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品粉末6 份，精密加入適量對照品溶液，在“2.3.2” 項條件下進樣測定，計算回收率。結果見表2，20 種成分的平均加樣回收率為95.53% ～106.70%，RSD 為0.77% ～2.82%。

2.5 樣品成分鑒定與定量分析 取郁香忍冬花蕾及金銀花粉末，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1” 項條件下進行成分鑒定，在“2.3.2” 項條件下進行含量分析。每個樣品平行測定3 次。

2.5.1 成分鑒定 依據UPLC-TOF-MS 得到的準分子離子峰確定化合物分子量，依據碎片離子峰信息及部分對照品信息，結合PubChem 數據庫及相關文獻報道，從郁香忍冬花蕾及金銀花中共鑒定出52 種成分，包括25 種酚酸類、16 種黃酮類、11種環烯醚萜苷類。郁香忍冬花蕾及金銀花在正、負離子模式下的總離子流圖（TIC） 見圖2，各成分相關信息見表3。結果顯示，郁香忍冬花蕾與金銀花成分種類差異較小，僅有2 種酚酸類及2 種黃酮類成分為金銀花特有，分別為丁香酸、咖啡酸乙酯及槲皮素-3-O-木糖苷（瑞諾苷）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（煙花苷）。

圖2 郁香忍冬花蕾正（A） 負（B） 及金銀花正（C） 負（D） 總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of positive （A），negative（B） of LFL and positive （C），negative （D）of LJF

表3 郁香忍冬花蕾及金銀花中52 種成分鑒別結果Tab.3 Identification results of 52 components of LFL and LJF

2.5.2 郁香忍冬花蕾與金銀花成分含量測定 8批郁香忍冬花蕾及8 批金銀花成分含量測定結果見表4。結果顯示，郁香忍冬花蕾中20 種成分總含量明顯高于金銀花，如異綠原酸C、阿魏酸、木犀草苷、蘆丁，含量是金銀花的2 倍以上； 馬錢酸、馬錢苷含量分別是金銀花11.96、37.23 倍。同時，也有部分成分含量低于金銀花，如新綠原酸、異綠原酸B、金絲桃苷及槲皮素，含量低于金銀花含量的30%； 斷氧化馬錢子苷、獐牙菜苷及獐牙菜苦苷含量低于金銀花含量的50%。

表4 郁香忍冬花蕾和金銀花20 種成分含量測定結果（mg/g）Tab.4 Results for content determination of 20 components of LFL and LJF （mg/g）

2.6 多元統計分析

2.6.1 主成分（PCA） 分析 將郁香忍冬花蕾及金銀花中20 種成分的含量結果導入SIMCA 14.1 軟件，采用UV 檢測法建立基于主成分分析的非監督識別模型并進行主成分分析［11］。結果顯示，所建立模型的R2X為0.863、Q2為0.627。共得到3 個主成分，主成分1、主成分2、主成分3 的貢獻率分別為62.6%、17.2%、6.47%，累計方差貢獻率為86.3%，提示這3 個主成分蘊含了郁香忍冬花蕾及金銀花20 種成分含量86.3%的信息量，具有較好代表性［12］。PCA 得分（圖3） 顯示，郁香忍冬花蕾及金銀花可被明顯分開，提示郁香忍冬花蕾及金銀花以所測20 種成分含量為變量時具有顯著差異。

圖3 郁香忍冬花蕾及金銀花PCA 得分圖Fig.3 PCA score diagram of LFL and LJF

2.6.2 正交偏最小二乘判別（OPLS-DA） 分析 以郁香忍冬花蕾和金銀花20 種成分含量為變量建立OPLS-DA 模型，分析確定兩者差異成分。所建立模型的R2X為0.91，R2為0.983，Q2為0.963，均大于0.9，表明模型穩定且預測能力強［13］。OPLS-DA 得分見圖4，顯示郁香忍冬花蕾及金銀花可被顯著區分，分列模型左右兩側且組內聚集性強，進一步說明郁香忍冬花蕾及金銀花20 種成分含量存在顯著差異。

圖4 郁香忍冬花蕾及金銀花OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score diagram of LFL and LJF

為分析對分組貢獻較大的成分，建立載荷圖，見圖5。根據載荷圖中各柱狀圖絕對值的大小判斷其對郁香忍冬花蕾或金銀花樣品聚集性的影響，結果顯示，異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷、蘆丁、馬錢酸、馬錢苷及斷馬錢酸對郁香忍冬花蕾成分含量聚集性影響較大，而新綠原酸、隱綠原酸、斷氧化馬錢子苷及獐牙菜苷對金銀花成分含量聚集性影響較大。

圖5 郁香忍冬花蕾及金銀花柱狀載荷圖Fig.5 Column loading diagram of LFL and LJF

變量重要性投影（VIP） 值可反映每個變量對分組的貢獻，使用VIP≥1 作為邊界對所測定成分進行篩選［14］，得到了5 種與分類相關的成分，分別為馬錢苷、異綠原酸A、馬錢酸、蘆丁及斷馬錢酸，見圖6，提示該5 種成分為郁香忍冬花蕾與金銀花的關鍵差異成分。

圖6 郁香忍冬花蕾與金銀花OPLS-DA 模型VIP 值Fig.6 VIP predictive generated by OPLS-DA analysis of LFL and LJF

經置換檢驗，結果見圖7。左側置換R2值及Q2值均低于右側原始點，且置換Q2值的回歸直線與縱軸相交于負半軸，表明所建立的OPLS-DA 模型具有較高的擬合度和預測性［13］。

圖7 郁香忍冬花蕾與金銀花OPLS-DA 置換檢驗結果Fig.7 Results of OPLS-DA permutation tests of LFL and LJF

3 討論

通過UPLC-TOF-MS 對郁香忍冬花蕾與金銀花進行化學成分表征，共鑒定出共有成分48 種，未發現郁香忍冬特有、響應值較高且易分辨成分。金銀花有4 種特有成分，分別為丁香酸、咖啡酸乙酯、瑞諾苷和煙花苷，但其響應值較低，提示郁香忍冬花蕾與金銀花成分相似性較高。

結合文獻［15-17］ 報道，為了對忍冬屬植物主要成分進行更有效的提取，前期實驗分別考察了不同比例甲醇 （60%、70%、80%）、液料比（20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1） 對提取率的影響。結果表明，70%甲醇、液料比30 ∶1 時有效成分的綜合提取率最佳。HPLC-QQQ-MS 定量分析結果顯示，郁香忍冬花蕾的酚酸類、黃酮類及環烯醚萜苷類成分總含量明顯高于金銀花，尤其是綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷等2020年版《中國藥典》 金銀花質量控制成分，表明郁香忍冬具有重要的藥用開發價值。此外，郁香忍冬花蕾中阿魏酸、蘆丁、馬錢酸、馬錢苷4 種成分含量是金銀花的3 倍以上，而這些成分具有重要的藥理活性［18-22］，提示郁香忍冬花蕾某些藥理活性可能優于金銀花。

PCA 及OPLS-DA 得分圖均顯示，郁香忍冬花蕾及金銀花可依據20 種定量成分被明顯分成兩大類，說明二者存在顯著差異，提示郁香忍冬花蕾雖然具有一定的藥用價值，但不能作為金銀花的替代品使用。郁香忍冬花蕾個別樣品成分分布較為分散，可能與種質和生長環境等有關。

郁香忍冬分布廣，其花期較長、花朵繁密。目前主要作為園藝作物種植，適應性較強，可廣泛進行引種。但如何使其藥用價值得到充分開發，還需要進一步研究。