基于IKKβ/NF-κB 通路探討溫膽湯對睡眠障礙小鼠的神經保護作用

李 莉，劉 茹，何 晶，陳 云，郭 娟，紀 可，劉 玲

（湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

睡眠障礙是常見的身體功能障礙，表現為睡眠-覺醒過程中的各種功能紊亂，其中失眠較為常見［1］。睡眠障礙可導致認知能力下降和神經精神障礙，影響長期記憶形成并伴隨焦慮樣行為的產生［2］。我國有45.5% 人群存在睡眠問題，其中老年人占比高達56.7%［3］。因此，改善睡眠障礙對我國居民健康尤其是中老年人來說顯得尤為重要。

目前臨床治療睡眠障礙的藥物多為唑吡坦、艾司佐匹克隆、扎來普隆、褪黑激素等，部分藥物會導致嗜睡等不良反應，而中醫藥具有毒副作用小的特點［4-6］。溫膽湯由6 味中藥組成［7］，研究發現黃連和酸棗仁加味的溫膽湯對失眠有較好的療效［8］；溫膽湯配合認知-行為療法對慢性失眠痰熱內擾癥療效較好［9］； 溫膽湯含藥血清可抑制谷氨酸環境下星型膠質細胞凋亡［10］。睡眠障礙將直接導致大腦神經系統和神經元損傷，由此推測溫膽湯能夠修復睡眠障礙導致的神經損傷。本研究通過構建失眠小鼠模型，給予溫膽湯干預，觀察小鼠大腦皮層、海馬組織CA1 區、下丘腦的病理變化，檢測血清和腦組織中細胞因子的變化，并基于IκB 激酶β （IκB kinase-β，IKKβ） /核轉錄因子-κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 通路探討可能的作用機制，以期為溫膽湯緩解睡眠障礙提供一定的研究基礎。

1 材料

1.1 試劑 伊紅、中性樹脂、蘇木素、DAB 濃縮型試劑盒、封閉山羊血清（貨號E8090、G8590、G1140、DA1010、SL038，北京索萊寶科技有限公司）； 免疫組化試劑盒（貨號KIT-5020，福州邁新生物技術開發有限公司）； 尼氏染色液（貨號G1036，武漢賽維爾生物科技有限公司）； 白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素1β （interleukin 1β，IL-1β）、神經絲輕鏈 （neurofilament light chain，NEFL）、神經特異性烯醇化酶 （neuron specific enolase，NSE） 試劑盒、兔抗小鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、GAPDH抗體、山羊抗兔二抗（貨號MU30044、MU30030、MU30369、MU30977、MU30617、PAB32097、PAB36269、SAB43714，武漢貝茵萊生物科技有限公司）； S100 鈣結合蛋白B （S100 calcium binding protein B，S100B） 試劑盒（貨號JYM0833M，武漢基因美生物科技有限公司）； 戊巴比妥鈉（貨號P3761，美國Sigma 公司）； 兔抗小鼠IKKβ、NFκB、p-IKKβ、p-NF-κB 抗體 （ 貨號 ab178872、ab220803、ab38515、ab288751，英 國 Abcam公司）。

1.2 藥物 溫膽湯所用中藥飲片購自湖北省中醫院門診中藥房，并經劉玲教授鑒定為正品； 艾司唑侖片（規格1 mg/片，批號H42021522，華中藥業股份有限公司），將1 片艾司唑侖片溶于167 mL水，配制成6 μg/mL 的溶液。

1.3 儀器 DM1000 型顯微鏡、RM2235 型切片機（德國徠卡公司）； DHG-9023A 型恒溫烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）； TKD-TK 型攤片烤片機、TKD-TSF 型自動組織脫水機（湖北康強醫療器械有限公司）； TB-718L 型包埋機、TB-718D 型生物組織包埋機（湖北泰維科技實業股份有限公司）；352 型酶標儀 （芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）； AC-8 型洗板機（美國Thermo Labsystems 公司）； JM-A3002 型電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）； 旋轉型睡眠剝奪儀（自制）。

1.4 動物 30 只雌性昆明小鼠，SPF 級，4 ～5 周齡，體質量20～25 g，購自三峽大學動物實驗中心［實驗動物生產許可證號SCXK （鄂） 2018-0012］。小鼠飼養條件為溫度20 ～26 ℃，相對濕度40% ～70%，自由飲水。本實驗經武漢華聯科生物技術有限公司動物倫理委員會審查通過（倫理號HLK-20190301-001）。

2 方法

2.1 溫膽湯制備 溫膽湯由半夏6 g、竹茹6 g、麩炒枳實6 g、陳皮9 g、炙甘草3 g、茯苓4.5 g 組成，每劑含生藥34.5 g。第1 次煎煮加8 倍量水，煮沸后煎40 min，過濾取汁，第2 次煎煮加6 倍量水，煮沸后煎30 min，過濾取汁，合并2 次濾液，濃縮，配制成生藥量0.5、2 g/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 睡眠障礙小鼠模型構建 通過改良版水平轉盤睡眠剝奪法構建失眠小鼠模型［11］。使用亞克力塑料板制作睡眠剝奪箱（110 cm×60 cm×40 cm），其底部固定有15 個圓柱形平臺（直徑6.5 cm，高8 cm），保持10 cm 縱向間距，13 cm 橫向間距，注入23～25 ℃水至平臺下1 cm 處，保持水溫。適應性培養7 d 后，將小鼠放置于睡眠箱平臺上進行站立訓練，當其即將進入睡眠時，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各休息1 次，每次30 min，共訓練14 d。造模期間，每2 d 記錄1 次小鼠行為學改變（精神狀態、飲食）、毛發和體質量，給藥后每天記錄1次小鼠行為學改變。

2.3 分組及給藥 24 只小鼠按“2.2” 項下方法構建睡眠剝奪模型，造模成功后隨機分為模型組、艾司唑侖片組和溫膽湯低、高劑量組，每組6 只，另選6 只正常飼養的小鼠為對照組。艾司唑侖片組灌胃0.15 mg/kg 艾司唑侖片藥液，溫膽湯低、高劑量組灌胃12.5、50 g/kg 溫膽湯藥液，對照組小鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，共7 d，灌胃體積0.5 mL。

2.4 取材 最后1 次給藥12 h 后，眼眶采血0.5～1 mL，離心后收集血清。100 mg/kg 戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠，收集小鼠腦組織，一半于4%甲醛中固定，另一半于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.5 ELISA 法檢測血清及腦組織NEFL、NSE、S100B、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 按照ELISA 試劑盒說明書，分別檢測小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.6 HE 染色觀察大腦皮層、海馬組織CA1 區、下丘腦病理變化 取固定好的小鼠腦組織，切取適宜大小，浸蠟包埋，制備病理切片，切片脫蠟，經蘇木精染色3 ～6 min，促藍液返藍5 ～10 s，0.5%伊紅染色2～3 min，脫水固封后，于顯微鏡下拍照并采集圖像。

2.7 免疫組化染色觀察小鼠腦組織星形膠質細胞損傷情況 取小鼠腦組織切片，二甲苯脫蠟后水化，檸檬酸鈉高壓修復，30% H2O2孵育消除內源性過氧化物酶活性，血清封閉，加GFAP 一抗孵育過夜，滴加二抗孵育，DAB 染色，蘇木素復染細胞核，1%鹽酸乙醇分化，脫水，封片，于顯微鏡下觀察GFAP 陽性表達并拍照，使用Image J 軟件分析平均光密度。

2.8 尼氏染色觀察小鼠腦組織神經元損傷情況 取小鼠腦組織切片，脫蠟，尼氏染液染色2 ～5 min，0.1%冰醋酸稍分化，脫水，透明，樹膠封固，于顯微鏡下觀察小鼠腦組織神經元損傷情況。

2.9 Western blot 法檢測腦組織GFAP、p-IKKβ、p-NF-κB 蛋白表達 取適量腦組織，剪碎后加入RIPA 裂解液，裂解充分后提取總蛋白，BCA 法進行蛋白質定量。上樣進行SDS-PAGE 電泳，將蛋白濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，洗膜后加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，ECL 顯影，曝光。使用Image J 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。

2.10 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 溫膽湯對睡眠障礙小鼠一般情況的影響 如圖1A 所示，實驗開始第7 ～15 天，隨著小鼠睡眠障礙時間的增加，其體質量逐漸降低； 在溫膽湯給藥后第2 天（實驗開始第17 天），溫膽湯各劑量組小鼠體質量均高于模型組（P＜0.05）。給藥7 d后，與模型組比較，溫膽湯高劑量組小鼠體質量增加（P＜0.01），見圖1B。通過觀察21 d 各組小鼠精神狀態、飲食和毛發，發現睡眠障礙小鼠在給藥前精神狀態較差、毛發光澤較差、飲食減少； 給藥后，溫膽湯低、高劑量組小鼠精神狀態、毛發和飲食情況都有所改善，結果表明溫膽湯能夠改善睡眠障礙導致的小鼠狀態異常。

圖1 溫膽湯對睡眠障礙小鼠體質量的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Wendan Decoction on body weight of sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.2 溫膽湯對睡眠障礙小鼠炎癥反應的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清和腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均升高 （P＜0.01）；與模型組比較，溫膽湯各劑量組血清和腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯具有抑制睡眠障礙小鼠炎癥反應的作用。

圖2 溫膽湯對睡眠障礙小鼠血清和腦組織炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）Fig.2 Effects of Wendan Decoction on serum and brain inflammatory factors in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.3 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦損傷標志物水平的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B 水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠血清和腦組織NEFL、NSE、S100B 水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯能夠緩解睡眠障礙小鼠的神經系統損傷。

圖3 溫膽湯對睡眠障礙小鼠血清和腦組織腦損傷標志物水平的影響（±s，n＝6）Fig.3 Effects of Wendan Decoction on serum and brain brain injury markers in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.4 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織病理變化的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠大腦皮層組織中神經元細胞核皺縮變形，細胞排列雜亂，核染色加深，核仁消失； 海馬CA1 區組織中神經元細胞數目減少，CA1 區細胞排列不緊密，水腫明顯； 下丘腦組織神經細胞固縮變形，組織基質疏松、呈網狀結構。與模型組比較，隨著溫膽湯劑量的增加，變形的神經細胞逐漸減少，深染固縮的細胞核形態變少，排列紊亂現象減少； 神經元細胞數量增多，細胞排列整齊，結構逐漸清晰； 下丘腦組織基質網狀結構減少。溫膽湯高劑量組腦組織病理改善效果接近于艾司唑侖片組。以上結果表明，溫膽湯對于睡眠障礙小鼠腦組織病理改善具有良好的效果。

圖4 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織病理變化的影響（×200）Fig.4 Effects of Wendan Decoction on cerebral pathological changes of sleep disorders mice （×200）

3.5 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織GFAP 表達的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織中星形膠質細胞GFAP 表達增多（P＜0.01）；與模型組比較，溫膽湯各劑量組GFAP 表達降低（P＜0.01），表明溫膽湯具有抑制睡眠障礙小鼠腦組織星形膠質細胞GFAP 活化的作用。

圖5 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織GFAP 表達的影響（±s，n＝6）Fig.5 Effects of Wendan Decoction on cerebral GFAP expression in sleep disorders mice （±s，n＝6）

3.6 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織神經元的影響 如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織尼氏小體數減少； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠腦組織尼氏小體數增多。此外，與對照組比較，模型組小鼠腦組織神經元細胞數減少，細胞排列出現混亂，細胞輪廓不清晰； 與模型組比較，溫膽湯高劑量組小鼠腦組織神經元細胞數增多，細胞排列整齊，輪廓不清晰的細胞數減少。以上結果表明，溫膽湯具有保護腦組織神經元受損的作用。

圖6 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織神經元的影響（×200）Fig.6 Effects of Wendan Decoction on brain neurons in sleep disorders mice （×200）

3.7 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織IKKβ/NF-κB通路活化的影響 如圖7 所示，與對照組比較，模型組小鼠腦組織IKKβ 和NF-κB 蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，溫膽湯各劑量組小鼠腦組織IKKβ 和NF-κB 蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.01），表明溫膽湯能夠抑制睡眠障礙小鼠腦組織中IKKβ/NF-κB 通路的活化。

圖7 溫膽湯對睡眠障礙小鼠腦組織IKKβ/NF-κB 通路活化的影響（±s，n＝6）Fig.7 Effects of Wendan Decoction on activation of cerebral IKKβ/NF-κB pathway in sleep disorders mice （±s，n＝6）

4 討論

本研究結果顯示，經溫膽湯給藥后睡眠障礙小鼠大腦皮層、海馬組織CA1 區、下丘腦組織病變均有所改善，提示溫膽湯具有改善神經損傷的作用。此外，溫膽湯給藥后星形膠質細胞GFAP 活化受到抑制。研究表明，星形膠質細胞GFAP 活化與中樞神經系統疾病密切相關［12］。在頭針聯合中藥對缺血性腦卒中失眠大鼠的研究中同樣發現，睡眠改善后GFAP 也隨之減少［13］。本研究結果顯示，睡眠障礙小鼠經溫膽湯給藥后尼氏小體數量增多，GFAP 表達受到抑制，提示溫膽湯能夠保護睡眠障礙小鼠的神經元。

研究表明，慢性失眠患者血清NfH、NfL、NSE、S100B 水平升高，這些指標提示存在神經元、星形膠質細胞、神經末梢等腦微結構損傷［14］。本研究結果顯示，在睡眠障礙小鼠血清和腦組織中腦組織損傷標志物NEFL、NSE、S100B 水平均升高，此外本研究發現炎癥因子的水平也升高，結合兩者的變化可以認為睡眠障礙導致了腦組織出現炎癥反應，炎癥反應又引起了腦組織損傷。經溫膽湯給藥后，NEFL、NSE、S100B 和炎癥因子水平均降低，提示溫膽湯可通過降低睡眠障礙導致的炎癥反應以及腦組織損傷和神經元信號轉導的標志物的過度表達來調緩解腦損傷。

炎癥反應受到多種通路的調節，其中NF-κB通路的研究最為深入［15-16］。IκB 的降解介導NF-κB信號通路的激活，IκB 激酶（IKK） 復合物可促進IκB 的磷酸化［17］。NF-κB 一旦被激活，大量炎性因子的釋放會加重神經損傷［18］。研究表明，IKKβ/NF-κB 信號通路的激活與神經炎癥反應密切相關［19-20］。Douglass 等［21］發現，抑制IKKβ/NF-κB信號通路的激活能夠保護小鼠免受下丘腦炎癥損傷。Fei 等［22］發現，阻斷IKKβ/NF-κB 信號通路能夠抑制神經元的凋亡和炎癥反應，從而改善脊髓損傷。本研究結果顯示，睡眠障礙小鼠腦組織中IKKβ/NF-κB 通路被激活，而經溫膽湯給藥后，IKKβ/-NF-κB 通路受到抑制，提示溫膽湯可能通過抑制IKKβ/NF-κB 通路來抑制炎癥反應，減輕神經損傷。

綜上所述，本研究發現溫膽湯可改善睡眠障礙小鼠腦組織病變，并可能通過抑制IKKβ/NF-κB 通路的激活減少腦組織中炎癥的發生，最終發揮修復睡眠障礙小鼠神經損傷的作用。