碧雪散制備工藝優化

劉梓琛，吳 飛，郎 卿，林 曉，*

（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203； 2.上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203； 3.上海市浦東新區北蔡社區衛生服務中心中醫科，上海 201204）

相較于其他傳統中藥劑型，散劑制備工藝簡便，但也需遵循一定原則，主要分為干燥、粉碎、過篩、混合、分劑量等環節。從關鍵質量屬性角度來說，散劑重點要求含量均勻，色澤一致，故混合是關鍵操作，其傳統方式有過篩混合、研磨混合（等量遞增法和打底套色法等）、混合筒混合等。

碧雪散由石膏、人中白、冰片、青黛、硼砂、腰黃、朱砂組成，方中朱砂具有清心鎮驚、安神解毒功效，雄黃具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧作用，兩者常用于用于瘡瘍腫毒、咽喉腫痛、口舌生瘡的治療［1-3］，不僅在處方中屬于顏色特殊的成分，也有著一定毒性［4-5］，故在制備工藝中混合步驟尤為關鍵，其均一性不僅會影響品質，更會影響安全性。因此，本實驗在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken 響應面法優化碧雪散制備工藝，以期為其他中藥散劑研究提供參考。

1 材料

FA2104N 型電子分析天平（0.1 mg，上海精密科學儀器有限公司）； XP205 型電子分析天平［0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； SQP 型電子分析天平［0.01 g，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； DFY-1000 型多功能高速中藥粉碎機（搖擺式，溫州頂歷醫療器械有限公司）； EML200 Digital PlusT 型干式振動篩（德國Haver＆Boecker 公司）； SK7210HP 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）； TGL-18C 型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）； RRM Mini-Ⅱ型三維混合器（德國JEngelsmann 公司）； ADCI-60-C 型實用型色差儀（北京市辰泰克儀器有限公司）； 沃特世Alliance e2695 型高效液相色譜儀，配置PDA 檢測器和Empower 3 化學工作站［沃特世科技（上海） 有限公司］； 安捷倫7890A 型氣相色譜儀，配置自動進樣器ALS、FID 檢測器和Chemstation 化學工作站（美國安捷倫公司）； Quanta 250 FEG 型掃描電鏡（荷蘭Philips 公司）； Malvern 2000 型激光粒度儀（英國馬爾文公司）； 標準藥典篩（杭州三思儀器有限公司）； BT-1000型粉體綜合特性測試儀（丹東市百特儀器有限公司）。

冰片（批號200111）、炒硼砂（批號210608）、石膏（批號210701）、人中白 （批號190722）、青黛 （批號210421）（上?？禈蛩帢I有限公司）； 朱砂（批號20210410，上海養和堂中藥飲片有限公司）； 雄黃（批號2012090346，上海雷允上中藥飲片廠），均經專家鑒定為正品。碧雪散（自制，批號221001）。靛藍（批號110716-200610）、靛玉紅（批號110717-200204）、龍腦（批號110881-201709） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）。N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、甲醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）； 水為純水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 散劑制備

2.1.1 粉碎 將人中白、青黛和硼砂分別粉碎成細粉，雄黃和朱砂水飛成極細粉，石膏和冰片混合粉碎成細粉。其中，人中白粉碎至細粉后在100 ℃下溫浸8 h，80 ℃下干燥4 h，過篩，備用。

2.1.2 混合 目前，常用的混合方式有2 種，即直接混合法和等量遞增法，前者是直接混合工藝一次性全部投料，流程簡單，省時省力，但若處方中存在多種顏色組分，則會出現顏色不均勻的現象，而后者對存在多種顏色組分的混合均一性更好。本實驗發現，直接混合法無法將散劑混合均勻，故選擇等量遞增法［6-7］。

2.2 取樣方法 采用傳統的五點法［8］，即在距離混合樣品四角1 cm 處的4 個點，以及混合樣品的中心點取樣。

2.3 混合均一性評價 散劑重點要求含量均勻，色澤一致，故本實驗以冰片中龍腦和青黛中靛藍、靛玉紅為含量均勻的評價指標； 采用色差計測定色差值，作為色澤一致的評價指標。采用五點取樣法進行取樣，測定色度值L、a、b 及靛藍＋靛玉紅、龍腦含量，以其RSD 為混合均一性的評價指標，其中前三者權重賦值分別為25、25、50，后兩者權重賦值分別為50、50，計算綜合評分Y，公式為Y＝色度值RSD×0.2＋（靛藍＋靛玉紅） 含量RSD×0.4＋龍腦含量RSD×0.4。

2.3.1 色差值測定 采用色差計［9］對顏色關鍵感官屬性進行客觀的數字化評價，其中L 代表亮度，是指色彩中的深淺、明暗程度，數值為0 ～100，0 表示黑色，100 表示白色； a 代表紅綠值，數值為-120 ～120，正值為紅，負值為綠，0 為中性色； b 代表黃藍值，數值為-120 ～120，正值為黃，負值為藍，0 為中性色。前期預實驗發現，每次測定時色度值b 的差異最大，而成型后的顏色也主要為藍色，故以其為主要指標進行評價。

2.3.2 HPLC 法測定靛藍、靛玉紅含量

2.3.2.1 對照品溶液制備 精密稱取靛藍、靛玉紅對照品適量，置于量瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺適量，溶解，制成兩者質量濃度分別為0.993、0.83 mg/mL 的貯備液，精密吸取適量，置于同一量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL 分別含兩者496.5、24.9 μg）。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取本品 （批號221001） 約0.3 g，精密稱定，置于磨口錐形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺30 mL，稱定質量，超聲（功率180 W，頻率53 kHz） 提取45 min，放冷，N，N-二甲基甲酰胺補足減失的質量，吸取1 mL 上清液，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.3.2.3 色譜條件 參考文獻［10］ 報道，QS-C18Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水（75 ∶25）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長289 nm； 進樣量10 μL。

2.3.2.4 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品（N，N-二甲基甲酰胺） 溶液適量，在“2.3.2.3” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3.2.5 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液（含靛藍496.5 μg/mL、靛玉紅24.9 μg/mL） 0.5、1、1.5、2 mL，置于量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，在“2.3.2.3” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y）對其質量濃度（X）進行回歸，得方程分別為Y＝3 225.5X＋663 373 （r＝0.998 7）、Y＝2 899.9X＋2 232.3 （r＝0.999 9），分別在9.93 ～496、0.498 ～24.9 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.2.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.2.3”項色譜條件下進樣測定6 次，測得靛藍、靛玉紅峰面積RSD 分別為0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.7 重復性試驗 取本品（批號221001） 6 份，按“2.3.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得靛藍、靛玉紅含量RSD 分別為1.8%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、4、8、16、24 h 在“2.3.2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得靛藍、靛玉紅含量RSD 分別為0.5%、1.7%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3 GC 法測定龍腦含量

2.3.3.1 對照品溶液制備 精密稱取龍腦對照品適量，置于量瓶中，乙酸乙酯溶解，即得 （該成分質量濃度為10.17 mg/mL）。

2.3.3.2 供試品溶液制備 精密稱取本品粉末0.3 g，置于10 mL 量瓶中，乙酸乙酯溶解，超聲處理，過濾，乙酸乙酯定容至刻度，即得。

2.3.3.3 色譜條件 DM-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進樣體積1.0 μL； 分流比20 ∶1； 進樣口溫度180 ℃； 載氣氮氣，體積流量1.0 mL/min； 恒流模式； 柱溫140 ℃； 檢測器溫度250 ℃； 尾吹氣氮氣-氫氣-空氣（25 ∶30 ∶400）。

2.3.3.4 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品（乙酸乙酯） 溶液適量，在“2.3.3.3” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖2。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 龍腦GC 色譜圖

2.3.3.5 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液0.025、0.05、0.25、0.50、0.75、2.50 mL，置于5 mL 量瓶中，乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，定容，在“2.3.3.3” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y＝720.84X-10.01（r＝1.000 0），在0.10～10.17 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.3.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.3.3”項色譜條件下進樣測定6 次，測得龍腦峰面積RSD 為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.7 重復性試驗 取本品（批號221001） 6 份，按“2.3.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.3.3” 項色譜條件下進樣測定，測得龍腦峰面積RSD 為1.1%，表明該方法重復性良好。

2.3.3.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、24 h 在“2.3.3.3” 項色譜條件下進樣測定，測得龍腦峰面積RSD 為2.4%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4 單因素試驗

2.4.1 粉末加入順序 按表1 順序加入組方藥材粉末，計算綜合評分，結果見圖3。由此可知，順序A 綜合評分最低，表明混合最均勻。

表1 粉末加入順序

圖3 粉末加入順序對綜合評分的影響

2.4.2 混合轉速 混合轉速會對物料混合狀態及最終的混合均勻度產生影響［11］。采用等量遞增法，將組方藥材粉末分別在混合轉速25、30、35、40 r/min 下混合，每次20 min，平行5 份，計算綜合評分，結果見圖4。由此可知，隨著混合轉速增加綜合評分先降后升，為35 r/min 時最低。

圖4 混合轉速對綜合評分的影響

2.4.3 混合時間 采用等量遞增法，將組方藥材粉末以35 r/min 混合轉速按順序A 混合3 次，每次混合時間分別為10、20、30、40 min，平行5 份，計算綜合評分，結果見圖5。由此可知，隨著混合時間延長綜合評分降低，在20 min后程度趨緩。

2.4.4 填充率 填充率會對混合均一性產生影響［11］。采用等量遞增法，將組方藥材粉末以35 r/min 混合轉速混合20 min，填充率分別為5%、10%、15%、20%、25%，平行5 份，計算綜合評分，結果見圖6。由此可知，填充率增至20%后綜合評分升高，其原因可能是混合設備功率較小，動力不足，導致填充率較低時混合桶中的物料未得到充分混合，從而出現不均勻的現象。

圖6 填充率對綜合評分的影響

2.4.5 響應面法 在單因素試驗基礎上，以混合時間（A）、混合轉速（B）、填充率（C） 為影響因素，色度值RSD 及靛藍＋靛玉紅、龍腦含量RSD 的綜合評分（Y） 為評價指標，進行三因素三水平設計［12］，結果見表2。

表2 響應面法設計與結果

對表2 數據進行擬合，得二次二項式方程為Y＝5.35-0.557 5A＋0.381 2B＋0.38C- 0.072 5AB- 0.957 5AC＋0.425 0BC-0.373 0A2-0.090 5B2-1.23C2（R2＝0.851 1），方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； AdjR2為0.659 7，表明模型擬合程度良好； 失擬項P＞0.05，表明模型誤差較??； 因素A、AC、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。響應面分析見圖7。

表3 方差分析結果

圖7 各因素響應面圖

2.4.6 驗證試驗 采用Design-Expert 軟件，確定最優工藝為混合時間20 min，混合轉速35 r/min，填充率10%?？紤]到工藝放大和生產成本，在上述優化工藝基礎上進行4 批驗證試驗，結果見表4，可知隨著填充率增加綜合評分升高，與單因素試驗結果一致。在實際生產過程中，增加填充率能大幅度節約生產成本，從而提高生產價值； 當填充率從10%增加到20%時，靛藍＋靛玉紅、龍腦含量RSD 均在4%左右，可滿足產品合格要求［13］。綜上所述，雖然最優水平組為1 號，但考慮到實際生產可行性，也可適當增加填充率。

表4 驗證試驗結果（n＝4）

2.5 散劑表征

2.5.1 物性參數 測定表4 各批樣品的休止角、卡爾指數、豪斯納比值、粒徑［14］，結果見表5。由此可知，各物性參數之間均無顯著差異（P＞0.05），表明該工藝穩定可行。

表5 物性參數測定結果（±s）

表5 物性參數測定結果（±s）

試驗號休止角/（°）卡爾指數豪斯納比值粒徑（d0.5）/μm粒徑（d0.9）/μm 1 41.30±0.010.451.8325.44±0.17128.37±3.73 2 41.00±0.030.461.8527.08±0.28128.75±1.56 3 42.00±00.481.9127.21±0.32129.12±3.21 4 41.00±00.471.8827.41±0.49130.30±4.67

2.5.2 微觀形貌 采用導電雙面膠將3 種工藝（物理混合法、直接混合法、等量遞增法混合） 所得樣品固定于電鏡載物臺上，通過濺射儀進行表面噴金，在20 kV 加速電壓下以掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察表面結構及物料混合狀態，結果見圖8。由此可知，物理混合法、直接混合法所制備的樣品粉末分布不均勻，表面結構不規整； 等量遞增法所制備的樣品粉末分布均勻，表面較光滑規整。

圖8 碧雪散SEM 圖

3 討論與結論

混合是制劑制備過程中非常重要的環節，其結果直接關系到制劑的外觀形態及內在質量，對多組分物質含量均一性意義重大［15］。含量均勻度［16-17］是反映制劑安全、穩定、可控、有效的重要指標，直接影響其臨床效果，而色差值［18］是直接反映樣品混合均一性的指標。隨著檢測技術不斷發展與進步，除化學成分含量外物理學參數也可作為混合均一性評價指標，如文獻［19］ 采用色差計測定青黛、白礬細粉及細粉混合物和復合粒子色度值，作為混合均一性評價指標； 文獻［20］ 選擇色度值作為小金丸質量均一性的評價指標。

本實驗發現，碧雪散最優混合工藝為混合時間20 min，混合轉速35 r/min，填充率10%，其混合均一性較好，再測定主要成分含量，可知藥效更穩定，安全性更高［21］，接著從物性參數、微觀表征方面分析驗證組之間的物性差異，結果無顯著差異。

散劑作為傳統劑型之一，臨床使用歷史悠久，療效也經過時間檢驗，但近來鮮有其制備工藝的報道。本實驗首次從色差值、化學含量、物性參數、微觀表征多角度來對碧雪散制備工藝進行優化，使其更具合理性同時增加了科學內涵，同時可為關于其他中藥散劑的相關研究添磚加瓦。