甘草聯合順鉑對H22 荷瘤小鼠腫瘤抑制作用及腎損傷保護作用

連小龍，張尚龍，鄧 毅，2*，張 楠，葉禮巧，馬趣環，3，楊志軍

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000； 3.甘肅省醫學科學研究院藥物研究所，甘肅 蘭州 730050）

順鉑作為臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛用于肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種實體瘤的治療［1］，因其具有的毒副作用，臨床使用受到嚴重的劑量依賴性限制，表現最為明顯的是腎毒性［2］。而腎損傷是順鉑腎毒性最常見和最嚴重的表現形式［3］，直接影響化療患者的療效和耐受性。故尋找化療藥的輔助藥物成為癌癥研究領域急需解決的熱點問題。

傳統中醫藥在輔助臨床用藥方面效果顯著且逐步廣泛應用。甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖［4］?，F代藥理學研究表明，甘草具有抗腫瘤、抑菌抗炎、抗病毒、調節免疫等作用。此外，據《本草正》 記載甘草“味至甘，得中和之性，有調補之功，故毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性”，為解毒“圣藥”。課題組前期研究表明，甘草能夠緩解順鉑誘導的機體急性毒性［5］。但甘草與順鉑聯合用藥在抗腫瘤中的研究較少，故本研究通過建立H22荷瘤小鼠模型，探討甘草對順鉑化療的增效及其腎毒性的保護作用，以期為甘草和抗腫瘤藥物的聯合應用提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雌雄各半的昆明種小鼠60 只，體質量（20±2） g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK （甘） 2020-0001。小鼠飼養于甘肅中醫藥大學SPF 級實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK （甘） 2020-0009，飼養環境溫度為23 ～25 ℃，相對濕度55% ～65%，自由飲水進食。實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過（倫理號2019-049）。

1.2 細胞株 小鼠H22肝癌細胞購自于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 試劑與藥物 甘草采自甘肅省酒泉市，經甘肅中醫藥大學藥學院中藥教研室馬曉輝鑒定為正品； 順鉑（批號1A0115B03），購自齊魯制藥有限公司。一抗B 細胞淋巴瘤2 （Bcl-2，批號C82721042103）、B 細胞淋巴瘤2 相關X 蛋白（Bax，批號12616090906）、二抗辣根過氧化酶標記的山羊抗兔抗體（HRP-IgG，批號CR2207031） 購自武漢賽維爾生物科技有限公司； 超氧化物歧化酶（SOD，批號20220505）、丙二醛（MDA，批號20220506） 試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 cobas-c-311 全自動生化分析儀（日本日立公司）； 3K15 臺式高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）； JBP5 包埋機（武漢俊杰電子有限公司）； RM2016 切片機（上海徠卡儀器有限公司）； E100 顯微鏡（日本Nikon 公司）； DZF-6210 真空干燥箱 （上海和呈儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立 取兩次傳代的H22肝癌細胞懸液，調整密度為1×106/mL，于小鼠右前肢腋窩下接種0.2 mL 細胞懸液，5 d 后可觸及結節表示建模成功［6-7］。

2.2 分組與給藥 將建模成功的荷瘤小鼠隨機分為模型組、順鉑組（3 mg/kg） 和順鉑聯合甘草低、中、高劑量組（3 mg/kg＋0.65、1.30、2.60 g/kg）。2020 年版《中國藥典》 記載甘草的常用劑量為2～10 g，依據體表面積換算法得到甘草0.65、1.30、2.60 g/kg 相當于0.5 倍、1 倍、2倍臨床用量（稱取粉碎后的甘草粉末置于圓底燒瓶中，加入10 倍量70%乙醇熱回流提取2 次，每次3 h，合并藥液，濃縮，在60 ℃、-0.07 MPa 條件下真空干燥，備用）。除模型組外，其余各組小鼠灌胃給予相應藥物，每天1 次，順鉑隔天腹腔注射1 次，連續給藥12 d。隔天測量瘤體長直徑和短直徑，計算腫瘤體積，末次給藥24 h 后，禁食不禁水，采血，剝離腫瘤組織和腎組織。

2.3 抑瘤率和腎臟指數 用生理鹽水清洗各組小鼠腫瘤組織和腎臟表面血漬后，稱定質量，分別計算抑瘤率和腎臟指數。公式為抑瘤率＝ ［（模型組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量） /模型組平均瘤質量］ ×100%，腎臟指數＝ （腎臟質量/體質量） ×100%。

2.4 血清BUN、Cr 水平檢測 采集的血液靜置2 h 后，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，收集血清，使用全自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、肌酐（Cr） 水平。

2.5 HE 染色 將剝離的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、石蠟包埋、切片，常規HE 染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤和腎臟的病理形態變化。其中腎臟的病理形態變化通過腎小管損傷（如腎小管擴張、破壞和腎小管壞死等） 百分比來評估。評分標準［8-9］為0% （正常） 計0分； 1% ～10%計1 分； 11% ～25% 計2 分； 26% ～45% 計3分； 46% ～75%計4 分； 76% ～100%計5 分。

2.6 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達 將各組小鼠石蠟包埋的腫瘤和腎組織脫蠟至水化，抗原修復，加入3%H2O2阻斷內源性過氧化物，用3%BSA 溶液在室溫下封閉30 min。加Bcl-2 （1 ∶500）、Bax （1 ∶400） 一抗4 ℃下孵育過夜。PBS 洗滌后，用辣根過氧化物酶（HRP） 標記的二抗在室溫下孵育50 min，DAB 顯色和蘇木精復染，封片，于顯微鏡下觀察，黃色或棕色沉積即為陽性表達。每張切片選取中央和四周共5 個區域，每個區域再隨機選取5 個視野，用Image J 軟件計算平均光密度值，分析Bcl-2、Bax蛋白表達。

2.7 腎組織SOD 活性和MDA 水平檢測 嚴格按照相關試劑盒說明書操作，采用WST-1 法檢測SOD 活性，TBA 法檢測MDA 水平。

2.8 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數據均以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 順鉑聯合甘草對腫瘤生長的影響 由表1 可知，與模型組比較，在第7 天后，順鉑組與順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05，P＜0.01）； 與順鉑組比較，在第9 天后，順鉑聯合甘草高劑量組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05，P＜0.01）。由表2 可知，與模型組比較，順鉑組和順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腫瘤質量降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積比較（±s，n＝12）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腫瘤體積/mm3第1 天第3 天第5 天第7 天第9 天第11 天模型組111.31±36.52546.03±112.53862.17±215.311 239.59±350.511 622.78±318.542 086.48±322.34順鉑組115.63±34.12491.65±98.16776.00±171.50929.89±261.26* 1 098.43±177.35**1 235.12±275.71**順鉑聯合甘草低劑量組119.96±24.95499.85±162.97760.31±275.03880.41±213.54* 1 093.35±225.31**1 194.83±372.36**順鉑聯合甘草中劑量組117.75±24.82487.60±143.11739.93±129.93864.16±169.08**946.76±205.94**1 067.93±304.16**順鉑聯合甘草高劑量組116.38±32.46475.64±95.22635.46±145.59*681.39±213.04**698.48±181.60**＃＃708.40±282.41**＃

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤質量和抑制率比較（±s，n＝12）

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤質量和抑制率比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腫瘤質量/mg抑制率/%模型組2 625.32±576.71—順鉑組1 591.71±373.37**39.37順鉑聯合甘草低劑量組1 462.96±367.14**44.27順鉑聯合甘草中劑量組1 205.10±361.19**＃54.10順鉑聯合甘草高劑量組1 007.14±213.28**＃＃61.64

3.2 順鉑聯合甘草對腫瘤組織病理形態學的影響 由圖1可知，模型組小鼠腫瘤組織細胞排列緊密且均勻，形態完整，周圍無壞死腫瘤細胞； 順鉑組和順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腫瘤組織細胞間隙較大，可見大量壞死的腫瘤細胞，細胞核碎裂、消失。

圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態變化（HE，×400）

3.3 順鉑聯合甘草對腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達的影響 由圖2～3、表3 可知，與模型組比較，順鉑組和順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腫瘤組織Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），Bax 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯合甘草高劑量組小鼠腫瘤組織Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），Bax 蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax 表達（×400）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達比較（±s，n＝12）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05。

組別Bcl-2Bax模型組0.48±0.060.21±0.02順鉑組0.34±0.05*0.30±0.05*順鉑聯合甘草低劑量組0.32±0.06**0.34±0.05**順鉑聯合甘草中劑量組0.31±0.05**0.36±0.03**順鉑聯合甘草高劑量組0.24±0.03**＃0.39±0.05**＃

3.4 順鉑聯合甘草對腎臟指數和血清BUN、Cr 水平的影響 由表4 可知，與模型組比較，順鉑組小鼠腎臟指數和血清BUN、Cr 水平升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腎臟指數和血清BUN、Cr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組荷瘤小鼠腎臟指數和血清BUN、Cr 水平比較（±s，n＝12）

表4 各組荷瘤小鼠腎臟指數和血清BUN、Cr 水平比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腎臟指數/%BUN/（mmol·L-1）Cr/（μmol·L-1）模型組1.09±0.349.52±1.5911.17±2.04順鉑組1.46±0.30**31.01±10.83**33.20±10.44**順鉑聯合甘草低劑量組1.17±0.14＃＃24.43±8.86＃25.43±7.59＃＃順鉑聯合甘草中劑量組1.04±0.09＃＃21.15±7.86＃＃21.55±6.36＃＃順鉑聯合甘草高劑量組0.96±0.08＃＃13.89±4.90＃＃16.19±4.23＃＃

3.5 順鉑聯合甘草對腎組織病理形態學的影響 由圖4 可知，模型組腎小管結構清楚，未見上皮細胞水腫及變性；順鉑組腎小管結構不清，細胞明顯濁腫，胞質疏松網狀化，細胞排列紊亂，部分小管管腔可見壞死、脫落細胞，出現腎小管擴張及蛋白管型； 順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腎臟病變有所改善，僅觀察到腎小管細胞輕度腫脹及空泡變性，管腔內有少量脫落的上皮細胞。與模型組比較，順鉑組小鼠腎損傷評分升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腎損傷評分降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 各組荷瘤小鼠腎組織病理形態變化（HE，×400，±s，n＝12）

3.6 順鉑聯合甘草對腎組織SOD 活性、MDA 水平的影響 由表5 可知，與模型組比較，順鉑組小鼠腎組織SOD活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯合甘草各劑量組小鼠腎組織SOD 活性升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01）。

表5 各組荷瘤小鼠腎組織中SOD 活性和MDA 水平比較（±s，n ＝12）

表5 各組荷瘤小鼠腎組織中SOD 活性和MDA 水平比較（±s，n ＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃＃P＜0.01。

組別SOD/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）模型組185.40±17.4414.74±2.01順鉑組116.58±27.64**20.85±2.69**順鉑聯合甘草低劑量組172.42±30.01＃＃13.72±2.41＃＃順鉑聯合甘草中劑量組189.19±18.53＃＃12.09±2.03＃＃順鉑聯合甘草高劑量組196.32±25.92＃＃12.86±4.07＃＃

4 討論

肝癌因已成為全球第三大癌癥死亡原因［10］，具有高隱匿性、高病死率、預后差等特征，其五年生存率約為14.1%［11］。肝癌的早期診斷困難并且病情發展迅速，故放化療成為主要的治療策略。但抗腫瘤藥物在滅殺腫瘤細胞時導致正常細胞凋亡引起的組織器官損傷是當前腫瘤治療中需突破的瓶頸。近年來，中藥因其副作用小、毒性小等優點，在抗腫瘤研究領域受到廣泛關注，特別是在輔助用藥方面。甘草素有“十方九草” 之說，是傳統中醫藥的常用中藥，也是“調和諸藥” 主要藥物，能夠緩解毒性藥物引起的毒性反應［12］，而與抗腫瘤藥物聯用的研究較少，本研究借助H22荷瘤小鼠模型，探討甘草和順鉑聯用后在化療中的“增效減毒” 作用。

目前，促細胞凋亡被認為是抗腫瘤最直接有效的方式。Bcl-2 家族蛋白與細胞凋亡密切相關，主要分為2類［13］，一類為促凋亡蛋白，包括Bax、Bad、Bid、Bik等； 另一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等。Bcl-2 蛋白是細胞凋亡的關鍵抑制劑，與Bax 結合形成Bax/Bcl-2 二聚體，增加細胞對凋亡刺激的敏感性［14］。因此，通過升高Bax 蛋白和降低Bcl-2 蛋白可以促進癌細胞凋亡［15］。本研究結果顯示，甘草與順鉑聯用較順鉑單用Bax 表達升高，Bcl-2 表達降低，表明甘草可以增強順鉑的抗腫瘤作用。

此外，攝入機體的順鉑主要積聚在腎臟中，會誘導腎細胞凋亡，臨床上最嚴重和更常見的表現是急性腎損傷［16］。本研究顯示，順鉑單用組荷瘤小鼠腎小管結構不清，胞質疏松網狀化，細胞排列紊亂，部分小管管腔可見壞死、脫落細胞，出現腎小管擴張及蛋白管型，腎功能生化指標（BUN、Cr） 升高，反映了腎組織受到損傷； 而與甘草聯用后，損傷有所改善。已有研究證實，氧化應激是順鉑毒性中最重要的機制之一［17］。正常生理狀態下，產生的自由基被細胞內抗氧化酶（如SOD） 消除，從而維持自由基產生和消除之間的平衡［18］。MDA 是脂質過氧化的最終產物，造成細胞凋亡［19］。順鉑可以增加超氧化物的產生并抑制SOD 活性，造成腎損傷［20］。本研究結果顯示，甘草與順鉑聯用較順鉑單用組小鼠腎組織中SOD 活性升高，MDA水平降低，表明甘草通過抑制順鉑引起的氧化應激，阻止細胞凋亡，與前期研究相一致［5］。

綜上所述，甘草與順鉑聯合用藥，可以增強順鉑的抗腫瘤作用且能預防其誘導的腎毒性，可能是一種有前途的順鉑臨床應用的輔助藥物，故對其增效和減毒作用機制的研究值得進一步探索。