七味通痹口服液對類風濕性關節炎模型大鼠腸道菌群的調節作用

童孝宇，高 霞，2＃，王佳佳，2，陳夏霖，2*，唐 明，曹 亮，2，李吉峰，3，章晨峰，王振中，2，肖 偉，2*

（1.江蘇康緣藥業股份有限公司，中藥制藥過程控制與智能制造技術全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001； 2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000； 3.江蘇康緣陽光藥業有限公司，江蘇 南京 210046）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA） 是一種常見的全身性慢性免疫疾病，其損害性主要由關節滑膜炎癥和血管翳形成引起，從而引發關節軟骨、軟骨下骨和韌帶等損傷，最終導致關節變形、僵直和功能喪失［1-2］。目前RA 的發病仍未被明確，遺傳因素、環境因素和免疫因素可能是其主要發病機制［3-5］。隨著16S 核糖體RNA （16S ribosomal RNA，16S rRNA） 高通量檢測技術的發展，腸道菌群作為影響類風濕性關節炎的重要因素之一，也逐漸被研究者們重視。研究表明，腸道微生物組對類風濕性關節炎、銀屑病關節炎和脊柱關節炎疾病的產生和治療存在一定影響［6］； 同時另一項報道表明，某些腸道菌群的存在可能影響自身免疫系統的功能，誘導炎癥細胞分化，分泌炎癥因子［7-8］，從而可能影響對自身免疫性疾病的易感性。七味通痹口服液是由螞蟻、青風藤、雞血藤、鹿銜草、石楠藤、千年健和威靈仙提煉制成的口服液，是臨床上有效治療肝腎虧虛、風濕阻絡引起的類風性關節炎的中藥復方口服液［9-10］。本研究旨在探討七味通痹口服液對類風濕性關節炎大鼠腸道菌群的影響，為基于腸道菌群治療類風濕性關節炎提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 七味通痹口服液（批號20180505） 由江蘇康緣陽光藥業有限公司提供。完全弗氏佐劑（complete Frund’s adjuvant，CFA，貨號F5881）、不完全弗氏佐劑（incomplete Frund’s adjuvant，IFA，貨號F5506） 均購自美國Sigma 公司； 牛Ⅱ型膠原（bovine type Ⅱcollagen，CⅡ，批號180559） 購自美國Chondrex 公司； 生理鹽水（批號1710240907） 購自華潤雙鶴藥業股份有限公司； 大鼠IL-17F （批號 68214951016）、IL-6 （批號 13314991016）、TNF-α （批號24014931016）、IL-1β （批號115141021016）ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物 SD 清潔級大鼠50 只，雌雄各半，體質量約200 g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場［實驗動物生產許可證號SCXK （蘇） 2017-0001］，飼養于江蘇康緣藥業股份有限公司［實驗動物使用許可證號SYXK （蘇） 2018-0026］，實驗過程符合江蘇康緣藥業股份有限公司實驗動物倫理委員會倫理要求（倫理號2018081403）。

2 方法

2.1 CⅡ-CFA 和CⅡ-IFA 乳劑制備 將牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 醋酸溶液中，制成4 mg/mL 的溶液，并置于4 ℃冰箱過夜。實驗當日使用研缽將CFA 或者IFA 與牛Ⅱ膠原等體積在冰上充分研磨使2 種溶液完全乳化，即得CⅡ-CFA 乳劑和CⅡ-IFA 乳劑，臨用前配制。

2.2 模型復制及給藥干預 隨機選擇10 只大鼠作為空白組，其余40 只大鼠用微量注射器于尾根部進行多點皮下注射CⅡ-CFA 乳劑，注射量為0.2 mL。于第1 次刺激7 d 后，在相同部位多點皮下注射CⅡ-IFA 乳劑加強免疫1 次，注射量為0.15 mL［11］，建立膠原誘導的關節炎 （collagen induced arthritis，CIA） 模型，距離第1 次免疫2 周后，關節炎評分≥4 分則認為模型建立成功。造模成功的大鼠隨機分為模型組和七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組6 只，七味通痹口服液低、中、高劑量組大鼠灌胃給予2.7、5.4、10.8 mL/kg 七味通痹口服液，正常組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續給藥21 d。給藥結束后，采集糞便樣品，每組隨機選取5 個樣本進行腸道微生物組學的16S rRNA 基因測序； 末次灌胃給藥1 h 后，解剖并獲取大鼠左右后足關節滑膜。

2.3 關節炎評價 第1 次免疫第7、11、14、21、28、34天對大鼠關節炎進行評分，檢測并記錄關節炎分值。采用0～4 級關節評分法，0 分為腳爪正?；驘o炎癥； 1 分為趾關節腫脹或輕度發紅； 2 分為趾關節和足跖發紅并且腫脹； 3分為踝關節以下的整個腳爪全部發紅并且腫脹； 4 分為踝關節嚴重發紅且腫脹，關節有變形跡象。

2.4 足趾容積檢測 以第1 次加強免疫當天為第0 天，于第7、11、14、21、28、34 天用大鼠趾體積測量儀測量大鼠左右足跖體積并記錄。計算其關節腫脹度，左右關節腫脹度的平均值作為大鼠的足腫脹度。

2.5 ELISA 法檢測大鼠關節腔滑膜組織中炎癥因子水平 滑膜組織加提取液后勻漿，離心取上清液，適當稀釋后，經上樣、孵育、洗板、封板，加入各底物顯色劑、終止液后上機檢測，按標準曲線法計算TNF-α、IL-17F、IL-6 及IL-1β 水平。

2.6 腸道微生物組學的16S rRNA 基因測序 大鼠糞便樣品提取的DNA 進行聚合酶鏈式反應（PCR） 擴增與產物純化，并進行PCR 產物定量與均一化，構建先導編輯文庫，進行測序。測序工作委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成?；贠TU 聚類分析結果進行多樣性指數分析、測序深度的檢測，基于分類學信息在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

2.7 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 七味通痹口服液對CIA 大鼠關節炎評分及足腫脹度的影響 與空白組比較，模型組大鼠關節炎評分及足腫脹度水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，七味通痹口服液高劑量組大鼠在給藥1 周后關節炎評分及足腫脹度水平降低（P＜0.05），對關節炎嚴重程度及足腫脹度具有改善效果，見圖1。

圖1 七味通痹口服液對CIA 大鼠關節炎評分及足腫脹度的影響（±s，n＝5～10）

3.2 七味通痹口服液對CIA 大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，七味通痹口服液各劑量組大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。結果表明，七味通痹口服液能夠調節CIA大鼠體內炎癥因子水平，從而發揮良好的療效。

圖2 七味通痹口服液對大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響（±s，n＝5～10）

3.3 七味通痹口服液對CIA 大鼠腸道菌群的影響

3.3.1 腸道菌群稀釋曲線和等級豐度線分析 樣本的稀釋性曲線趨于平緩，表明樣本所含OTU 數量趨于穩定，測序數據量合理，見圖3a； 各樣本Rank-Abundance 曲線的寬度較大且形狀較平緩，說明所測樣本的物種豐度較高，物種分布均勻，見圖3b。

圖3 各組大鼠腸道菌群的稀釋曲線（a） 及等級豐度線（b） （n＝5）

3.3.2 腸道菌群主坐標分析（PCoA） 及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 在PCoA 分析結果中，各組組間聚合度相對較差，但模型組與空白組分開度較好，七味通痹口服液各劑量組也逐漸趨于正常組，見圖4a； 在PLS-DA 分析結果中，空白組與模型組明顯分開，七味通痹口服液各劑量組更靠近正常組，說明七味通痹口服液給藥后菌群結構與正常大鼠更相近，見圖4b。結果表明七味通痹口服液能夠改善CIA 大鼠紊亂的腸道菌群結構。

圖4 各組大鼠腸道菌群PCoA （a） 和PLS-DA （b） 分析（n＝5）

3.3.3 腸道菌群組成分析 在菌門水平上，豐度＞0.1%的門有7 個，其中擬桿菌門 （Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門 （Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、迷蹤菌門（Elusimicrobiota）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobiota） 所占比例大于99%，其中擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門是最為豐富的門，見圖5a。厚壁菌門在模型組中最為豐富（豐度58.37%），但其在七味通痹口服液低、中、高劑量組中豐度降低（豐度27.99%、38.86%、42.28%），且逐漸接近空白組（豐度31.92%）； 擬桿菌門為模型組中第二豐富的菌門（豐度36.38%），在空白組和七味通痹口服液低、中、高劑量組中豐度為55.14% 及58.83%、47.22%、47.72%；變形菌門在空白組、模型組和七味通痹口服液低、中、高劑量組中的豐度分別為8.31%、0.49%、4.66%、6.77%、2.82%。在菌屬水平上，豐度＞0.1% 的屬有39 個，見圖5b。結果表明，七味通痹口服液能夠改善CIA 大鼠紊亂的腸道微生物組成。

圖5 各組大鼠在門水平（a） 和屬水平（b） 上的腸道菌群組成（n＝5）

3.3.4 腸道菌群的物種差異分析 本研究使用效應大小線性判別分析效應量（LEfSe） 來確定對觀察結果影響最大的分類群，將線性判別分析（LDA） 得分大于4 的菌群分類群定義為影響該組的重要物種，在各組樣本中共有25 種腸道菌分類群。在屬水平上，LEfSe 分析確定了毛螺菌屬（Lachnospiraceae） 是模型組大鼠腸道菌群中最重要的分類菌群，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae） 和梭狀芽孢桿菌屬（Clostridia） 是模型組大鼠腸道菌群中主要的分類菌群； 擬桿菌屬（Bacteroides） 是七味通痹口服液各劑量組大鼠腸道菌群中重要的分類菌群，見圖6。

圖6 各組大鼠腸道菌群LEfSe 多級物種層級樹圖（a） 及LDA 判別柱形圖（b） （n＝5）

如圖7 所示，與空白組比較，模型組大鼠與毛螺菌科相關的2 個菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及梭狀芽孢桿菌類（norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group）、普雷沃氏菌類（Prevotellaceae_UCG-001） 豐度均升高（P＜0.01），擬桿菌屬及異擬桿菌屬（Parabacteroides） 豐度均降低（P＜0.05）； 與模型組比較，七味通痹口服液低、中劑量組Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group豐度均降低（P＜0.05，P＜0.01），擬桿菌屬及異擬桿菌屬豐度均升高（P＜0.01），高劑量組Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及普雷沃氏菌類豐度降低（P＜0.01）。

圖7 各組大鼠屬水平上腸道菌群差異性分析（±s，n＝5）

對上述6 種菌屬和大鼠炎癥因子水平進行Pearson 相關分析，見圖8。由此可知，大鼠炎癥因子的產生與毛螺菌屬、梭狀芽孢桿菌屬及普雷沃氏菌屬的相對豐度呈現正相關性，表明這3 個菌屬主要參與了炎癥因子的產生； 同時也與擬桿菌屬及異擬桿菌屬的相對豐度呈現負相關性，表明炎癥因子的增加對兩者產生了抑制作用。

圖8 關鍵菌屬相對豐度與炎癥因子水平之間的相關性分析

4 討論

目前治療類風濕性關節炎主要使用緩解疾病的抗風濕藥物（DMARDS）、非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質激素和生物制劑［12-15］，這些藥物主要作用于RA 的炎癥反應和免疫反應，但同時也具有選擇性低和相關不良反應的特點，所以開發新的治療方案成了當下關注的重點。腸道菌群是一個復雜的生態系統，具有極高的細菌密度和多樣性［16］。有報道表明，腸道菌群的失調是導致RA 在內的多數免疫性疾病發病的誘因［17-18］； 同時部分腸道菌可誘導細胞因子產生免疫反應，引起腸道炎癥［19］。

本研究結果表明，CIA 大鼠給予七味通痹口服液后，大鼠關節炎評分、足腫脹度均降低，表明七味通痹口服液可以緩解類風濕性關節炎所引起的關節損傷； 同時CIA 大鼠關節腔滑膜組織中IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，這與之前的報道一致［20］，在給予七味通痹口服液后，CIA 大鼠關節腔滑膜組織中IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低，表明七味通痹口服液可以有效改善類風濕性關節炎所引起的炎癥反應。

本研究腸道菌群分析表明，在門水平上，CIA 大鼠腸道菌群中擬桿菌門和變形菌門豐度水平降低，厚壁菌門豐度水平升高。擬桿菌門和厚壁菌門被認為是類風濕性關節炎主要的相關菌，其中厚壁菌門中鏈球菌屬、芽孢桿菌屬及梭菌屬由于產生毒素、促進體內炎癥形成，被認為是主要的致病菌［17，19，21-22］； 同時毛螺菌科的豐度增加，可能引起其靶向噬菌體的過度增長，導致體內抗環瓜氨酸肽抗體水平提升，從而增加患類風濕性關節炎的風險［23］； 擬桿菌門中擬桿菌屬被認為是腸道菌中的益生菌，可以改善類風濕性關節炎引起的腸道損傷和菌群失調［24］。在CIA 大鼠腸道菌群中，擬桿菌屬豐度受到抑制，而厚壁菌門中毛螺菌屬豐度上升； 七味通痹口服液能使擬桿菌門和變形菌門豐度水平上升，厚壁菌門豐度水平下降，擬桿菌屬豐度水平上升，毛螺菌屬、梭狀芽孢桿菌屬及普雷沃氏菌屬豐度水平下降，表明七味通痹口服液能夠有效抑制致病菌，保護益生菌，從而改善腸道菌群的生態環境。

綜上所述，七味通痹口服液可以抑制炎癥因子分泌，改善腸道菌群生態環境，有效緩解類風濕性關節炎。