血滿草酸性多糖的化學修飾及其免疫活性研究

劉 瑜，劉浩博，鐘政昌，袁 雷

（西藏農牧學院，食品科學學院，西藏特色農牧資源省部共建協同創新中心，生物技術中心，西藏 林芝 860000）

多糖是中草藥的主要活性成分之一，因其在調節機體免疫［1］、抗腫瘤［2］、抗病毒［3］、降血糖［4-5］等方面表現出較好的生物功能而備受關注。而多糖的結構修飾對多糖生物活性也會產生重要的影響，通過結構修飾可提高多糖原有的生物活性或產生新的活性［6-7］。

血滿草SambucusadnataWall.又名血莽草、接骨草，為忍冬科接骨木屬多年生草本植物［8］，為我國民間常用藥材，在藏族、傣族、彝族、哈尼族等少數民族中有著悠久的用藥歷史，也是藏藥的藥源植物之一，其味辛，性溫，具有活血、通絡的功效，可用于治療急慢性腎炎、風濕疼痛、風疹瘙癢、慢性腰腿疼、扭傷瘀痛、骨折等［9］。血滿草含有萜類、黃酮類、木質素類等多種化學成分［10-11］，但對血滿草多糖化學修飾方面的相關研究未見報道。本課題組在前期研究過程中，從血滿草葉片中純化出一種均一性酸性多糖SPS-1［12］，本實驗以SPS-1 為原料，開展其硫酸化、羧甲基化和硒化修飾，并比較其修飾前后免疫活性的變化情況，為SPS-1 及其衍生物的深入研究奠定基礎。

1 材料

SPS-1 為實驗室自制； 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7、MTT 試劑購自武漢普賽諾生命科技有限公司； DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司；一氧化氮檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 脂多糖（LPS） 購自美國Sigma 公司； IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司； 溴化鉀（色譜純） 購自天津市光復精細化工研究所；N，N-二甲基甲酰胺、氯磺酸、鉻變酸、羥基乙酸、亞硒酸鈉等化學試劑均為分析純。

722N 紫外可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）； LGJ0.5 冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠）； i50 傅里葉變換紅外光譜儀、Multiskan MK3 酶標儀（美國Thermo公司）； MCO-15AC CO2恒溫培養箱（日本Sanyo 公司）；XS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

2 方法

2.1 硫酸化SPS-1 （SSPS-1） 制備及其取代度測定 SPS-1硫酸化修飾產物SSPS-1 的制備參照袁雷等［13］的方法進行，1 mol/L HCl 水解SSPS-1 后，采用氯化鋇-明膠法［14］測定硫酸基含量，并按公式（1） 計算取代度DS。

式中：S%為硫含量。

2.2 羧甲基化SPS-1 （CSPS-1） 制備及其取代度測定 采用氫氧化鈉-氯乙酸法［15］開展SPS-1 的羧甲基化修飾。稱取150 mg SPS-1 樣品，加入25 mL 異丙醇，攪拌30 min 后加入2.98 g NaOH，攪拌1 h，緩慢加入2.51 g 氯乙酸，60 ℃反應4 h，調pH 至中性，透析濃縮，冷凍干燥得羧甲基化多糖CSPS-1。由于SPS-1 為酸性多糖，羧基的存在對羧甲基含量測定有一定影響，因此，用0.25 mol/L NaOH 分別配制1 mg/mL SPS-1 和CSPS-1 溶液，并采用鉻變酸法［16］分別測定其羧甲基的含量，并按公式（2） 計算DS。

式中：A2為每克CSPS-1 樣品相當于羥基乙酸的量，A1為每克SPS-1 樣品相當于羥基乙酸的量，76 為羥基乙酸摩爾質量，59 為CH2COOH 摩爾質量。

2.3 硒化SPS-1 （SeSPS-1） 制備及硒含量測定 SPS-1 的硒化修飾參照程爽等［17］的方法并稍作修改。稱取SPS-1 150 mg 于燒杯中，加入25 mL 蒸餾水溶解，加入1 mL 冰醋酸，再加入溶于少量蒸餾水的150 mg 亞硒酸鈉和0.65 g 氯化鋇，60 ℃下攪拌反應6 h。反應結束后，滴加硫酸鈉并離心除去多余Ba2＋，將上清液透析后濃縮凍干，得硒化多糖SeSPS-1。SeSPS-1 的硒含量參照李世杰［18］的方法測定。

2.4 紅外光譜分析 溴化鉀與適量的SPS-1、SSPS-1、CSPS-1 和SeSPS-1 混合后，壓片，在4 000 ～400 cm-1波數范圍內測定其紅外光譜。

2.5 均一性和分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC） 測定SPS-1、SSPS-1、CSPS-1 和SeSPS-1 的均一性和分子量。質量濃度1 mg/mL 的SPS-1 及其衍生物溶液，經0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣測定，流動相水； 體積流量1.0 mL/min； 溫度25 ℃； 進樣量20 μL。

2.6 免疫活性研究

2.6.1 細胞培養 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 培養于DMEM 培養基（含有10% 胎牛血清和100 U/mL 青霉素-100 μg/mL鏈霉素雙抗） 中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。

2.6.2 細胞增殖率測定 采用MTT 法測定SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 對 RAW264.7 細胞增殖的影響。將RAW264.7 細胞按5.0×103個/mL 接種于96 孔細胞培養板中，加入不同質量濃度的SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1（12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL），用培養基處理的細胞作為空白對照，每組設置3 個復孔。培養24 h 后，加入10 μL MTT，37 ℃孵育4 h，吸出培養基，PBS 潤洗3 遍，加入150 μL DMSO 振蕩10 min，于568 nm波長處檢測光密度（OD） 值。按下式（3） 計算細胞增殖率。

式中：A為樣品處理組的光密度值，B為空白對照組的光密度值。

2.6.3 NO、IL-6、IL-1β、TNF-α 測定 將RAW264.7 細胞以5×105/孔的密度接種于6 孔板中，加入200、400、800 μg/mL SPS-1、SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1，以正常細胞為空白對照，1.0 μg/mL LPS 處理組為陽性對照，每組設置3 個復孔。培養24 h 后，收集細胞培養液，按照NO 檢測試劑盒說明書檢測NO 水平，按照ELISA 檢測試劑盒提供的方法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 水平。

3 結果

3.1 硫酸基、羧甲基取代度和硒含量測定 以硫酸根離子質量濃度為橫坐標（X），以硫酸鉀-氯化鋇-明膠溶液的吸光度與硫酸鉀-明膠溶液的吸光度差值為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝2.858 3X-0.022 9 （R2＝0.997 7），計算得到樣品中硫酸基的質量濃度為531.25 μg/mL，硫的百分含量為8.853 3%，硫酸基DS為0.624 4。

以羥基乙酸的質量濃度為橫坐標（X），570 nm 處的吸光度為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝0.000 4X-0.001 2 （R2＝0.998 9），計算得到SPS-1 和CSPS-1 中羧甲基相當于羥基乙酸的含量分別為238.00、430.50 mg/g，羧甲基DS為0.489 8。

以硒質量濃度做橫坐標（X），340 nm 處的吸光度為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝0.014 1X＋0.019 （R2＝0.998 9），計算得到SeSPS-1 中硒含量為1.702 1 μg/mg。

3.2 紅外光譜分析 SPS-1 及其衍生物的紅外光譜圖見圖1。由此可知，在3 405、2 930、1 732、1 613、1 416、1 073 cm-1波數的峰，為多糖中含有的化學鍵伸縮、彎曲振動所致，為多糖常規吸收峰［13，19］，897 cm-1附近的峰為β-糖苷鍵的特征吸收峰［20］。

圖1 SPS-1 及其衍生物的紅外光譜圖

而在SSPS-1 譜圖中，1 073 cm-1處的峰減弱，同時在1 255和816 cm-1附近出現了S＝O 伸縮振動及C-O-S 拉伸振動吸收峰［21-22］，說明SPS-1 的羥基上有硫酸基團，硫酸化修飾成功。

由于SPS-1 為酸性多糖，本身含有羧基，因此在1 731.59、1 605.99、1 421.78、1 327.09 cm-1附近均有特征吸收［23-24］，對羧甲基化衍生物CSPS-1 的紅外光譜分析有一定的干擾，但是通過對比分析SPS-1 和CSPS-1 的紅外譜圖，發現這4 個吸收峰的強度均有所增大［25-26］，說明CSPS-1 中含有羧甲基。

由圖1 可知，SPS-1 經硒化修飾后，SeSPS-1 的紅外光譜較SPS-1 有較大變化，說明硒化修飾對多糖結構影響較大，而亞硒酸酯的特征吸收峰不明顯，僅在1 263.50、761.11 cm-1附近有較弱的吸收，說明存在少量Se-C 和Se＝O［27-28］，但硒含量較低。

3.3 均一性和分子量 SPS-1 及其衍生物的均一性和分子量結果見圖2。SPS-1 的分子量為1.22×105Da。SSPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 的分子量分別降至8.13×104、7.82×104、8.69×104Da，表明在化學修飾過程中，由于修飾試劑的影響，多糖分子發生了不同程度的降解。由于多糖的降解，SPS-1 及其衍生物的多分散系數也增加，其中SSPS-1 的多分散系數 （PDI） 最大，達到1.76，而SPS-1、CSPS-1、SeSPS-1 的PDI 分別為1.06、1.19、1.08，結果表明SPS-1及其衍生物的分子量分布仍較均勻且集中。

圖2 SPS-1 及其衍生物的HPGPC 譜圖

3.4 免疫活性分析

3.4.1 細胞增殖活性 由圖3 可知，與空白對照組比較，不同質量濃度SPS-1 及其衍生物均可刺激RAW264.7 細胞的增殖，且隨著質量濃度的增加，增殖率也隨之提高。此外，SPS-1 及其衍生物在400 μg/mL 時，細胞增殖效果趨于穩定，且所選質量濃度對RAW264.7 細胞均沒有細胞毒性，因此選擇200、400、800 μg/mL 開展后續實驗。

圖3 SPS-1 及其衍生物對RAW264.7 細胞增殖的影響

3.4.2 SPS-1 及其衍生物對RAW264.7 細胞分泌NO 和細胞因子的影響 由圖4 可知，與空白對照組比較，SPS-1 及其衍生物均可提高RAW264.7 細胞NO 分泌量（P＜0.05），且有劑量效應。與SPS-1 相比，SSPS-1 各質量濃度均可極顯著促進NO 的分泌（P＜0.01）。CSPS-1 對NO 的促進作用與SPS-1 相比有所降低，400、800 μg/mL 時，CSPS-1 的降低效果達到了顯著水平（P＜0.05）。SeSPS-1 對NO 的促進作用與SPS-1 相當，無顯著性差異。

圖4 SPS-1 及其衍生物對RAW264.7 細胞分泌NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響

與空白對照組比較，SPS-1 及其衍生物均可提高RAW264.7 細胞的IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌量（P＜0.01），且有劑量效應。與SPS-1 比較，各質量濃度SSPS-1 均可促進IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌。CSPS-1 對IL-1β、IL-6 和TNF-α 的促進作用與SPS-1 相比均有顯著降低。SeSPS-1 對IL-1β、IL-6、TNF-α 的促進作用與SPS-1 基本相當，在200和400 μg/mL 時，可顯著促進IL-1β 的分泌，800 μg/mL時，可顯著降低IL-6 和TNF-α 的分泌。

與陽性對照組比較，SPS-1 及其衍生物對RAW264.7細胞分泌NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 產生顯著影響 （P＜0.01），但仍未達到LPS 的激活水平。

4 討論

硫酸化、羧甲基化和硒化修飾是比較常見的多糖化學修飾方法，這3 種化學修飾對多糖的結構和免疫活性均產生一定的影響。硫酸化修飾的青錢柳多糖能顯著增加RAW264.7 細胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌水平，可顯著增強RAW264.7 細胞的NO 釋放和吞噬活性，表明硫酸化修飾可增強多糖的免疫調節作用［29］。羧甲基修飾的大粒車前子多糖能夠使樹突狀細胞分泌細胞因子IL-12 p70 顯著增加，表現出更好的體外免疫活性［30］。通過分析9 種硒化太子參多糖 （ sRPP1、sRPP2、sRPP3、sRPP4、sRPP5、sRPP6、sRPP7、sRPP8 和sRPP9） 和太子參多糖（RPP）的免疫活性，發現sRPP2、sRPP3、sRPP8 和sRPP9 對RAW264.7 細胞的增殖作用顯著高于RPP，其中sRPP8 和sRPP9 對RAW264.7 細胞分泌NO、IL-6 和TNF-α 的促進作用顯著高于RPP［31］。

本實驗從血滿草酸性多糖SPS-1 出發，通過化學修飾合成了SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1，通過計算硫酸基、羧甲基和硒的含量及其紅外光譜特征吸收峰的分析，明確了SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1 中分別含有硫酸基、羧甲基和硒。HPGPC 結果顯示化學修飾導致多糖產生部分降解，但均一性仍較好。細胞實驗結果表明，SPS-1、SSPS-1、CSSPS-1 和SeSPS-1 均可顯著促進RAW264.7 細胞的增殖，且可顯著促進RAW264.7 細胞分泌NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α，與SPS-1 相比，SSPS-1 對NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 釋放作用更加明顯，SeSPS-1 與之基本相當，CSSPS-1 對NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 釋放作用顯著降低，說明3種化學修飾對SPS-1 免疫活性的影響較大。本實驗可為多糖的構效關系研究提供參考，并為深入開展血滿草多糖及其衍生物的免疫活性研究奠定基礎。