淡豆豉發酵過程中影響因素研究

鐘榮榮，王奕博，范亞楠，周 旭，孫曉叢，陳彥琳，杜 杰

（中國中藥有限公司，北京 102600）

淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax（L.） Merr.成熟種子的發酵加工品，味苦、辛，性涼，具有解表、除煩、宣發郁熱的功效，主要用于治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等［1］。淡豆豉為臨床常用藥，但受限于不同的發酵條件，其市售品質量參差不齊。淡豆豉的發酵是大豆在微生物及酶的作用下，大分子有機物不斷分解為小分子（如脂肪分解為脂肪酸）、黃酮苷（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷） 分解為黃酮苷元（大豆素、黃豆黃素、染料木素） 的過程，發酵菌種、溫濕度、發酵時間等均是影響飲片成品質量的因素［2-5］。2020 年版《中國藥典》 以青蒿、桑葉為輔料，使用二次發酵法生產淡豆豉，但對于前酵和后酵（再悶） 溫濕度無明確規定，現代研究對前酵工藝分歧較少，確定的發酵溫度多為25～32 ℃，相對濕度為80%左右，發酵時間4～7 d。但不同研究者選擇的后酵溫度差距極大，30～60 ℃范圍內均有，后酵時間為12～20 d［5-11］。為探索淡豆豉發酵原理，穩定淡豆豉生產工藝，本實驗以黃酮類成分含量、酸值、色度為評價指標，比較不同后酵溫度及時間（35～65 ℃、1～15 d）、單次發酵（直接后酵）所得淡豆豉質量，以探討不同因素對淡豆豉發酵過程的影響。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）； XS205 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Labonce-380GS 型穩定性實驗箱（江蘇蘭貝石儀器有限公司）； BGZ-246 型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）； KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率50 kHz）； 超純水儀（美國默克密理博公司）； CS-820 型色度儀（杭州彩譜科技有限公司）；FW100 型粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥材 黑豆購自安國藥材市場； 青蒿 （批號C427210202）、桑葉（批號C449210402） 購自安國市深豪藥業有限公司，均經中國中藥有限公司主任中藥師陳彥琳鑒定為正品。

1.3 試劑 甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；冰醋酸、95% 乙醇、石油醚均（分析純，北京化工試劑廠）； 水為超純水。大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素對照品（批號111738-201904、111709-201702、111502-202003、111704-202104，中國食品藥品檢定研究院）； 黃豆黃苷、黃豆黃素對照品 （ 批號 N24GB169100、G26N11L132454，上海源葉生物科技有限公司）； 氫氧化鉀容量分析用溶液（0.100 5 mol/L，批號55K1，北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 淡豆豉HPLC 檢測方法學的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent Zobax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.5% 冰醋酸（B），梯度洗脫（0～25 min，30% ～45% A； 25～50 min，45% ～60% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長260 nm［12-13］。

2.1.2 對照品溶液制備 取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素分別為0.072、0.020 52、0.144、0.063 6、0.010 33、0.065 7 mg 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取淡豆豉粉末1 g （過60 目篩），精密稱定，加5 mL 石油醚，60 ～90 ℃條件下浸泡3 h 脫脂，過濾，濾渣加入80% 甲醇25 mL，超聲處理（功率500 W，頻率50 Hz） 30 min，放冷并補足減失質量，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、5.0、8.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度標準溶液。對照品溶液和梯度標準溶液在“2.1.1” 項條件下進樣測定，進樣量10 μL。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.1.5 重復性試驗 稱取同一淡豆豉粉末，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的平均含量RSD 分別為1.94%、2.92%、1.87%、2.29%、3.89%、2.98%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 中間精密度試驗 取“2.1.4” 項下重復性試驗所用淡豆豉6 份，2 個實驗員分別按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素峰面積RSD 分別為3.84%、2.86%、4.86%、3.50%、4.21%、3.60%，表明該方法精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，進樣量10 μL，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素峰面積RSD 分別為3.55%、1.61%、2.50%、0.90%、0.82%、1.33%。

2.1.8 加樣回收率試驗 取“2.1.5” 重復性試驗項下含量已知的淡豆豉粉末6 份，精密稱定，每份0.5 g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，分別精密加入對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素平均加樣回收率分別為107.59%、101.17%、99.70%、101.60%、96.08%、101.99%，RSD 分別為1.40%、1.69%、1.09%、1.68%、1.28%、1.20%。

2.2 酸值測定 單以黃酮苷類成分的轉化為指標難以全面評價淡豆豉的發酵程度，故需補充酸值、色度等評價指標。酸值反映脂肪水解程度，酸值越高，說明淡豆豉發酵過程中微生物或相關酶作用越活躍，淡豆豉發酵越完全。具體方法為精密稱取淡豆豉1.5 g，置250 mL 錐形瓶中，加乙醇-石油醚（1 ∶1） 50 mL，靜置30 min，過濾，濾渣使用乙醇-石油醚（1 ∶1） 20 mL 清洗2 次，清洗液合并，用氫氧化鈉滴定液滴定，至粉紅色持續30 秒不褪［14］。

2.3 色度測定方法 因發酵溫度和時間不同，淡豆豉樣品斷面顏色可能呈現棕黃色、棕紅色、棕黑色等，一般發酵越完全，顏色越接近棕黑色，故有必要對淡豆豉色度進行測定。色差儀可用于淡豆豉粉末顏色的測定，其中L 代表明暗度（黑白），a 代表紅綠色，b 代表黃藍色。L 值越低，說明淡豆豉顏色越深，a 值越大，說明淡豆豉顏色越紅，b值越大，說明淡豆豉顏色越黃，越接近2020 年版《中國藥典》 要求的“斷面棕黑色”。參考文獻［15］ 中的方法進行測定，其中淡豆豉粉末過三號篩。

2.4 淡豆豉制備 參照2020 年版《中國藥典》［1］方法，取桑葉、青蒿，加10 倍水煎煮2 次，過濾，藥液濃縮至5 倍生藥量后拌入凈制的黑豆，浸泡過夜，藥液被吸盡后，隔水蒸熟，晾至40 ℃以下。將黑豆放入竹筐中，以濕紗布覆蓋，再覆以煎過的藥渣，在溫度（26±2）℃、相對濕度（75±10）%下培養，待黃衣便上，取出，洗曲，瀝干，裝入容器中，45 ℃密閉發酵15 d 后，取出，略蒸，45 ℃干燥，即得。每1 000 g 黑豆，用桑葉100 g，青蒿80 g。

2.5 后酵條件對淡豆豉質量的影響

2.5.1 樣品制備 按“2.4” 項下方法，其中后酵溫度分別為35、45、50、55、65 ℃，后酵時間分別為0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15 d，每批后酵品使用300 g洗曲樣品，平行重復2 次。結果發現，后酵15 d 后淡豆豉各指標變化速度趨于平緩，且成品豉香味濃郁，外觀性狀符合2020 年版 《中國藥典》 規定，故確定后酵時間為15 d。

2.5.2 黃酮類成分含量測定 不同后酵溫度、時間下，淡豆豉黃酮類成分含量測定結果見圖1 ～5，其中第0 天為洗曲后樣品。因洗曲后干燥時間不同，不同后酵溫度第0 天樣品黃酮苷類成分存在部分差異。由圖可知，35 ℃后酵3 d內苷類成分轉化較快，之后苷元類成分增加速度較慢，在第13 天時到達頂峰； 45 ℃后酵第1 天，苷類成分即快速轉化，第2～3 天時轉化速度下降，苷元類成分在第11 天到達頂峰； 50 ℃后酵第1 天，苷類成分即大部分轉化，第2 天苷類成分完全轉化，之后染料木素含量緩慢降低，大豆素含量較為穩定； 55 ℃后酵黃酮類變化趨勢接近50 ℃，但染料木素含量下降速度更快； 60 ℃后酵第1 天，苷類成分即大部分轉化，第2 天苷元含量達到頂峰，之后苷元基本不轉化，染料木素含量快速降低，大豆素含量較穩定。

圖1 35 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖2 45 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖3 50 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖4 55 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖5 65 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

2.5.3 酸值變化規律 發酵過程中酸值動態分析結果見圖6?？芍?，后酵過程中酸值會不斷增加，隨著后酵溫度的上升，淡豆豉酸值越小，其中65 ℃時酸值最低。

圖6 不同溫度后酵酸值測定結果（n＝2）

2.5.4 色度變化規律 淡豆豉亮度（L） 分析結果見圖7，不同溫度后酵時，淡豆豉亮度均呈下降趨勢，以55、50 ℃亮度下降最快。淡豆豉紅度（a） 測定結果見圖8，除65 ℃外，不同溫度后酵時，淡豆豉紅度均呈上升趨勢，其中65、55、50 ℃后酵產品紅度接近，35、45 ℃紅度接近。淡豆豉黃度（b） 測定結果見圖9，50、55 ℃后酵時，隨著發酵時間的增加，淡豆豉b 值逐漸減小，其他溫度對b 值影響不明顯。淡豆豉顏色一方面是黑豆種皮中水溶性成分帶入的，另一方面是高溫和酶促反應共同介導的美拉德反應產生的類黑精等物質［2］。因此35～45 ℃時淡豆豉顏色較淺，50 ～55 ℃時淡豆豉呈棕黑色，65 ℃時淡豆豉呈棕紅色，高溫導致酶促反應速率降低，其類黑精成分較少。

圖7 不同后酵溫度亮度測定結果（n＝2）

圖8 不同后酵溫度紅度測定結果（n＝2）

2.5.5 不同指標相關性分析 為更好地闡述酸值、色度和黃酮類成分含量3 個評價指標的關系，更好地控制淡豆豉產品質量，對不同溫度發酵過程中共60 個樣品的3 種黃酮苷、3 種黃酮苷元、3 個色度和酸值間的相關性進行分析。各組數據不均呈正態分布，故使用SAS 8.2 軟件進行spearman 相關系數分析，結果見表2?？芍?，苷含量與苷元含量、酸值呈負相關，苷元含量與酸值呈正相關，說明在正常發酵條件下，酸值和黃酮類成分含量關系較為密切，發酵越充分，酸值越高。亮度與苷含量呈正相關，紅度與苷含量呈負相關，黃度與苷元含量呈正相關，顏色指標整體與其他指標相關性較小。

2.6 直接后酵對淡豆豉質量的影響

2.6.1 樣品制備方法 按“2.4” 項下淡豆豉制備方法，省去前酵過程，將蒸熟的黑豆直接45 ℃密閉發酵15 d 后干燥，得到直接后酵品； 將蒸熟的黑豆混入質量分數0.04%米曲霉孢子后，分別拌入0、2.5%、5%、10%的水，45 ℃密閉發酵15 d 后干燥，得到不同加水量種曲后酵品，平行重復2 次。

2.6.2 淡豆豉指標成分變化規律 不同發酵方法淡豆豉指標成分測定結果見圖10 ～11。黑豆原料中不含黃酮苷元類化合物，由圖10 可知，直接后酵品仍有少量黃酮苷轉化為苷元，說明即使沒有酶促反應，高溫環境也可以導致黃酮類成分分解。45 ℃遠超過米曲霉適宜生長溫度，實驗發現種曲后酵品表面無明顯菌落，加入種曲僅能起到帶入米曲霉孢子中的酶的作用［16］。種曲后酵品黃酮類轉化率超過50%，說明酶促反應的確是淡豆豉發酵過程中成分轉化的因素。加入種曲的同時再加入2.5%的水，黃酮苷類成分幾乎完全轉化為苷元，其原因是一方面少量的水可以使米曲霉孢子更深入黑豆內部，另一方面適宜的含水量可以促進酶活性，也可能是適宜的含水量加速了黃酮苷的分解，而加入更多水不會更明顯促進黃酮苷的轉化。對于酸值而言，后酵品酸值均低于5 mg KOH/g，遠小于正常發酵品的15 mg KOH/g 以上。不同工藝條件下，淡豆豉亮度變化較小，黃度和紅度變化較大，其中以加水2.5%種曲后酵品顏色最鮮艷，其原因是適量的水促進了美拉德反應，而過量的水對顏色具有稀釋作用。

圖10 不同工藝淡豆豉黃酮類成分含量及酸值測定結果（n＝2）

圖11 不同工藝淡豆豉色度測定結果（n＝2）

3 討論

2020 年版《中國藥典》 和1988 年版《全國中藥炮制規范》［17］均使用二次發酵法制備淡豆豉，其中前酵是微生物、菌絲和相關酶深入黑豆內部的階段，后酵是酶分解大分子化合物、使淡豆豉產生特有風味的階段。但部分地區仍采用單次發酵法制備淡豆豉（僅前酵），所得產品豉香味淡、斷面色淺發酵并不完全，若想得到色香味濃的優質淡豆豉，后酵過程必不可少。

酸值一般用來表征油脂或食品的酸敗程度，也可以表征淡豆豉的發酵程度。后酵過程中酸值會不斷增加，說明淡豆豉中的脂肪在不斷水解。隨著后酵溫度的上升，淡豆豉酸值越小，其中65 ℃后酵淡豆豉酸值明顯低于其他溫度，其原因可能是高溫抑制了酶活性。在適宜溫度下，隨著發酵時間的增加，酸值不斷增高，且未前酵樣品酸值明顯較低，故推測發酵越完全，淡豆豉酸值越高。僅以外觀性狀和黃酮苷元含量為指標無法表征淡豆豉發酵情況，如加水2.5%種曲直接后酵制作的淡豆豉表面呈黑色，有皺縮，質脆，斷面棕黃色，大豆苷元和染料木素的總量大于0.20%，基本符合2020 年版《中國藥典》 規定的外觀性狀和含量測定標準，但其沒有前酵過程，酸值只有2.86 mg KOH/g，遠低于完全發酵淡豆豉。因此有必要增加酸值作為淡豆豉的質量控制指標。

近年來研究者多關注不同發酵工藝終點時淡豆豉飲片質量［6，18］，但對發酵過程中成分轉化分析較少。對淡豆豉后酵不同溫度、時間所得產品進行分析，有利于揭示淡豆豉發酵原理，穩定生產工藝。后酵溫度50 ～55 ℃時可促進黃酮苷快速轉變為苷元，也可以在第1 天時使酸值大量增加，但長時間加熱會導致黃酮苷元的損失，其中以染料木素最不穩定。且隨著發酵時間的增加，淡豆豉酸值仍在緩慢增加，亮度持續降低，說明此時不同成分的轉化速率是不同步的，當黃酮類成分完全轉化乃至發生分解時，脂肪的水解、類黑精物質的生成仍不完全。若按2020 年版《中國藥典》 要求后酵15 ～20 d，則尋找適宜的后酵溫度，使三者轉化速率接近才是保證淡豆豉“發透” 且不“發過”的關鍵。35、45 ℃后酵時黃酮苷轉化、酸值增加、顏色變化3 個指標變化率較為同步，說明此溫度下是適宜的淡豆豉后酵溫度，其中以45 ℃后酵成品豉香味更濃。若從減少生產周期的角度考慮，應選擇后酵溫度50 ～55 ℃、發酵2 d，此時黃酮類成分轉化完全，分解較少，酸值、顏色等指標雖未達到頂峰，但也接近45 ℃后酵7 d 所得淡豆豉質量。