五谷蟲中蛆激酶分離及其生物活性評價

劉 燦，劉秋荻，張凱欣，馬彤瑤，汪文漪，馬蘭青*

（1.北京農學院農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206； 2.北京農學院生物與資源環境學院，北京 102206）

血栓栓塞型疾病對心、腦、肺中血管系統造成損害，嚴重危害人體健康。自然界是獲取溶栓藥物的天然寶庫，研究報道微生物、動植物中均可分離得到具有溶栓活性的物質，如利用溶血性鏈球菌制備鏈激酶［1］，從人尿液中提取尿激酶［2］，枯草芽孢桿菌中分離納豆激酶［3］，利用赤子愛勝蚓制備蚓激酶［4］，以江浙蝮蛇蛇毒為原料獲取蛇毒溶栓酶［5］，從海洋生物單環刺螠中提取單環刺螠溶栓酶［6］，以沙蠶、黃粉蟲為原料制備沙蠶溶栓酶［7］和黃粉蟲溶栓酶［8］。

五谷蟲又名蠅蛆，《本草綱目》 記載其可“治小兒諸疳積、疳瘡，熱病譫妄，毒痢作吐”［9］，用于創面感染、臁瘡等疾病的治療［10-12］。蠅蛆中凝集素具有抗菌、抗病毒的作用［13］； 抗菌肽可抑制金黃色葡萄球菌的繁殖［14］，預防呼吸道感染［15］； 溶菌酶可促進巨噬細胞的吞噬能力，增強機體免疫［16］； 脂肪酸具有抗腫瘤、抗HIV-1 整合酶活性［17］?；谇捌诤Y選結果，本研究擬從五谷蟲中分離蛆激酶并評價其活性，以期為該昆蟲纖溶酶的理論研究和臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ChemiDocTM XRS＋型凝膠成像儀（美國伯樂公司）； 艾本德5430 R 型低溫高速離心機（德國艾本德公司）； DYY-4C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）； 賽默飛3111 型二氧化碳恒溫培養箱（美國賽默飛公司）； SHA-CA型水浴鍋（常州榮華儀器制造公司）； LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）； FA2004B 型電子天平（上海越平科學儀器制造有限公司）； THZ-C 型恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設備有限公司）； JP-Blupadstart 型蛋白純化系統（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 家蠅（合肥大元生物科技有限公司），通過對原料的COⅠ基因克隆、測序比對進行物種鑒定，鑒定結果為家蠅MuscadomesticaL.。CM52 型離子交換樹脂（批號C8691）、苯甲脒Sepharose 4FF （批號S9400） （北京索萊寶科技有限公司）； 纖維蛋白原（編號140607，18 個酪蛋白單位/瓶）、凝血酶（編號140605）、纖維蛋白溶酶原（纖溶酶，編號140606）、蚓激酶標準品（編號140650，24 000 U/支） （中國食品藥品檢定研究院）；N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號B100879，純度＞98%）； 苯甲基磺酰氟（PMSF，編號A100754）、抑肽酶（編號A100429）［生工生物工程（上海） 有限公司］。

2 方法

2.1 蛆激酶提取、分離與純化

2.1.1 鹽析法提取粗酶 取新鮮冷凍家蠅幼蟲100 g，用水洗凈，加入1 800 mL 蒸餾水勻漿，8 500 r/min 離心10 min 以除去雜質，收集上清液，加入硫酸銨使其飽和度達到30%，在4 ℃下靜置2 h，待蛋白沉淀析出后8 500 r/min離心，收集上清液，再補充硫酸銨至飽和度為70%，靜置，8 500 r/min 離心，棄上清液，收集沉淀，用純凈水溶解，透析袋除去溶解液中鹽離子至電導率為50 μs/cm，即得粗提液。

2.1.2 CM52 離子交換層析 采用陽離子交換樹脂CM52，平衡液PBS 緩沖液（pH ＝8，10 mmol/L）； 洗脫液含0.5 mol/L 的NaCl-PBS 緩沖液（pH ＝8，10 mmol/L）； 體積流量1 mL/min，收集有活性的洗脫峰溶液并進行透析，除去溶液中鹽離子。

2.1.3 苯甲脒Sepharose 4FF 親和層析 采用填料苯甲脒瓊脂糖凝膠進行親和層析； 柱床體積10 mL； 平衡液PBS緩沖液 （pH ＝7.5，100 mmol/L）； 甘氨酸鹽酸緩沖液（pH＝3.0，50 mmol/L） 洗脫，體積流量0.5 mL/min，收集活性洗脫峰并進行透析至電導率＜10 μs/cm，冷凍干燥。

2.2 蛆激酶溶纖活性測定 參照《國家食品藥品監督管理局國家藥典委員會審定國家藥品標準WS1- （X-052） -2001Z》，精密量取不同濃度蚓激酶標準品及樣品溶液適量，點在纖維蛋白平皿上，加蓋，置于37 ℃恒溫箱中反應18 h，取出，通過卡尺測量溶纖圈垂直兩直徑，以蚓激酶單位數的對數為橫坐標（X），垂直兩直徑乘積的對數為縱坐標（Y） 進行回歸，將溶纖圈垂直兩直徑乘積的對數代入其中，計算效價單位數。

2.3 蛆激酶對纖溶酶原的激活作用 纖維蛋白溶酶原加入1.8 mL 水溶解，制成10 酪蛋白單位/mL 的溶液。取1.5 mL 離心管，加入蛆激酶20 μL （比活性5 600 U/mL），再加入纖溶酶原溶液制成含0.1 酪蛋白單位/管的供試品溶液，作為實驗組，同時選擇生理鹽水作為對照組，按“2.2” 項下方法測定溶纖活性，以對照組相對酶活性100%計算實驗組相對酶活。

2.4 蛆激酶蛋白分子量測定 采用SDS-PAGE 電泳，膠配方為12%分離膠、5% 濃縮膠，電泳條件為電壓調至80 V保持恒壓，待溴酚藍指示劑移動進濃縮膠時電壓調至120 V 并保持恒壓，以考馬斯亮藍R-250 進行染色，放入脫色液中［冰醋酸-無水乙醇-水（3 ∶10 ∶27） ］，置于搖床上，設定轉速為55 r/min，待條帶清晰可見后倒掉脫色液，拍照。

2.5 蛆激酶對纖維蛋白原（牛血） 的降解作用 取1.5 mL 離心管，加入80 μL 1.5 mg /mL 纖維蛋白原、8 μL 蛆激酶（活性37 000 U/mL），混勻，37 ℃水浴反應（轉速110 r/min） 1、3、10、30 min 及1、1.5、24 h 時取出離心管，置于-20 ℃冰箱中終止反應，加入含變性劑的蛋白質Loading Buffer，沸水浴加熱5 min，以纖維蛋白原為對照，采用SDS-PAGE 電泳分析蛆激酶對纖維蛋白原各亞基的降解情況。

2.6 蛆激酶作用靶點分析 離心管加入3 mL 底物BAPNA、5 μL 蛆激酶（比活性約13 000 U/mL），混勻，在37 ℃下保溫，于0.5、1、3、5、24 h 各取20 μL，乙腈稀釋4 倍后0.22 μm 微孔濾膜過濾，采用HPLC 法分析不同時間BAPNA 底物的降解情況，條件為Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動相水（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～10 min，20% ～100% B； 11 ～15 min，100%B； 16～20 min，100% ～20%B）； 體積流量0.8 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長253 nm； 進樣量20 μL。

2.7 蛆激酶酶動力學參數測定 以BAPNA 為底物，配制0.05、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2 mmol/L溶液。將3 mL 不同濃度底物溶液、5 μL 蛆激酶（活性14 000 U/mL） 在37 ℃下反應，于410 nm 波長處測定在2 min 內的光密度（OD） 變化，計算酶活性，以每1 min 生成1 mmoL/L 底物所需酶量定義為水解BAPNA 酶活性單位（1 U），采用米氏方程進行計算［18］，公式為V＝Vmax×［S］ /Km＋［S］，再通過雙倒數法將其轉化成線性方程式（Lineweaver-Burk 方程式）［19］，公式為1/V＝Km/Vmax×1/［S］ ＋1/Vmax，其中V為酶促反應速率，Km為米氏常數，［S］ 為底物濃度，Vmax為最大反應速率。

2.8 抑制劑對蛆激酶活性的影響 采用絲氨酸蛋白酶專一性抑制劑判定蛆激酶活性中心類型，將PMSF 溶于異丙醇中，質量濃度為5.23 mg/mL （30 mmol/L），使用前加水稀釋（由于其在水溶液中易分解，故現用現配），同時抑肽酶用蒸餾水進行溶解（現用現配）。取1.5 mL 離心管，加入蛆激酶（活性4 000 U/mL） 20 μL，再加入PMSF、抑肽酶，使離心管中抑制劑終濃度為1、5 mmol/L，以蒸餾水為對照，按“2.2” 項下方法測定，以對照組相對酶活性100%計算實驗組相對酶活。

3 結果

3.1 蛆激酶提取、分離與純化 鹽析后，粗酶比活性為959.84 U/mg （n＝3），經羧甲基纖維素CM-52 弱陽離子交換層析分離后升至17 858 U/mg （n＝3），苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF 純化后進一步升至933 262 U/mg （n＝3）。由圖1 可知，原料中富含蛋白質，經硫酸銨分級沉淀除去部分無活性的蛋白，再經CM-52 除去大量雜質，最后經親和層析獲得蛆激酶，分子量約為25 kDa。

圖1 蛆激酶純化過程中的SDS-PAGE 電泳

3.2 蛆激酶對激活纖溶酶原的激活作用 由圖2 可知，蛆激酶、纖溶酶原混合物中纖維蛋白平板上的溶纖圈直徑大于蛆激酶，表明前者溶纖活性高于后者，這是因為纖溶酶原自身無溶解纖維蛋白的能力，而蛆激酶具有激活纖溶酶原的作用，可降解平板中纖維蛋白凝塊，使得溶纖圈更大。

3.3 蛆激酶降解纖維蛋白原（牛血） 情況 由圖3 可知，蛆激酶能有效水解纖維蛋白原的α-亞基、β-亞基、γ-亞基［20］，降解次序依次為α 亞基、β 亞基和γ 亞基，即對α亞基的水解作用最快，反應1 min 后即大部分被快速降解，3 min 后被完全降解； 反應10 min 后β 亞基被水解，1 h 內完全降解； γ 亞基在1.5 h 內無明顯水解，24 h 后才被完全降解。

圖3 蛆激酶對纖維蛋白原的降解情況

3.4 蛆激酶酶切位點 如圖4A 所示，BAPNA 保留時間為13.3 min，對硝基苯胺保留時間為8.6 min，苯甲酰精氨酸保留時間為2.1 min； 如圖4B 所示，在保留時間2.1、8.6 min 處出現色譜峰，與對硝基苯胺、苯甲酰精氨酸一致，提示BAPNA 已被蛆激酶降解，產生了苯甲酰精氨酸、對硝基苯胺。繼續酶解后，隨著反應時間延長苯甲酰精氨酸、對硝基苯胺信號值明顯升高，BAPNA 響應值逐漸降低，表明其不斷被降解，生成了苯甲酰精氨酸、對硝基苯胺，提示激酶具有降解Arg-X 酰胺鍵（精氨酸酰胺鍵，“X” 代表其他氨基酸殘基） 的能力，過程見圖5。

圖4 蛆激酶對底物BAPNA 降解的HPLC 色譜圖

圖5 蛆激酶降解N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA） 的過程

3.5 蛆激酶酶動力學研究 由圖6A 可知，底物濃度在0.05 ～0.1 mmoL/L 之間時，為一級反應； 在0.1 ～1.5 mmoL/L 之間時，酶促反應速度逐漸加快，為混合級反應；進一步提高底物濃度時，反應速度達到最大值，為零級反應。蛆激酶的酶促反應速度和底物濃度之間的關系符合米氏酶特征，Lineweaver-Burk 方程曲線見圖6B，為1/V＝12.42× （1/ ［S］ ） ＋40.96 （R2＝0.998 0），Vmax＝0.024 4 U，Km＝0.303 mmoL/L，催化常數 （轉化數）Kcat＝1.627 1/s，Kcat/Km＝5.369 L/ （s·mmoL）。

圖6 蛆激酶酶動力學研究結果

3.6 抑制劑對酶活性的影響 由表1 可知，PMSF、抑肽酶對酶活有強烈的抑制作用，在1 mmol/L PMSF 作用下蛆激酶殘余酶活為24.60%； 1 mmol/L 抑肽酶可完全抑制蛆激酶活性。由于PMSF、抑肽酶為絲氨酸蛋白酶專一性抑制劑［21］，對蛆激酶有抑制作用，故推測蛆激酶可能屬于絲氨酸蛋白酶家族。

表1 絲氨酸蛋白酶抑制劑對蛆激酶活性的影響（±s，n＝3）

表1 絲氨酸蛋白酶抑制劑對蛆激酶活性的影響（±s，n＝3）

注： 與對照組比較，*P ＜0.05； 與1 mmol/L PMSF 組比較，＃P＜0.05。

組別濃度/（mmol·L-1）溶纖活性/%對照組—100 PMSF 組124.60±0.35*PMSF 組516.98±0.49*＃抑肽酶組10*抑肽酶組50*

4 討論與結論

五谷蟲在含有大量腐敗物質、病原微生物的環境中生長，可能存在各種用于代謝有毒物質、抵御致病微生物的酶類，目前已報道抗菌肽、蠅蛆凝集素、尿囊素、溶菌酶、酚氧化酶等活性產物。本實驗利用鹽析、離子交換層析、親和層析首次對五谷蟲中纖溶酶進行分離純化，制備高活性蛆激酶，該類酶大多為絲氨酸蛋白酶家族，其活性能被絲氨酸特異性抑制劑苯甲基磺酰氟及抑肽酶所抑制，表明其亦為絲氨酸蛋白酶家族。

為了理清蛆激酶作用途徑，本實驗考察其對纖維蛋白平板的溶纖效果，發現其能將纖維蛋白平板分解，具有溶纖活性。機體纖溶系統與凝血系統維持血液系統平衡，當平衡被病理過程破壞時，過量凝血酶被激活，將纖維蛋白原轉化成不溶性纖維蛋白，纖維蛋白沉積形成血栓骨架，與血小板、血細胞共同構成血栓，導致血液凝固［22］，引發體內血栓形成，因此，直接降解纖維蛋白是溶栓藥物發揮溶栓效果的重要途徑，也是蛆激酶的重要活性特征。

纖維蛋白原水平變化在臨床診斷中發揮重要作用，研究表明，冠心病等患有心血管疾病人群體內的纖維蛋白原水平升高［23］，故在臨床上降低血漿中其水平可有效預防血栓形成［24］。本實驗以纖維蛋白原為底物，發現蛆激酶可依次降解纖維蛋白原的中α、β、γ 亞基，提示它具有預防血栓形成的潛力。

組織型纖溶酶原激活劑及尿激酶作為傳統溶栓藥物，可將纖溶酶原激活為纖溶酶，從而發揮溶栓活性，本實驗發現，蛆激酶也顯示出激活纖溶酶原的特點，能將纖溶酶原轉化為有活性的纖溶酶，并且還能將BAPNA 進行降解，提示蛋白中Arg-X 酰胺鍵可能為蛆激酶作用靶點。

綜上所述，五谷蟲作為纖溶酶提取的原料，具有價格低廉、來源廣泛的優勢，本實驗開展了蛆激酶制備和評價工作，發現其具有降解纖維蛋白、分解纖維蛋白原、激活纖溶酶原的功能，可為開發多靶點、高效、廉價溶栓藥物及治療高纖維蛋白原血癥藥物提供一定參考。