肉桂精油復配香芹酚和百里香酚對食用畜禽有害微生物熏蒸的抗菌活性

柴向華，鄒冬鋅，吳克剛，段雪娟，何東，王貴平，吳保慶，孫明華，劉琳

（1.廣東工業大學輕工化工學院，廣東廣州 510006）

（2.廣東海大集團股份有限公司，廣東廣州 511400）

近些年來我國食用畜禽產品的消耗量日漸增加，食用畜禽養殖行業快速發展，養殖模式趨向于集約化和規?；?。高密度的食用畜禽飼養模式帶來高效益的同時，也給食用畜禽動物產品的食品安全帶來了新的嚴峻問題。食用畜禽養殖環境的問題極大地影響了食用畜禽的生產性能與健康狀態，同時也會影響其產品如肉、蛋、乳的質量，能否控制好有害食用畜禽的微生物的問題已經成為保證動物類食品質量安全和食用畜禽養殖行業順利發展的重要因素。有害食用畜禽生理健康的微生物中，白色葡萄球菌、白色念珠菌通過引發呼吸道疾病威脅食用畜禽的健康[1,2]，黑曲霉引起的飼料霉變導致食用了霉變飼料的畜禽患腸道疾病[3]，因此如何控制有害食用畜禽的這三種微生物顯得至關重要。

過去，避免動物受到致病微生物危害的主要途徑是在動物的飼料中添加抗生素，2015 年9 月我國農業部公告第2292 號禁止了4 類抗生素在食用動物中的使用，而農業農村部第194 號公告宣布2020年起我國的飼料中全面禁止添加抗生素，正式進入飼料端“禁抗”，養殖端“減抗、限抗”的時代，這表明尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品迫在眉睫[4]。植物精油是一類很好的抗生素替代品[5]，牛至油已獲農業部批準可作為一種長期添加的藥物飼料添加劑，目前國內的牛至油主要依賴進口。肉桂作為一種藥食兩用的植物，其精油也具有廣譜抗菌活性[6]，同時我國擁有豐富的肉桂資源，使用肉桂油替代牛至油具有可行性，但肉桂油的強烈氣味限制了其的應用，所以解決肉桂油的氣味問題十分關鍵。牛至油的抗菌主要成分為百里香酚和香芹酚[7]，它們都是被允許用于添加到食品中的天然香料，在具有優秀的綜合抗菌能力的同時存在氣味較小的優點。有研究顯示，多種香料復配并用相比使用單一香料時其抗菌效果更好，原因是復配并用可以擴寬香料的抗菌譜，并且可以在協同作用時減少單體的用量[8]。使用百里香酚和香芹酚復配有利于減小肉桂油強烈的氣味，同時提高肉桂油的抑菌能力，擴大其抑菌范圍。本文旨在通過將百里香酚或香芹酚與肉桂油復配以達到降低肉桂油使用量，改善肉桂油氣味的目的，并利用熏蒸的方式殺死空氣中引起畜禽呼吸道疾病的有害微生物，為肉桂精油在動物類食品生產應用和食用畜禽養殖方面提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原料

白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）GIM 1.247、白色念珠菌（Canidiaalbicans）ATCC10231、黑曲霉（Aspergillusniger）ATCC 16404，廣東省微生物菌種保藏中心；肉桂精油，百里香酚、香芹酚，廣州市香思馨情健康科技有限公司；營養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；無水乙醇、丙三醇，天津市大茂化學試劑廠；1,2-丙二醇，天津市致遠化學試劑有限公司；食用油，上海嘉里食品工業有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-250 生化培養箱，上海銳豐儀器儀表有限公司；YX-280D（242）型手提式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司；SHA-BA 恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；PEN3 型電子鼻，德國AirSense 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液的制備

細菌及酵母菌懸液的制備：平板劃線活化，37 ℃下培養24 h。挑取單個菌落通過麥氏比濁法制成0.5麥氏單位（1.5×108CFU/mL）的菌懸液，再用無菌水稀釋為105～106CFU/mL。

霉菌孢子菌懸液的制備；將霉菌接種在平板上活化，28 ℃培養4 d，待平板中長滿孢子，向培養皿中加入適量無菌水進行洗脫，將含有孢子的無菌水轉移到錐形瓶中，置于振蕩器30 min。采用血球板計數法統計孢子數并計算菌懸液濃度，然后用10倍稀釋法稀釋原始菌懸液至濃度為105～106CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈直徑的測定

采用瓊脂孔注入法。用直徑5 mm 的無菌打孔器在滅菌后冷卻凝固的瓊脂培養基中心打孔，剔除孔內瓊脂，向瓊脂孔中添加10 μL 植物精油，蓋好培養皿用封口膜封口一圈。同時設置空白對照組（添加無菌水），每組實驗設置3 個平行，將密封好的培養皿標記后置于恒溫培養箱，細菌37 ℃下培養24 h，真菌28 ℃下培養4 d，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，重復三次取平均直徑。

1.3.3 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

采用氣相熏蒸法測定最低抑菌濃度[9]。取20 mL高壓蒸汽滅菌后的瓊脂培養基加入培養皿，冷卻凝固后加入100 μL 菌懸液并涂布均勻，待菌液被瓊脂吸收后倒放靜置。吸取不同體積用丙二醇稀釋的精油加入培養皿蓋，同時設置對照組添加等量的丙二醇，封口膜封口一圈。不同體積的精油使得培養皿內精油的空間濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.5 μL/L，另設空白組（涂布無菌水），每組重復3 次于恒溫培養箱中倒置培養。細菌在37 ℃條件下培養24 h，真菌28 ℃培養4 d。培養完成后觀察生長情況，不長菌平板的精油空間濃度為該精油的最低抑菌濃度。

采用菌塊轉移法測定最低殺菌濃度。取測定最低抑菌濃度實驗中無菌生長的平板，用無菌打孔器在不長菌的平板上取直徑為5 mm 的瓊脂塊轉移到新鮮的無菌平板中央（涂布無菌水的平板同理，作空白對照），每組做三個平行，用封口膜密封。細菌在37 ℃條件下培養24 h，真菌28 ℃培養4 d。培養完成后觀察實驗結果，仍然沒有菌生長的平板所對應的精油空間濃度為該精油對應的最低殺菌濃度。

1.3.4 復配肉桂精油抑菌效果的測定

將肉桂精油與香芹酚、百里香酚、百里香酚和香芹酚的混合物（1:1）進行復配，肉桂精油在復配精油中的體積分數分別為0%、20%、40%、50%、60%、80%和100%。采用與1.3.3 相同的實驗方法測定肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-香芹酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚三種復合精油對供試菌種的最低抑菌濃度，以分級抑菌濃度指數（Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI）作為聯合抗菌試驗效果判定依據，判定標準見表1[10]。

表1 FICI指數的判定標準Table 1 Determination criteria of fractional inhibitory concentration index

FICI 計算公式如下：

式中：

D——分級抑菌濃度指數（FICI）；

FN——N的分級抑菌濃度指數；

E聯合N——N聯合時的最低抑菌濃度，μL/L；

H單用N——N單用時的最低抑菌濃度，μL/L。

1.3.5 溶劑稀釋后復配肉桂精油揮發性的測定

使用無水乙醇、丙二醇、甘油、食用油稀釋復配肉桂精油，通過德國AirSense 公司PEN3 型電子鼻測定揮發性，研究溶劑稀釋對復配肉桂精油揮發性的影響。實驗溫度25 ℃；復配肉桂精油濃度為1.3.4實驗所得最低抑菌濃度；復配肉桂精油在頂空瓶中靜置40 min；電子鼻洗氣80 s；數據采集100 s；氣體流量600 mL/min。

1.3.6 溶劑稀釋復配肉桂精油抑菌效果的比較

使用無水乙醇、丙二醇、甘油、食用油稀釋復配肉桂精油，以1.3.4 測定的最低抑菌濃度為基準，采用氣相熏蒸法測定溶劑稀釋復配肉桂精油對供試菌種的最小抑菌濃度，以無菌水、無水乙醇、丙二醇、甘油、食用油作為空白組，不使用溶劑稀釋的復配肉桂精油作為對照組，分析比較溶劑稀釋復配肉桂精油的抑菌效果。

1.3.7 GC-MS分析肉桂精油組成成分

氣相色譜條件：氣相色譜儀Agilent 7890B；色譜柱HP-5MS UI（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為初始溫度50 ℃維持3 min，先以2 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，其后再以20 ℃/min 的速率升溫至300 ℃并維持10 min；進樣體積為0.2 μL；進樣口溫度250 ℃；進樣方式為精油直接進樣；分流比120:1；載氣模式為恒流1 mL/min；傳輸線溫度300 ℃。

質譜參數：Agilent 5977B GC/MS；離子化方式為EI，atune；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描范圍為29～550 u。

1.3.8 數據分析

抑菌圈、抑菌濃度實驗和電子鼻實驗數據使用Excel 進行處理，圖形繪制使用Origin 2018。GC-MS 實驗結果采用Agilent 5977B 進行分析，通過Nist14 質譜庫及自建香料譜庫進行檢索，使用峰面積歸一化法計算肉桂精油各組分相對含量，并結合保留時間輔助定性。

2 結果與討論

2.1 肉桂精油組成成分及其熏蒸抗菌活性分析

2.1.1 肉桂精油組成成分分析

使用氣相色譜-質譜聯用儀對肉桂精油的揮發性化學成分進行分析，得到肉桂精油揮發性成分總離子流圖，如圖1。通過在美國國家標準技術研究院Nist14 質譜庫和百花香料公司自建香料譜庫檢索，結合質譜手冊并參考相關文獻進行核對，共鑒定出29 種化合物，其相對百分含量占色譜總流出峰的95.686%，分析結果見表2。

圖1 肉桂精油揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatilel components of cinnamon essential oil

表2 肉桂精油揮發性化學成分分析Table 2 Volatile chemical composition analysis of cinnamon essential oil

由表2 可以看出，在肉桂精油鑒定出的29 種揮發性化學成分中，肉桂醛的含量最高，相對含量為78.191%，其次是2-甲氧基肉桂醛，相對含量為8.703%。從肉桂精油中共鑒定出6 種醛類化合物，相對含量為89.199%；鑒定出11 種烯烴類化合物，相對含量為2.189%；鑒定出2 種酮類化合物，相對含量為1.26%；鑒定出5 種酯類化合物，相對含量為1.231%；鑒定出5 種酚醇類化合物，相對含量為1.179%；其他化合物1 種，相對含量為0.628%。

肉桂精油中的揮發性化學成分中大部分為醛酮類、烯烴類化合物，小部分為酯類、酚醇類化合物，這些化合物主要為小分子化合物，碳原子個數都不超過15。醛類化合物中以肉桂醛為主，肉桂醛具有優秀的抗菌、抗氧化作用[11]。Vasconcelos 等[12]的研究結果顯示，肉桂精油抗菌的主要活性成分是反式肉桂醛，反式肉桂醛的活性部位是它的α,β-不飽和羰基。α,β-不飽和羰基是一個親水基團，易被細菌或者真菌表面的親水基所吸附從而進入到菌體細胞內，通過破壞細菌或真菌的細胞壁多糖結構導致細菌或真菌死亡，達到抗菌殺菌的效果。

2.1.2 微生物對肉桂精油及百里香酚和香芹酚的敏感性分析

采用抑菌圈分析敏感性。肉桂精油及百里香酚和香芹酚對供試菌種的抑菌圈實驗測定結果見表3。

表3 肉桂精油及百里香酚和香芹酚對供試菌種的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of the inhibition zone of cinnamon essential oil, thymol and carvacrol on the tested strains

供試菌種對抗菌物質敏感性的判定標準如下：抑菌圈直徑＞ 20 mm 為最敏感；10～20 mm 為中度敏感，5～10 mm 為低度敏感；無抑制作用（≤5 mm）為不敏感[13]。

根據以上判定標準，從表3 的結果可見，百里香酚和香芹酚兩種香料對白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉都表現為最敏感，抑菌圈的直徑均＞ 30 mm，尤其對白色念珠菌的抑制更明顯，抑菌圈直徑可以達到50 mm 以上；肉桂精油對白色念珠菌和黑曲霉的抑菌圈直徑都＞ 30 mm，均表現為最敏感，對于白色葡萄球菌的抑菌圈直徑處在10～20 mm 范圍內，僅表現為中度敏感。雖然肉桂精油與百里香酚和香芹酚相比，對白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制能力稍弱一些，但對于黑曲霉，肉桂精油的抑菌圈直徑超過了百里香酚和香芹酚，這說明肉桂精油對黑曲霉的抑制能力優于百里香酚和香芹酚。

2.1.3 肉桂精油及百里香酚和香芹酚的熏蒸抗菌活性分析

為了了解肉桂精油及百里香酚和香芹酚對于畜禽養殖環境有害微生物的抗菌效果，采用氣相熏蒸法測定肉桂精油、百里香酚和香芹酚對于白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度以研究其體外抑菌效果，抑菌實驗測定結果如表4 所示。

表4 肉桂精油及百里香酚和香芹酚對供試菌種的MIC和MBCTable 4 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration ofcinnamon essential oil, thymol and carvacrol on the tested strains (μL/L)

表4 中MIC 和MBC 的數值越小，說明其對于供試菌種的抗菌活性越強。由表3 可以看出，肉桂精油、百里香酚和香芹酚對三種供試菌的生長都能產生不同程度的抑制效果。其中，百里香酚的綜合抗菌能力最強，對于三種供試菌，百里香酚的MIC都≤ 125 μL/L，MBC 都在250 μL/L 以下，表現出優秀的廣譜抗菌性；香芹酚對白色念珠菌和黑曲霉生長的抑制效果沒有什么差異，對兩種菌的MIC 和MBC 均為125 μL/L，對白色葡萄球菌的抑菌能力則稍弱一點；肉桂精油對于白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果與百里香酚和香芹酚相比存在一定的差距，不過對黑曲霉則表現出很強的抑菌能力，MIC 和MBC 都低于百里香酚和香芹酚，這也驗證了敏感性分析實驗的結果。汪美君[14]的研究結果也表明，相比細菌，肉桂精油對真菌抑制能力更強，這是由于肉桂精油對不同菌種作用機制的差異引起的。

肉桂精油的主要抗菌成分是肉桂醛，當作用于細菌時，肉桂醛破壞了細菌的細胞形態，影響了菌體的細胞膜通透性，使得細胞膜變形或產生褶皺而破裂，由于細胞膜的完整性遭到了破壞，導致細菌胞體內的營養物質泄漏，因此細菌的生長受到了影響，同時，菌體細胞膜的電位值因胞內電解質的流失而降低，新陳代謝產生紊亂，最終導致細菌死亡[15]。而對于真菌和霉菌，肉桂醛是通過破壞其細胞壁進入到菌體細胞內，改變菌體胞內大分子的空間結構，減弱菌體利用碳源的能力從而影響其新陳代謝，最終使得菌體死亡[16]。

2.2 百里香酚和香芹酚對肉桂精油熏蒸抗菌作用的影響

按肉桂精油在復配精油中的體積分數為0、20%、40%、50%、60%、80%、100%將肉桂精油與百里香酚、香芹酚、百里香酚和香芹酚的混合物分別復配，測定MIC 并計算FICI，分析百里香酚和香芹酚對肉桂精油熏蒸抗菌的協同效應，結果如表5 所示。

表5 復配肉桂精油對供試菌種的FICITable 5 Fractional inhibitory concentration indexof the compounded cinnamon essential oilon the tested strains

總體上看，三種復配精油對黑曲霉抗菌效果的提升明顯優于白色葡萄球菌和白色念珠菌，尤其以肉桂精油-百里香酚組合最為顯著，不同組合中肉桂精油所占比例也有差異。從表5 中可以看出，三種復配精油組合肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-香芹酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚對黑曲霉都表現出相加作用，FICI 分別為0.64、0.72 和0.7，對于白色念珠菌則全都表現為無關作用，其中復配組合肉桂精油-香芹酚的FICI 數值是最小的。雖然肉桂精油-百里香酚、肉桂精油-百里香酚/香芹酚對于黑曲霉的FICI 數值略小于肉桂精油-香芹酚，但是復配組合肉桂精油-香芹酚相比另外兩種組合，對白色葡萄球菌也表現出了相加作用，FICI 為0.96，這是因為香芹酚對白色葡萄球菌的抑菌機制與肉桂精油不同，兩者對白色葡萄球菌的抑制效果相互疊加造成的[17]。

盡管香芹酚與肉桂精油沒有協同增效作用，但是可以通過香芹酚的替代來減少肉桂精油的使用量，這不僅可以有效減小肉桂精油的氣味[18]，并且可以增強肉桂精油對白色葡萄球菌的抑制能力。綜合來看，使用香芹酚與肉桂精油進行復配為較優選擇。

2.3 溶劑稀釋對復配肉桂精油揮發性及熏蒸抗菌活性影響

2.3.1 電子鼻分析

五種復配肉桂精油的電子鼻指紋圖譜如圖2 所示，PEN3 型電子鼻各不同傳感器所對應代表的化合物種類見表6[19]。

圖2 五種復配肉桂精油電子鼻傳感器響應值指紋圖譜Fig.2 Response value fingerprint of electronic nosesensor of five compounded cinnamon essential oil

表6 不同傳感器序號所代表的化合物種類Table 6 Compounds represented by different sensor equences

結合表6 對圖2 進行分析，五種復配肉桂精油對S1、S3、S4、S5、S10 傳感器的響應值均比較低。S1 傳感器主要響應苯類芳香成分，S3 傳感器主要對氨類靈敏，S4 傳感器主要對氫化物有選擇性，S5傳感器主要對短鏈烷烴、芳香類成分靈敏，而S10傳感器主要響應長鏈烷烴，對脂肪族靈敏。由圖2b和圖2c 分析得出，五種復配肉桂精油中苯類、氨類、短鏈烷烴和長鏈脂肪烴類芳香成分的含量非常少，這與2.1.1 中肉桂精油的總揮發性化學成分分析的結果相符。從圖2a 看到，使用無水乙醇稀釋的復配肉桂精油對S2、S6、S8 傳感器產生了相當高的響應值，響應值均＞ 200，這是因為無水乙醇具有極強的揮發性，其大量揮發后本身具有的羥基和甲基被對氮氧化合物、甲基類化合物和醇類化合物靈敏的傳感器所響應。從S9 傳感器的響應值可以看出，使用無水乙醇或丙二醇稀釋可以使復配肉桂精油的芳香成分更好地揮發出來，而使用甘油或食用油稀釋復配肉桂精油，由于復配肉桂精油在甘油中的溶解度低，在食用油中的揮發性差，導致這兩種復配肉桂精油對S9 傳感器的靈敏度低于未使用溶劑稀釋的純精油，使得電子鼻難以進行區分。此外，未使用溶劑稀釋的純復配精油除了使用無水乙醇稀釋的復配肉桂精油外，其S7 傳感器的響應值均大于其他三種溶劑稀釋的復配肉桂精油。S7 傳感器對萜烯類化合物敏感[20]，萜烯類化合物易溶于無水乙醇并揮發，但在丙二醇、甘油、食用油中溶解揮發量少?？傮w上看，使用無水乙醇或丙二醇稀釋可以有效地促進復配肉桂精油中芳香成分的揮發，但無水乙醇本身的基團也會對電子鼻的分析結果產生影響，通過電子鼻可以對復配肉桂精油進行分析，其對揮發性化學成分的分析結果具有一定的準確性。

2.3.2 溶劑稀釋后復配肉桂精油的熏蒸抗菌活性分析

根據敏感性分析和最低抑菌濃度的實驗結果，選擇香芹酚復配肉桂精油，通過測定使用不同溶劑稀釋的復配精油對白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的最低抑菌濃度，研究不同的溶劑稀釋對于復配肉桂精油抗菌活性的影響。

使用不同溶劑稀釋后，復配肉桂精油的抑菌實驗結果如表7 所示。從表7 中可以看出，使用無水乙醇作為溶劑稀釋可以增強復配精油的抗菌活性，不使用溶劑稀釋，使用甘油或者食用油稀釋無法達到使用1,2-丙二醇作為溶劑稀釋的復配精油的抗菌效果。崔綺嫦等[21]的實驗結果顯示，在相同濃度的情況下，復配精油對供試菌種抑制效果的差異是由于復配精油在不同溶劑中的溶解度與揮發性的不同引起的。復配肉桂精油可以很好地在無水乙醇、1,2-丙二醇和食用油中溶解，但在甘油中表現為部分溶解。在揮發性方面，不使用溶劑稀釋的純復配精油和使用食用油稀釋的復配精油揮發性十分有限，因此精油的有效抗菌成分無法順利作用于菌體，導致實際抑菌效果遠不如使用無水乙醇或者1,2-丙二醇稀釋的復配精油。此外，使用甘油作為溶劑稀釋與使用食用油相比，實驗結果十分相近，雖然復配精油在食用油中的溶解度高于甘油，但在甘油中的復配精油揮發性大于在食用油中的，兩方面的因素綜合起來最終使得這兩種復配精油產生的抑菌效果沒有太大區別。

表7 不同溶劑稀釋的復配肉桂精油對供試菌的最低抑菌濃度比較Table 7 Comparison of the minimum inhibitory concentration of compound cinnamon essential oil diluted with different solvents on the tested strains (μL/L)

3 結論

肉桂精油、香芹酚和百里酚對三種有害食用畜禽健康的微生物白色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉都具有一定程度的抑殺作用，百里香酚和香芹酚對白色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制能力優于肉桂精油，肉桂精油對黑曲霉的抑制能力則優于百里香酚和香芹酚。使用香芹酚與肉桂精油進行復配可以明顯加強肉桂精油的抑菌效果，肉桂精油-香芹酚復配組合對白色葡萄球菌和黑曲霉都表現出了相加作用（FICI≤1），對白色葡萄球菌的FICI 為0.96，對黑曲霉的FICI 為0.72，與白色葡萄球菌相比，肉桂精油-香芹酚復配組合對黑曲霉抑菌能力的提升更高。GC-MS 分析結果顯示，肉桂精油具有抗菌作用的主要揮發性化學成分為肉桂醛，占總揮發性化學成分相對含量的78.19%。采用電子鼻分析溶劑稀釋對復配肉桂精油揮發性及熏蒸抗菌活性的影響，無水乙醇或丙二醇稀釋可以有效地促進復配肉桂精油中芳香成分的揮發，相同空間濃度下，這兩種復配肉桂精油的抑菌效果優于未使用溶劑稀釋的純復配肉桂精油和使用甘油或食用油稀釋的復配精油，但無水乙醇本身的基團會造成電子鼻S2、S6、S8 傳感器響應值過高，會對電子鼻的分析結果產生影響。綜合來看，選用香芹酚與肉桂精油進行復配，使用丙二醇作為溶劑對于肉桂精油抑菌能力的提升是最佳和影響最小的，以丙二醇為溶劑稀釋的肉桂-香芹酚復配組合精油是對食用畜禽有害微生物發揮穩定高效抗菌作用的最優選擇。