茯苓酸調節CCL2-CCR2信號軸對急性心肌梗死大鼠心肌損傷的影響

賴震宇 趙展慶 符妹垂

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動脈快速閉塞,導致血氧供應不足,從而引起心肌梗死,具有高發病率[1]。梗死愈合是一個復雜的過程,由于愈合受損將導致梗死擴張,加速左心室重塑,愈合質量將嚴重影響恢復結局[2],因此尋找AMI后有效的治療方法或者藥物至關重要。AMI后過度的炎癥反應導致心肌進一步損傷,因此早期及時抗炎治療對AMI患者至關重要,而中藥在此發揮顯著優勢,比如人參皂苷[3],莫諾苷[4]均被證明可通過抑制炎癥反應保護心肌細胞,減輕心肌壞死。茯苓酸是中藥茯苓提取物,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[5]。研究發現茯苓酸可通過抑制大鼠miR-24減輕阿霉素誘導的心力衰竭[6],說明茯苓酸對心肌具有保護作用,而關于茯苓酸對AMI的作用尚無報道。在梗死的心肌中,心肌細胞壞死引發強烈的炎癥反應,這不僅對心臟修復至關重要,而且會導致心臟的不良重塑和心力衰竭[7]。CC趨化因子在梗死的心臟中被顯著誘導,單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)-CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2,CCR2)介導大量單核細胞的募集,導致過度炎性反應[8]。有研究表明敲低CCR2可減少招募單核細胞到梗死部位,從而緩解梗死炎癥,促進心肌梗死愈合[9-10]。因此,本文探究茯苓酸對AMI大鼠心肌損傷的影響,及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只180～200 g雄性SD大鼠購自肇慶市瑞思元生物科技公司[SCXK(粵)2020-0053],本研究經醫院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 茯苓酸購自BioCrick;IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自酶聯生物;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒購自碧云天公司;CCL2、CCR2、Caspase-3、GAPDH抗體、HRP標記兔二抗購自CST公司。

1.3 左前降支結扎法構建AMI模型 首先戊巴比妥鈉將大鼠進行麻醉,然后于左胸第4、5肋骨間隙開胸,充分暴露心臟,結扎冠狀動脈左前降支,心電圖顯示ST段持續抬高則建模成功,并設置假手術組,只穿線,不結扎。

1.4 給藥與分組 將大鼠分為假手術組、模型組,低、中、高劑量茯苓酸組,每組15只。造模后低、中、高劑量茯苓酸組分別腹腔注射10、20、30 mg/kg茯苓酸[11];假手術組、模型組注射等量的0.9%氯化鈉溶液,連續14 d。

1.5 小動物超聲儀檢測心功能相關指標 末次給藥結束12 h后,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,用小動物超聲儀檢測心功能相關指標,左心室射血指標(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)。

1.6 樣品制備 大鼠進行心功能相關指標檢測后,尾靜脈取血,離心后獲得血清用于ELISA法檢測血清中炎癥因子水平;處死大鼠,取心臟組織,5只大鼠心臟組織多聚甲醛固定用于HE染色;5只大鼠心臟組織多聚甲醛固定用于TUNEL染色;5只大鼠心臟組織暫存于-70℃,用于western blot實驗。

1.7 ELISA法檢測大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平 使用IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒檢測大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.8 HE染色檢測心肌組織病理損傷 將多聚甲醛中固定的心臟組織,石蠟包埋制備病理切片,HE染色,光鏡下觀察大鼠心肌組織病理損傷。

1.9 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡 將多聚甲醛中固定的心臟組織,石蠟包埋制備病理切片,按照說明書進行TUNEL染色,計算TUNEL陽性率。

1.10 Western blot檢測心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達水平 將大鼠心臟組織,剪碎成小塊,加入裂解液RIPA,勻漿充分裂解,離心獲得上清即蛋白,將蛋白用BCA法進行定量,隨后進行western blot檢測,步驟為電泳,轉膜,脫脂乳封閉,孵育一抗(CCL2、CCR2、Caspase-3、GAPDH),孵育二抗,ECL顯色,凝膠成像系統拍照,分析蛋白灰度值(Image J軟件)。

2 結果

2.1 5組大鼠心功能相關指標比較 超聲心電圖結果顯示,與假手術組相比,模型組大鼠心功能相關指標LVEDD、LVESD均顯著升高,LVEF、LVFS顯著降低(P<0.05);與模型組相比,低、中、高劑量茯苓酸組大鼠心功能相關指標LVEDD、LVESD均顯著性降低,LVEF、LVFS顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠心功能相關指標比較 n=15,

2.2 5組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較 與假手術組相比,模型組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、中、高劑量茯苓酸組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較 n=15,ng/mL,

2.3 5組大鼠心肌組織病理損傷 HE染色結果表明,假手術組大鼠心肌組織結構完整,細胞有序排列;與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織結構被嚴重破壞,有大量炎性細胞浸潤;與模型組相比,低、中、高劑量茯苓酸組大鼠心肌組織結構逐漸恢復,炎性細胞浸潤減輕,且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 5組大鼠心肌組織形態(HE染色×200)

2.4 5組大鼠心肌細胞凋亡率比較 與假手術組相比,模型組大鼠心肌細胞TUNEL陽性率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,低劑量茯苓酸組、中劑量茯苓酸組、高劑量茯苓酸組大鼠心肌細胞TUNEL陽性率顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 大鼠心肌細胞凋亡(TUNEL染色×400)

表3 5組大鼠心肌細胞凋亡率比較 n=5,%,

2.5 5組大鼠心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達水平 與假手術組相比,模型組大鼠心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),與模型組相比,低、中、高劑量茯苓酸組大鼠心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表4,圖3。

圖3 Western blot檢測5組大鼠心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達;A 假手術組;B 模型組;C 低劑量茯苓酸組;D 中劑量茯苓酸組;E為高劑量茯苓酸組

表4 5組大鼠心肌組織CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表達水平比較 n=5,

3 討論

盡管心肌梗死患者的護理取得了重大進展,但心肌梗死后心力衰竭的發展仍然是心血管醫學中最大的問題之一[12],比如心肌梗死后過度炎性反應會加速左心室重塑,因此炎癥通路可能是預防心肌梗死后心肌損傷的重要靶點[13]。本文構建AMI大鼠模型,尋找可以抑制心肌梗死后炎性反應的藥物,從而減少AMI后心肌損傷。

近年來中藥在AMI治療中取得顯著進展,茯苓酸是中藥茯苓的特有成分,也是茯苓的主要活性成分之一,具有多種與藥效有關的藥理活性,目前茯苓酸已經引起廣泛關注,研究表明其具有抗炎,抗氧化及抗凋亡作用[14],因此本文想探究茯苓酸是否可發揮其抗炎以及抗凋亡作用減輕AMI引起的心肌損傷。

本文檢測不同組大鼠心功能指標,發現AMI大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF、LVFS降低,表明當發生AMI時,心臟收縮和舒張能力顯著性降低,經茯苓酸處理的AMI大鼠LVEDD、LVESD降低,LVEF、LVFS升高,表明茯苓酸有助于心臟收縮和舒張能力的恢復。接下來,檢測心肌組織病理變化,結果顯示AMI大鼠心肌組織結構被嚴重破壞,且有大量炎性細胞浸潤,表明AMI引起嚴重的炎性反應,經茯苓酸處理的AMI大鼠心肌組織結構逐漸恢復,炎性細胞浸潤減輕,表明茯苓酸可減輕AMI大鼠心肌損傷。

本文檢測血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平,結果顯示AMI大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著性升高,茯苓酸干預的AMI大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著性降低,表明茯苓酸抑制AMI大鼠炎性反應。細胞凋亡是細胞的程序性死亡,當機體受到應激時,啟動一系列防御機制發揮保護作用,加速細胞的凋亡,在AMI中心肌細胞凋亡是其主要機制[15]。本研究發現,經茯苓酸處理的AMI大鼠心肌細胞凋亡率顯著下降,表明茯苓酸可抑制心肌細胞凋亡。凋亡受多種蛋白調控,其中正常情況下caspase-3以酶原形式存在,應激時caspase-3被激活,從而啟動細胞凋亡[16]。本研究顯示,模型組大鼠心肌組織caspase-3蛋白表達量顯著升高,當茯苓酸處理AMI大鼠時心肌組織caspase-3蛋白表達量顯著降低,上述表明茯苓酸可通過抑制凋亡和炎性反應減輕AMI引起的心肌損傷。

趨化因子是由細胞因子組成的小的,高度保守的分泌蛋白家族,負責調節細胞運動[17]。其中有研究表明CC趨化因子的上調是心肌梗死后炎癥和修復反應的標志,及時有效地抑制趨化因子信號傳導可能保護梗死心臟免受不良重塑[18]。CCL2是CC趨化因子亞家族第一個被發現且充分研究的趨化因子,據報道CCL2可以與多種受體相結合,但其主要受體為CCR2,兩者結合后可在多種心血管疾病中發揮作用,包括動脈粥樣硬化[19],心力衰竭[20]等,因此猜測茯苓酸是否通過調節CCL2-CCR2信號軸發揮其減輕AMI大鼠心肌損傷的作用。本文檢測心肌組織CCL2、CCR2蛋白表達水平,結果顯示AMI大鼠CCL2、CCR2蛋白表達水平顯著上調,而當茯苓酸干預AMI大鼠時CCL2、CCR2蛋白表達水平顯著下調,表明茯苓酸可能通過抑制CCL2-CCR2信號軸改善AMI大鼠的心肌損傷。

綜上所述,茯苓酸可能通過CCL2-CCR2信號軸改善AMI大鼠的心肌損傷,但是否存在其他通路調控此過程,需進一步研究。