沉默miR-572經鐵死亡在腎癌細胞凋亡、索拉非尼耐藥中的作用機制

潘亮 暢雅學 段萬里 鄧騫

腎癌是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤性疾病,占成人惡性腫瘤的2%～3%,此病患者主要癥狀包括血尿、腰痛和腹部包塊等,對患者日常生活造成一定影響[1-2]。miRNAs是近年來腫瘤研究的熱點之一,是一種長度21～25個核苷酸的內源性非編碼基因,在人類基因組中可以序列特殊性方式調節30%～60%蛋白質編碼基因表達,在腫瘤的發生、發展中起著關鍵作用[3]。鐵死亡的出現與疾病的發生、發展及嚴重程度具有緊密的聯系,在多種疾病的進展中均會起到一定的調控作用。研究表明,鐵死亡能夠作為困擾全球健康的腎癌抑制靶點,為其治療方式及患者預后的改善情況開辟新的研究方向[4]。索拉非尼是治療腎癌的有效藥物治療,但因過度用于臨床且服藥周期較長,一些患者在使用過程中出現耐藥,導致療效不顯著,如何很好的改善索拉非尼耐藥是一個亟需解決的問題[5]。本文主要探究miR-572經鐵死亡在腎癌細胞凋亡、索拉非尼耐藥中的作用,對改善腎癌患者治療效果及預后具有重要意義,報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人腎癌細胞系786-0購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑:miR-572過表達質粒、miR-572 siRNA由廣州威佳科技有限公司合成;DMEM培養基購于上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號:ZQ-100);p53抗體、SAT1抗體購于上?？泼羯锟萍加邢薰?貨號:bsm-33058M、bs-17244R)。(3)主要儀器:光學顯微鏡購于北京億誠恒達科技有限公司(貨號:Contour Elite);熒光定量PCR儀購于武漢益普生物科技有限公司(貨號:CG-05)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將腎癌細胞放置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)、1%谷氨酰肽的DMEM培養基中并放置于含5% CO237℃細胞培養箱溫箱中,根據其生長情況2～3 d傳代或換液1次,當細胞密度長至80%～90%時,使用胰蛋白酶消化傳代進行后續實驗。

1.2.2 細胞轉染:取對數生長期的腎癌細胞,將其分為空白組(不做處理)、過表達組(腎癌細胞+miR-572過表達質粒)、沉默組(腎癌細胞+miR-572 siRNA)3組,每組2個復孔且分別加入100 μL 1×105個/mL細胞濃度的細胞懸液,當細胞培養至對數生長期時,在空白組、過表達組、沉默組分別加入常規細胞培養液做空白處理,miR-572 過表達質粒、Lipofectamine 2000試劑行過表達轉染,miR-572 siRNA、Lipofectamine 2000試劑行沉默轉染。

1.2.3 miR-572表達量:采用實時熒光定量PCR法檢測miR-572表達量,實驗步驟:腎癌細胞轉染成功,Trizol法提取細胞中總RNA,應用mRNA逆轉錄試劑盒行逆轉錄獲得cDNA,GAPDH為內參,提取細胞總RNA。miR-572引物序列:miR-572上游引物:5’-GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA-3’,miR-572下游引物:5’-UGGGCCACCGCCGAGCGGAC-3’,設計引物反應條件:預變性95℃ 5 min:94℃ 20 s,56℃ 20 s;72℃ 1 min,40個循環,2-ΔΔCt計算miR-572表達量。

1.2.4 腎癌細胞凋亡:采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,取各組對數生長期腎癌細胞接種于6孔板培養48 h,收集腎癌細胞,PBS洗滌2次,調整細胞濃度為1×106/mL,70%冷乙醇固定,4℃過夜,PBS洗滌3次,再離心,去掉上清液及乙醇,并用Annexin V-FITC室溫避光條件孵育15 min,用流式細胞儀進行熒光檢測。

1.2.5 腎癌細胞索拉非尼耐藥:以人腎癌細胞系786-0為誘導對象,索拉非尼為誘導藥物,索拉非尼起始濃度為2.5 μmol/L,在25 cm2細胞培養瓶中,待786-0細胞生長密度達到80 %并且細胞狀態良好時,換成1 %雙抗、10 %胎牛血清,2.5 μmol/L索拉非尼的1640培養基,置于37℃、5% CO2孵箱內繼續培養,開始耐藥篩選。每天觀察細胞的生長狀態,待細胞生長至覆蓋瓶底約90 %左右時按1∶2進行傳代并凍存細胞以備使用。2.5 μmol/L索拉非尼作用細胞傳代大約15代左右并且細胞能夠在該濃度藥物作用下穩定生長并傳代后,增加藥物濃度至5 μmol/L繼續篩選。每次在同一藥物濃度下作用細胞大約傳代15代左右穩定后增加藥物濃度,采用低濃度梯度法,分別以2.5、5、7.5、10 μmol/L的濃度梯度培養細胞,每個劑量設置3個復孔,培養72 h后,再加入CCK8試劑(10 μL/孔),培養1 h后,以空白組為對照,測定每組OD450值,以藥物濃度為橫軸,OD450值為縱軸,繪制濃度-效應曲線,確定半數抑制濃度(IC50),實驗至少重復3次;用固定的索拉非尼濃度(4.91 μmol/L)處理每組細胞,CCK8法檢測索拉非尼對腎癌細胞IC50值(IC502),采用IC501/IC502結果判定腎癌細胞索拉非尼耐藥,其中值越大則說明能力越強。

1.2.6 p53-SAT1-ALOX15信號通路蛋白表達量:采用Western blot法檢測p53-SAT1-ALOX15信號通路蛋白表達量,實驗步驟:使用BCA試劑盒檢測蛋白含量,120℃,10 min,電泳凝膠分離,將蛋白轉運到PVDF膜上,溫室封閉2 h,加一抗,4℃下室溫孵育過夜,漂洗3次,15 min/次,加二抗,1 h室溫孵育,反復漂洗3次,15 min/次,以β-actin為內參,計算蛋白表達量。實驗均重復3次。

2 結果

2.1 3組miR-572表達量比較 沉默組miR-572表達量低于空白組,過表達組miR-572表達量高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05);沉默組miR-572表達量低于過表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組miR-572表達量比較

2.2 3組腎癌細胞凋亡比較 沉默組24 h、48 h腎癌細胞凋亡率高于空白組,過表達組24 h、48 h腎癌細胞凋亡率低于空白組,差異有統計學意義(P<0.05);沉默組24 h、48 h腎癌細胞凋亡率高于過表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 腎癌細胞流式細胞凋亡圖

表2 3組腎癌細胞凋亡比較

2.3 3組腎癌細胞IC50相對值比較 沉默組IC50相對值低于空白組,過表達組IC50相對值高于空白組,差異均有統計學意義(P<0.05);沉默組IC50相對值低于過表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組腎癌細胞IC50相對值比較

2.4 3組p53-SAT1-ALOX15信號通路蛋白表達量比較 沉默組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達量高于空白組,過表達組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達量低于空白組,差異均有統計學意義(P<0.05);沉默組p53、SAT1、ALOX15蛋白表達量高于過表達組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 p53-SAT1-ALOX15信號通路蛋白WB圖

表4 3組p53-SAT1-ALOX15信號通路蛋白表達量比較

3 討論

據數據統計,腎癌多發于50～70歲人群,近年來,我國此病的發病率呈逐年上升的趨勢,城市地區發病率高于農村地區,男性多于女性,男女患者比例約為2∶1[6-7]。目前臨床上對于腎癌的病因尚未明確,認為此病的發生可能與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓等因素密切相關[8]。眾多研究顯示,miRNAs對多種惡性腫瘤的生物學行為具有調控作用,進而在腫瘤發生、發展中起重要作用[9]。李玖玲等[10]研究顯示,miR-299-3p在腎癌中可通過調控腎癌細胞EMT信號通路相關蛋白表達量,進而對腎癌細胞增殖、遷移、侵襲等產生影響。miR-572在近年來被證實與多種癌癥發生、發展密切相關。研究表明,miR-572在腎癌中呈高表達,可能通過參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等,有望成為腎癌預后的一種標志物[11-12]。本研究表明,miR-572表達異常與腎癌細胞凋亡、索拉非尼耐藥密切相關,有望成為腎癌早期診斷及術后檢測的腫瘤標志物和潛在的治療靶點,對腎癌的診斷和治療及預后具有重要意義。

臨床研究顯示,惡性腫瘤細胞可通過凋亡這種無害的方式被清除,進而對腫瘤的發生、發展起抑制作用[13-14]。本文采用miR-572過表達質粒、miR-572 siRNA對腎癌細胞分別過表達和沉默其表達,進而研究miR-572對腎癌細胞凋亡的影響,結果顯示,沉默miR-572可有效促進腎癌細胞凋亡,為揭示腎癌發生、發展的分子機制提供了新的理論依據;但本研究并未涉及miR-572對腎癌細胞增殖、侵襲、遷移等方面的探究,存在一定局限性。索拉非尼一方面可通過作用多種信號通路,對腫瘤的發生、發展起關鍵調控作用;另一方面則通過阻斷新生腫瘤血管形成,阻滯腫瘤發展[15]。鮑一等[16]認為,索拉非尼耐藥是由基因改變引起的,研究表明CXCR4與索拉非尼耐藥呈線性相關。本研究采用IC50相對值檢測各組腎癌細胞索拉非尼耐藥,結果表明沉默miR-572可有效降低IC50相對值,進而降低索拉非尼耐藥,提高腎癌細胞靶向治療的效果;但本研究并未對miR-572在索拉非尼耐藥中的具體機制進行探究,存在一定局限性。

鐵死亡是一種新的以鐵依賴性的過氧化物集聚為特征的程序性細胞死亡方式,亦是區別于典型的凋亡和其他程序性死亡的新型系細胞死亡模式,目前已成為生物學研究和醫學研究的熱點[17]。p53-SAT1-ALOX15信號通路中p53是目前已知的重要抑癌基因,可介導細胞周期停滯、衰老、凋亡等,近年來研究表明,p53在細胞代謝、氧化反應和鐵營養細胞死亡中具有新作用[18]。p53在腫瘤細胞鐵死亡過程中發揮關鍵的調節作用,其在腫瘤細胞中表達升高,可減少胱氨酸攝取、GSH合成,抑制對谷胱甘肽過氧化物酶4活性,最終誘導細胞鐵死亡[19]。有研究顯示,SAT1是一種限速酶,由多胺分解代謝產生,其是p53的轉錄靶點,若其表達上調則可誘導脂質過氧化,細胞在活性氧誘導的應激下發生鐵下垂,進而對細胞鐵死亡產生調控作用[20-21]。鐵死亡在疾病的發生、發展和治療中的臨床意義已逐漸顯現,本研究表明,沉默miR-572可能通過上調p53、SAT1、ALOX15蛋白表達量,激活p53-SAT1-ALOX15信號通路誘導細胞鐵死亡,阻滯腎癌發生、發展。

綜上所述,本研究表明,沉默miR-572可能通過上調p53、SAT1、ALOX15蛋白表達量,激活p53-SAT1-ALOX15信號通路,進而激活鐵死亡,促進腎癌細胞凋亡,抑制索拉非尼耐藥,有望成為腎癌治療潛在新靶點。