市場雞沙門氏菌分離鑒定及致病性研究

陳小嬌，張 妹，蔡曉慶，康翠翠，郝再翠，毛東有，李濱洲，王全武，陳文平,2*

（1.北京市華都峪口禽業有限責任公司，北京 平谷 101206；2.國家蛋雞產業技術體系平谷綜合試驗站，北京 平谷）

沙門氏菌是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病原菌。雞是沙門氏菌主要的宿主，雞群感染沙門氏菌后其死亡率高達80%[1]。在家禽養殖場中，常見的雞沙門氏菌為雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和雞副傷寒沙門氏菌。雞群一旦感染終身帶菌，且會導致雞群生產性能下降、死亡率增加，種蛋孵化率降低，其危害貫穿于整個飼養周期，給養殖戶帶來嚴重的經濟損失。臨床上廣泛應用抗生素治療沙門氏菌病，然而抗生素的濫用導致細菌對抗生素藥物的耐藥性越趨嚴重化，藥物選擇壓力不斷增大，已成為嚴重的公共衛生問題[2]。試驗對不同沙門氏菌對雞的致病性及藥物敏感性進行研究，對分離到的菌株進行分離培養和鑒定，同時將分離到的3株菌株接種于1日齡雛雞，觀察雞只臨床發病情況、死亡情況等，探討不同菌株致病力強弱。同時對雞沙門氏菌進行體外藥敏試驗，從而測定該雞場沙門氏菌的耐藥情況，同時篩選出一種效果較好的藥物，為雞沙門氏菌病的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病料來源于市場3個不同場區發病雞只。

1.1.2 試劑和儀器 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、膽硫乳瓊脂（DHL）購自北京陸橋技術有限責任公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；沙門氏菌引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；電熱恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺購自北京亞泰科隆儀器技術有限公司；PCR擴增儀購自美國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；凝膠電泳成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.1.3 試驗動物 試驗雞群為京紅1號商品代1日齡雛雞，由北京市華都峪口禽業有限責任公司無沙門氏菌發病史和免疫史場區提供。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌的分離鑒定 將送檢的病料分別接種于普通肉湯中，置于36±1 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h；從中吸取1 mL接種于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，置于36±1 ℃ 恒溫培養箱中培養18～24 h；用接種環從亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中蘸取菌液劃線接種于膽硫乳瓊脂（DHL）培養基中，置于36±1 ℃ 恒溫培養箱中培養16～18 h，觀察菌落形態。

1.2.2 分子鑒定 根據沙門氏菌stn基因核苷酸序列設計引物[3]，由上海生工生物工程公司合成。擴增產物長度為260 bp，引物如下：stn-F: 5'-CTTTGGTCGTAAAATAAG GCG- 3 ',stn-R: 5 '-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3'。

圖1 細菌分離圖A. 病料1純化菌落；B. 病料2純化菌落；C、D. 病料3純化菌落。

參照大連寶生物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒方法提取核酸，用上述引物進行PCR鑒定，反應體系為25 μL：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，Forward primer（25 mmol/L）5×0.5 μL，Reverse primer（25 mmol/L）5×0.5 μL，DNA模板2 μL，超純水5.5 μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性1 min；55 ℃ 退火1 min；72 ℃ 延伸1 min；共25個循環，最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。取 PCR產物7 μL置于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，結束后置于凝膠成像系統中觀察結果。將陽性擴增產物送至北京生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果提交NCBI BLAST進行比對分析。

1.2.3 動物感染試驗 為更好地模擬發病雞群癥狀，將1日齡健康雛雞80只隨機分為4組，每組20只。試驗1～3組雞群分別灌胃從各組發病雞群中分離出的菌液0.1 mL（4×107CFU/mL）。對照組灌胃0.1 mL生理鹽水。雞群自由飲水、采食，觀察其發病及死亡情況，對死亡雛雞立即進行剖檢，觀察各臟器變化。

1.2.4 藥敏實驗 將分離的菌株按照CLSI[4]推薦的K-B法對6種抗生素進行藥物敏感性檢測，丁胺卡那、恩諾沙星、強力霉素、氧氟沙星、林可霉素、新霉素。將上述分離菌株接于營養肉湯中，37 ℃ 培養24 h后，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于營養瓊脂平板上，將制備好的藥敏片貼于營養瓊脂平板上，36±1 ℃ 恒溫培養18～24 h后用直尺測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 沙門氏菌的分離培養結果 選擇性增菌培養后，挑取疑似沙門氏菌菌落純化于DHL培養基中，病料1分離菌株為無色半透明菌落，菌落中心幾乎全黑，將其命名為A菌；病料2分離菌株為無色半透明菌落，將其命名為B菌；病料3分離菌株出現兩種疑似沙門氏菌形態的菌落，分別挑取純化，發現均為無色半透明菌落，一種菌落中心幾乎全黑，將其命名為C菌；一種菌落無黑色，其命名為D菌（圖1）。

2.2 分子鑒定及基因測序檢測結果

將分離到的4株菌進行DNA提取后進行普通PCR鑒定，如圖2所示，4株菌均為沙門氏菌。將擴增產物送檢至生工生物進行測序，經對比后確定4種菌株均為沙門氏菌，其中菌株B和C1為雞白痢沙門氏菌，菌株A和C2為非雞白痢沙門氏菌。

圖2 各分離菌株沙門氏菌PCR擴增電泳圖M為DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2. 陽性對照；3. 病料1純化菌落；4. 病料2純化菌落；5、6. 病料3純化菌落。

2.3 動物感染試驗結果

選擇同批次試驗雞群剖檢后采集肝臟進行病原分離，無沙門氏菌檢出。試驗1組雞群灌胃A菌，試驗2組雞只灌胃B菌，試驗3組雞只灌胃C1和C2混合菌，比例為1:1。

2.3.1 感染后雞群臨床現象及死亡情況 從臨床現象看，雞只感染后24 h，試驗組雞群均出現精神沉郁現象，與對照組相比，攻毒后48～72 h試驗組雞群糞便稀??；感染后72～96 h后試驗雞只排血便。

從感染后雞群各時間段累計死亡率結果看，雞白痢標準菌株死亡率達50%～55%，非雞白痢標準菌株死亡率達到30%；攻毒后120 h雞白痢菌株死亡率達到100%，非雞白痢標準菌株死亡率達到60%，120～264 h非雞白痢標準菌株死亡率達到70%，見表1。

2.3.2 死亡雞只剖檢癥狀 對死亡雞只進行剖檢，試驗1組雞只剖檢心尖有不同程度白色硬化，肝臟為土黃色，肝臟、脾臟有壞死點，脾臟和膽囊腫大、直腸脹氣、有出血點；試驗2組雞只肝臟有出血點，脾臟腫大，腎腫大，膽囊充血；試驗3組雞只剖檢情況與試驗1組相似，心尖有不同程度白色硬化，肝臟呈土黃色，肝臟和脾臟有壞死點，膽囊及直腸充血。心尖不同程度白色硬化、脾臟腫大、肝臟有壞死點、腸道脹氣及有出血點，剖檢圖片見圖3。

圖3 臨床剖檢圖

2.4 藥敏實驗

藥敏試驗結果顯示，3組分離菌株均對丁胺卡那、林可霉素類抗生素藥物敏感，對氧氟沙星、強力霉素、恩諾沙星耐藥（表2）。

表2 分離株藥敏結果

3 討論

沙門氏菌的致病能力取決于細菌的致病力和宿主的易感性[5]。沙門氏菌均有致病性，該菌感染不同畜禽可導致多種不同疾病，每種疾病的臨床癥狀表現出多樣性，受到許多因素的影響，如菌株毒力、品種、日齡、環境刺激等。本實驗模擬雞只發病情況，發現雞白痢標準菌株致死率較高，雞群感染后集中死亡，死亡速度較快，而非雞白痢標準菌株致死率低于雞白痢標準菌株，死亡時間比雞白痢標準菌株晚。本實驗結果表明，雞白痢標準菌株對雞的致病力強，而其他沙門氏屬對雞的致病力相對較弱，與市場反饋情況一致。如果雞群發生沙門氏菌疾病，建議使用丁胺卡那、林可霉素藥物治療效果較好。

沙門氏菌是雞腸道菌群中的傳染病病原菌之一，養雞行業處于廣泛使用抗菌藥物和不規范使用的現狀，導致其耐藥性變得越來越嚴重，導致耐藥和多重耐藥問題的出現和傳播，嚴重限制了雞沙門氏菌的有效治療。本試驗分離的3株沙門氏菌對丁胺卡那、林可霉素類抗生素藥物敏感，對氧氟沙星、恩諾沙星抗生素藥物低敏感或不敏感，后續可利用敏感藥物對商品代雛雞沙門氏菌病進行防控。耐藥性的常規監測，不僅有助于沙門氏菌的防控措施的實施，且對于細菌耐藥性的問題具有重要的意義。該試驗為雞沙門氏菌病臨診藥物的選擇提供參考，用藥應依據藥敏試驗結果確定首選藥物，為避免耐藥性的發生或延長藥物使用的有效性，建議選擇2～3種敏感藥物進行預防與治療。

4 結論

動物沙門氏菌病是長期以來危害我國畜牧業的重要疫病，是國家中長期動物疫病防治規劃優先防治的病種。沙門氏菌均有致病性，而雞沙門氏菌病的臨床癥狀差異較大，這取決于感染雞的細菌的血清型，其中雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌具有專嗜性，僅使雞和火雞發病。本研究進一步驗證，標準雞白痢標準菌株比非雞白痢沙門氏菌對雞的致病力強，雞群攻毒后非雞白痢雞傷寒沙門氏菌比標準雞白痢雞傷寒沙門氏菌發病時間、感染時間要推遲1天。通過藥敏試驗進一步擴展了對于雞沙門氏菌耐藥譜以及耐藥嚴重程度的認識，同時篩選出對其不同菌株有效的藥物，對于雞沙門氏菌起到治療效果，為疾病的防控與治療提供參考。