CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物抗病性改良中的應用綜述

朱宗財 王志軍 高能 武冬梅

摘要：植物病害是影響作物生長的重要因素之一，對世界糧食安全構成很大的威脅，培育優良的抗病品種成為最優策略。CRISPR/Cas9基因編輯技術自問世以來備受關注，因該系統簡單、高效、穩定的特點，逐漸成為分子育種領域重要的技術手段。本綜述簡單回顧了CRISPR/Cas9基因編輯技術的技術原理和在植物中的應用情況，系統總結了該技術在植物抗真菌、細菌和病毒方面的應用。還列舉了可用于提高植物抗病性的基因位點以及真菌、細菌和病毒等病原物的致病相關基因位點編輯應用情況，探討了該技術主要的優勢和不足，以及未來應用的前景和挑戰，以期為今后研究提供參考和借鑒。

關鍵詞：CRISPR/Cas9；基因編輯技術；植物抗病性；抗病性改良；抗病育種

中圖分類號：S432.1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0001-11

植物病害是影響作物生長的重要因素之一，因植物病害引起的作物減產高達20%左右，對世界糧食安全構成很大的威脅［1］。雖然化學藥劑的使用一定程度上可以降低植物病害帶來的危害，但由于化學藥劑的特性，對人類健康和自然環境帶來潛在的風險［2］，因而，嚴重依賴化學藥劑的農業生產方式是不可持續的，迫切需要綠色環保、有效可靠的方式為農業生產保駕護航［3］。近年來，隨著一些生物農藥的成功研制，為植物病害的防治帶來了新的手段，但存在防治效果緩慢、易受環境因素的制約與干擾等問題，所以目前植物病害的防治仍然以化學防治為主，生物農藥僅占全球作物保護市場的5%［4］。因此，培育優良的抗病品種成為最優策略［5］。

不管是傳統的作物育種還是近年來迅速發展的分子育種，本質上兩者都是促進基因間的交流，但分子育種的優勢在于能夠定向的設計和操作，實現從傳統的經驗育種到定向高效的精準育種的躍升［6］。CRISPR/Cas9基因編輯技術因能夠精準地對生物體基因組特定目標基因進行修飾，而逐漸成為分子育種領域的重要技術手段，廣泛應用于農業、醫療、工業等領域［7-8］。

1 CRISPR/Cas9系統

CRISPR/Cas系統廣泛存在于原核生物基因中，是細菌和古細菌為應對病毒和質粒的不斷攻擊而進化出的RNA介導的適應性防御系統［9］。CRISPR/Cas系統分為3類，分別是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR系統利用Cas蛋白與crRNAs的復合物介導對靶標DNA識別與剪切，Ⅱ型CRISPR系統則是通過RNA引導的內切酶Cas9以及2種非編碼crRNA和tracrRNA識別并剪切靶標DNA［10］。2012年，Jinek等發現一種雙鏈RNA，即tracrRNA-crRNA，它能夠指導Cas9蛋白在特定位點剪切雙鏈DNA，并且將tracrRNA-crRNA二元復合體改造為單鏈RNA嵌合體后，仍能夠指導Cas9蛋白［11］。2013年Cong等首次利用CRISPR/Cas9系統實現了基因敲除［12］。隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas9系統不僅僅用于基因敲除，而且在內源基因表達的調控、染色體位點活細胞標記、單鏈RNA編輯、高通量基因篩選等方面也得到了應用，并且因該系統簡單、高效、穩定的特點，迅速吸引了眾多科學家在動植物育種、藥物篩選等相關領域展開研究［13］。

1.1 CRISPR/Cas9系統的技術原理

CRISPR/Cas9系統由單向導RNA（single guide RNA，簡稱sgRNA）和核酸內切酶Cas9組成［11］，其中crRNA和tracrRNA融合形成sgRNA，crRNA則是RNA酶Ⅲ加工CRISPR轉錄成的一條長的RNA分子（Precursor crRNAs，pre-crRNAs）后形成的，tracrRNA 則是與crRNA互補的一段序列［14］。Cas9包含HNH和RuvC核酸酶結構域，其中HNH域是單個域，而RuvC域由3個子域組成，分別是RuvC-Ⅰ、RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ，RuvC-Ⅰ在Cas9氨基端，RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ位于HNH兩側［15］。Cas9在sgRNA的引導下到達靶標基因位點解開DNA雙鏈，使crRNA與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態，然后由Cas9蛋白的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA 鏈（目標鏈），RuvC活性位點剪切非互補鏈（非目標鏈），最終產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break，簡稱DSB）［9，15］。當產生DSB后，會觸發細胞內DNA修復機制，在無修復模板時，非同源末端連接（nonhomologous end joining，簡稱NHEJ）修復機制被激活，在DSB位置出現隨機插入、缺失或替換；當存在同源性供體DNA修復模板時，通常會觸發同源定向修復（homology directed repair，簡稱HDR）機制，形成手術刀式的精確修飾［15］。在實際應用中，crRNA序列是與靶標基因同源的20個核酸序列，tracrRNA為通用序列，并且靶標基因位點緊鄰PAM序列（通常是PAM序列上游 3 bp 處），當PAM序列為NGG（N為任意堿基）序列時切割效率最高［16］（圖1）。

1.2 CRISPR/Cas9系統在植物中的應用

CRISPR/Cas9基因編輯技術因操作方便、成本低廉、編輯效率高等特點，已經成為植物基因編輯的有力工具之一［17］。隨著研究的不斷深入，經過改造的CRISPR/Cas9系統已廣泛應用于擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯，作用方式包括基因敲除、基因組缺失、順式調控元件的破壞、基因敲入和病毒感染的抑制等，并且獲得較高的誘導突變率和可穩定遺傳的基因組編輯植株［18-19］。該技術不僅可以對單個靶標進行編輯，而且能夠實現多靶標編輯，Ma等開發了一種能夠對多個基因位點（最多8個）編輯的CRISPR/Cas9系統，并成功應用于水稻和擬南芥的水稻類成花素家族（FT-like）功能的研究［20］。CRISPR/Cas9基因編輯技術的基因敲入或替換主要依賴于細胞的HDR機制，由于HDR僅在S期和G2期晚期活躍，而NHEJ在除有絲分裂外的整個細胞周期中均比較活躍。因此，基因敲入或替換的編輯效率較低［21］，但仍在許多植物中實現了基因片段的精確敲入或替換。例如，在玉米、水稻等植物中已有相關報道［22-24］。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術也開始應用于植物與病原物互作的研究中，對于提高植物抗病性具有重大意義［25］。

2 CRISPR/Cas9系統在植物抗真菌中的應用

2.1 編輯寄主基因產生抗病性

CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現為真菌研究領域帶來了巨大的變革。2015年，Ndvig等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術有效地將定向突變引入到構巢曲霉菌（Aspergillus nidulans）中［26］。同年Matsu-Ura等發現，該技術同樣可以有效編輯粗糙鏈孢霉菌（Neurospora crassa），并猜想可能還適用于鏈孢霉屬自然分離物和絲狀真菌的基因編輯［27］。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術已成功構建OsERF922和Pi21等基因缺失的突變株系，與野生型相比，突變株系對稻瘟病的抗性均有所提高，而不影響主要農藝性狀［28-30］。小麥受體類細胞質激酶基因TaPsIPK1是一個已知的被銹病效應蛋白靶向的易感基因，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除TaPsIPK1基因的突變株系對小麥條銹病病原菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）能夠產生廣譜抗性，農藝性狀同樣未受到影響［31］。TCP轉錄因子在植物生長發育、激素合成、信號轉導以及對生物和非生物脅迫的響應中發揮重要作用，而大豆在感染大豆赤霉病后，TCP基因會被顯著誘導［32］。因此，Fan等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在大豆品種Williams 82中特異性誘導GmTCP19L靶向突變，發現GmTCP19L直接或間接調節大豆對赤霉病的抗性［33］。CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅用于糧食作物病害的研究，還應用于蔬菜病害的研究。研究顯示，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術同時敲除番茄中的miR482b和miR482c基因，能夠提高番茄對晚疫病的抗性，并且同時敲除miR482b和miR482c比單獨敲除miR482b的抗性更強［34］。晚疫病同樣也是危害馬鈴薯的主要病害之一，在我國發生較為普遍。Moon等將StSR4基因通過CRISPR/Cas9基因編輯技術引入馬鈴薯原生質體中，產生StSR4基因缺失的突變株系，盡管對晚疫病的抗性有所提高，但馬鈴薯的生長受到抑制［35］。

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是土傳真菌病原中最具代表性的病原之一，危害棉花、番茄、香蕉和甜瓜在內的許多重要作物，造成巨大的經濟損失。植物磺肽素（phytosulfokine，簡稱PSK）是一種二硫酸五肽植物激素，在植物生長發育以及植物免疫調節方面發揮重要作用［36-37］。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除編碼PSK前體的Clpsk1基因，發現Clpsk1功能喪失后的西瓜幼苗，增加了對尖孢鐮刀菌的抗性［38］。陸地棉為異源四倍體，導致傳統基因編輯技術的應用存在一定困難，因此Zhang等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功將Gh14-3-3d基因插入陸地棉中，突變株系顯著增加了對大麗輪枝菌的抗性［39］。通常CRISPR/Cas9系統包含2個啟動子，分別用來啟動Cas9蛋白和sgRNA。2021年，Mishra等首次使用單個啟動子的CRISPR/Cas9系統，對辣椒的易感基因CaERF28進行缺失突變，與野生型相比，抗炭疽病能力明顯增強［40］。CRISPR/Cas9系統直接編輯寄主基因提高對真菌病害的抗性詳見表1。

2.2 編輯真菌基因產生抗病性

小麥穎枯病是由穎枯殼針孢（Parastagonospora nodorum）引起的小麥死體營養型真菌病害，研究顯示CRISPR/Cas9基因編輯技術可用于P. nodorum反向遺傳的研究，并且在NHEJ途徑和HR途徑均進行了驗證［41］。子囊菌亞門稻綠核菌屬稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）是稻曲病的致病因子，研究人員以U. virens的Gln-tRNA為啟動子構建了Cas9-gRNA載體，并轉化至U. virens菌株的原生質體中，有效地靶向缺失U. virens中的USTA和UvSLT2基因［42］。由于疫霉（Phytophthora）同源重組率低，所以無法有效對其進行基因編輯。2017年Fang等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在大豆疫霉（P. sojae）中建立基因編輯體系，而且在其他疫霉的基因編輯研究中提出優化方案，為更深層次的研究提供了新思路［43］。環磷酸腺（cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP）信號通路在控制植物病原體的形態變化和致病性方面發揮重要作用［44］。PcPdeH是一種編碼高親和力磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的基因，是cAMP信號通路的關鍵調節因子［45］。在辣椒疫霉（P. capsici）中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得PcPdeH缺失的突變菌株，突變菌株表現出營養生長缺陷的現象，并且與野生型菌株相比毒力顯著降低［46］。尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）作為典型的土傳病害，能夠引起植物產生多種病害，最常見的則為枯萎病，植物感染后表現出褪綠、壞死、發育遲緩和萎蔫等癥狀［46］。Wang等基于同源性靶向整合（homology-independent targeted integration，簡稱HITI）和同源性重組整合（homology-dependent recombination Integration，簡稱HDRI），利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功建立尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）等真菌的內源性基因標記（endogenous gene tagging，EGT）系統，為闡明尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）毒力因子及發病機制提供了強有力的技術手段［47］。

3 ?CRISPR/Cas9系統在植物抗細菌中的應用

3.1 編輯寄主基因產生抗病性

植物細菌病害防控水平取決于植物病原細菌學的基礎研究水平和創新能力［48］，假單胞桿菌屬（Pseudomonas）作為植物病原細菌主要類群之一，造成的危害主要是葉斑、葉枯、萎蔫。丁香假單胞菌番茄致病變種（P. syringae pv. tomato DC3000，Pto DC3000）是番茄細菌性斑點病的致病因子，主要通過氣孔和傷口入侵番茄，而Pto DC3000入侵番茄后，則產生刺激氣孔打開和促進細菌定殖的冠菌素（coronatine，COR），SlJAZ2蛋白是氣孔保衛細胞中COR的主要供受體，Ortigosa等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯SlJAZ2基因，產生C端結構域缺失的突變體，進而通過COR阻止氣孔重新開放，增加了對Pto DC3000的抗性［49］。蘋果火疫病是由梨火疫歐文氏桿菌（Erwinia amylovora）侵染所引起的一類毀滅性病害，E. amylovora的致病基因DspA/E編碼的致病效應子與蘋果易感蛋白MdDIPM4相互作用觸發植物感染，因此，有研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除MdDIPM4，以降低對E. amylovor的敏感性［50］。水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌白葉枯致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的一種細菌性病害，提高水稻自身抗性是一種經濟有效的辦法。水稻Os8N3（也稱為OsSWET11）基因是轉錄激活類因子（transcription activator-like effector，TAL effector）誘導的易感基因。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除水稻Os8N3（OsSWET11）基因的突變株系，顯著增強了對Xoo的抗性，且農藝性狀未發生顯著變化［51-53］。柑橘潰瘍病由該菌的亞種地毯黃單胞桿菌（X. axonopdis pv. citri）引起的典型病害之一，會造成柑橘葉子、莖和果實產生壞死、隆起的病變，導致落葉落果，嚴重影響作物的產量和品質。X. axonopdis pv. citri通過PthA4（一種轉錄激活效應器）誘導潰瘍易感性基因LOB1的表達，因此，Peng等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對晚錦橙易感基因CsLOB1進行基因編輯，由于晚錦橙含有3個拷貝的CsLOB1G等位基因和1個拷貝的CsLOB1-等位基因，因此，設計了5個sgRNA進行編輯，僅對CsLOB1G敲除后明顯增強了對柑橘潰瘍病的抗性［54］。Jia等同樣利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對葡萄柚的雙等位基因TI-LOBP和TI-LLOBP進行敲除，雙突變株系的抗性顯著增強［55］。香蕉作為一種重要的經濟作物，同樣受到黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）的危害，其致病菌為香蕉黃單胞菌（X. campestris pv. musacearum，Xcm），目前，只有野蕉（Musa balbisiana）對Xcm具有抗性，而其余栽培種均不具備對Xcm的抗性［56］。有研究顯示，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術對易感基因DMR6進行基因編輯，獲得DMR6缺失的突變株系，顯著增強了香蕉對病原細菌的抗性［57］。

由于傳統的CRISPR/Cas9基因編輯技術在編輯雙等位基因存在編輯效率不高的問題，所以甜橙仍然難以產生雙等位/純合突變體。因此，Huang等對CRISPR/Cas9系統進行改進，將35S啟動子替換為CsUbi（citrus sinensis ubiquitin，簡稱CsUbi）啟動子或CmYLCV（cestrum yellow leaf curling virus，簡稱CmYLCV）啟動子，該系統能夠顯著增強甜橙的編輯效率［58］。目前，大多數報道主要針對一個特定基因的sgRNA突變，且大部分突變位點被選擇在基因編碼區，但由于一些基因含有特殊功能，因此不能采取此方法來進行編輯。例如，Xa13基因為多功能性基因，不僅參與調節水稻對白葉枯病的抗性，而且還參與花藥的發育。因此，Li等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術僅對Xa13基因啟動子的部分序列進行編輯，獲得了抗水稻白葉枯病但不影響正?；ㄋ幇l育和結實的突變株系［59］。CRISPR/Cas9直接編輯寄主基因提高對細菌性病害的抗性詳見表2。

3.2 編輯細菌基因產生抗病性

明確植物病原物致病機制通常需要挖掘產生致病因子基因的功能，但大多數分子生物學技術僅適用于某種類型致病變種的基因編輯。因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術的優勢可以得到充分體現。假單胞菌屬（Pseudomonas）是自然界種類最多、生態意義最大的革蘭氏陰性菌群，丁香假單胞菌（P. syringae）是與植物相關性最大的一類假單胞菌，可引起植物多種病害的發生。例如，丁香假單胞菌番茄致病變種（P. syringae pv. tomato）和丁香假單胞桿菌菜豆暈疫病致病變種（P. syringae pv. phaseolicola）等。Martí等將Cas9核酸酶和sgRNA融合表達至pSEVA質粒后，轉化至P. syringae pv. tomato和P. syringae pv. phaseolicola，從而達到基因編輯的目的［60］。黃褐假單胞菌（P. fulva）能夠侵染辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯等多種植物，Zhang等基于HDR和噬菌體λ-Red重組系統，利用CRISPR/Cas9系統開發了一種高效便捷的P. fulva基因編輯方法，并且編輯效率可達100%［61］。黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）是一類重要的植物病原細菌，產生了多種致病種，主要危害水稻、番茄和柑橘等多種作物。Xoo菌株通常使用高度保守的Ⅲ型分泌系統（T3SS）將毒力效應物輸送到水稻細胞中，并進一步抑制宿主的免疫，而對Xoo菌株基因組的編輯將有助于增加對其致病因子的研究。Jiang等利用內源性I-C CRISPR/Cas系統實現了Xoo菌株各種精確、高效的基因編輯，包括缺失、插入、堿基替換等，此系統將有助于植物病原細菌致病機制的研究，為宿主-病原物互作研究提供理論基礎［62］。目前，尚未見利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對植物病原細菌歐氏桿菌屬（Erwinia）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和棒桿菌屬（Corynebacterium）進行相關研究的報道。

4 CRISPR/Cas9系統在植物抗病毒中的應用

4.1 編輯寄主基因產生抗病性

以CRISPR/Cas9基因編輯技術為代表的抗病毒工程成為預防和控制植物病毒的有效策略，馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒中最大的一個屬，可危害多種作物，造成重大的經濟損失［63］。真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）編碼一個與甲基化的鳥嘌呤結合的帽子結合蛋白，能夠觸發蛋白質翻譯起始復合物的組裝，是雙子葉植物應對馬鈴薯Y病毒屬（potato virus Y，PVY）的一個S基因。因此，eIF4E已成為CRISPR/Cas9基因組編輯技術設計植物抗病毒的主要靶標位點。例如，在番茄中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對eIF4E1進行敲除編輯，顯著增強了番茄植株對辣椒斑駁病毒（pepper mottle virus，簡稱PepMoV）的抗性［64］。在小麥中，為增加對小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）的抗性，同樣利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術對eIF4E進行編輯，獲得了抗性株系［65］。煙草不僅是重要的非糧食經濟作物，而且還是一種模式植物，感染馬鈴薯Y病毒后，可造成煙草大量減產，嚴重影響煙草產業的發展。通過雙sgRNA表達CRISPR/Cas9系統來敲除煙草中eIF4E基因家族的多個拷貝，同時缺失eIF4E1-S、eIF4E1-T、eIF4E2-S和eIF4E2-T能夠增加煙草對PVY的持久抗性［66］。AGO蛋白是重要的抗病毒蛋白之一，其中AGO2的抗病毒機制尚未明確，因此，Ludman等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了AGO2缺失的本氏煙株系，證明AGO2是植物應對PVX、TuMV和TCV免疫反應的重要組成部分［67］。2014年，中東地區出現了一種危害番茄的病毒，番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV），并開始在世界范圍內迅速傳播，嚴重威脅了番茄產業的發展。煙草病毒增殖蛋白1（TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION1，TOM1）基因對煙草花葉病毒的高效復制起著至關重要的作用，并且在許多植物中發現TOM1的同源基因。因此，Ishikawa等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對TOM1同源基因進行敲除，獲得了抗ToBRFV的突變株系［68］。植物bZIP類轉錄因子參與植物的生長發育、激素信號、抗病性及抗逆性等多種生物脅迫過程，為進一步明確bZIP類轉錄因子抗病毒機制，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了NbbZIP28基因突變株系，突變株系與野生型植株相比，農藝性狀未發生顯著變化，但NbbZIP28敲除后導致植株對病毒的敏感性上升［69］。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）病是番茄的主要病害之一，一些番茄品種攜帶了TYLCV的易感基因SlPelo，因此，Pramanik等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在優質番茄品種BN-86中，獲得了SlPelo基因的敲除株系，以提高番茄的抗病性［70］。CRISPR/Cas9直接編輯寄主基因提高對病毒性病害的抗性詳見表3。

4.2 編輯病毒基因產生抗病性

CRISPR/Cas9不僅能夠編輯寄主基因來提高抗病毒能力，而且可以直接編輯病毒基因來增強植物對病毒的抗性。例如，CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯衣殼蛋白（CP）、復制蛋白（Rep）、基因間隔區域（IR）和一些開放閱讀框（ORF）等病毒相關結構來增強植物病毒抗性［71］。木爾坦棉花曲葉病毒（cotton leaf curl multan virus，CLCuMuV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus） 能夠引起棉花曲葉病的發生。通過

構建IR和轉錄激活蛋白（TrAP）雙sgRNA的CRISPR/Cas9系統，突變株系對CLCuMuV的抗性顯著增強，表明該系統可應用于抗DNA病毒植物株系的選育，為抗植物雙生病毒科病毒提供新策略［72］。為增加CRISPR/Cas9系統的穩定性，Ghorbani等構建了由rgsCaM啟動子驅動Cas9的CRISPR/Cas9系統，以番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的CP和IR為靶點設計sgRNA，與野生型相比，對TYLCV的抗性顯著增強，并且以rgsCaM啟動子驅動的Cas9效率顯著高于傳統的35S啟動子［73］。Ali等則基于TYLCV的CP、Rep和IR設計了3種sgRNA，結果顯示這3種sgRNA均減少了煙草中病毒的積累，但基于IR設計的sgRNA效果更加明顯［74］。屬于雙生病毒科（Geminiviridae）曲頂病毒屬（Curtovirus）的甜菜曲頂病毒 （beet severe curly top virus，簡稱BSCTV）也危害多種作物。Ji等以CP和Rep為靶標設計sgRNA，在擬南芥和本氏煙中進行瞬時表達，BSCTV侵染后，過表達植株表現出強烈的抗病毒能力［75］。有研究報道，長基因間隔區（long intergenic region，LIR）也被當作提高植物抗雙生病毒設計sgRNA的靶標位點，在煙草中瞬時表達后，接種菜豆黃矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV），病毒的拷貝數和癥狀明顯減弱［76］。為提高植物抗小麥矮縮病毒（wheat dwarf virus，WDV）的能力，研究人員針對WDV基因組的不同片段，設計了4個sgRNA，分別是MP 3′端和CP 5′端（重疊ORF）、Rep/RepA 5′端、LIR和Rep 3′端，突變株系的農藝性狀未發生變化，但抗WDV的能力顯著增強［77］。Malik等基于CRISPR/Cas9基因編輯技術，將靶向保守基因組區域的各種gRNA構建體單獨或串聯（3個構建體一起）用于觸發對鷹嘴豆褪綠矮縮病毒（chickpea chlorotic dwarf virus，CpCDV）的抗性，結果顯示，基于CpCDV基因組的LIR、Rep和RepA設計的sgRNA串聯構成的CRISPR/Cas9系統對CpCDV的抗性最強［78］。

相對于DNA病毒，RNA病毒在農業生產造成的危害更大。例如，煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡稱TMV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，簡稱CMV），可對多種作物產生危害。然而利用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯RNA病毒的報道較少。Zhang等以CMV基因組的開放閱讀框1a（open reading frames 1a，ORF 1a）、ORF CP和3′端非編碼區 （3′ untranslated regions，3′ UTRs）為靶標設計sgRNA，在本氏煙和擬南芥中轉化后，表現出抗TMV和CMV的能力，并且后代植物同樣表現出抗性，表明這種抗性是可遺傳的［79］。葡萄卷葉相關病毒（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）是葡萄卷葉病的致病因子之一，由于缺乏天然抗性資源，因此，關于葡萄抗GLRaV-3的研究相對有限。Jiao等則利用FnCas9以GLRaV-3的5 ku 蛋白（5 ku protein，p5）、熱休克蛋白70同系物（Heat shock protein 70 homolog，Hsp70h）、熱休克蛋白90同系物（Hsp90h）、CP以及次外殼蛋白（CPm）為靶標設計sgRNA，結果表明，Hsp70h和CP表現出最強抗性，能夠有效賦予葡萄抗GLRaV-3特性［80］。CRISPR/Cas9編輯病毒基因使植物產生抗病性詳見表4。

5 討論與展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術自問世以來，就備受關注。CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅可以針對植物自身進行定向編輯，而且能夠直接編輯真菌、細菌和病毒等病原物來提高植物抗病性。CRISPR/Cas9系統在啟動子的選擇上，Cas9通常以35S作為啟動子，但部分研究為提高啟動效率以及特異性也選擇CmYLCV/CsUbi、Ubi4-2、rgsCaM以及2×35S為啟動子，sgRNA通常為U6啟動子，僅有少部分為U3啟動子。CRISPR/Cas9基因編輯技術由于可以實現多個sgRNA的同時編輯，因此，較其他基因編輯技術編輯效率高，利用此特點，可以對某些家族基因的多個基因位點或含有多個等位基因進行編輯，更有利于基因功能研究［66］。CRISPR/Cas9基因編輯技術還存在一個明顯的優勢，就是可以針對基因的某段序列進行突變，所以針對某些多功能基因，則可以避免干擾植物正常的發育。例如，Xa13為多功能性基因，不僅具有隱性抗細菌性枯萎病的功能，而且還參與花藥的發育［59］。當然，CRISPR/Cas9基因編輯技術也存在一些不足。例如，對靶標基因位點和PAM序列有一定的要求。只有靶標位點緊鄰PAM序列（通常是PAM序列上游3 bp處），PAM序列為NGG（N為任意堿基）序列時切割效率最高，對于一些特殊靶標基因位點，則會出現編輯效率不高的現象［16］。無論是對植物本身，還是針對病原物的基因編輯，主要是通過NHEJ途徑敲除靶標基因，而通過HDR途徑進行基因編輯的則較少，這主要是源于NHEJ在除有絲分裂外的整個細胞周期中均比較活躍，HDR僅在S期和G2晚期活躍［21］，因此，在HDR途徑仍要加大研究力度，充分發揮CRISPR/Cas9基因編輯技術的潛力。

在植物抗真菌方面，主要以編輯寄主基因產生抗病性為主，包括一些易感基因、轉錄因子以及一些植物激素調節因子，而且以基因敲除為主［81］。多數研究顯示，轉基因植物農藝性狀未發生變化，但并未經過多代驗證，仍存在一些風險，部分研究表明，對某些基因編輯后，造成農藝性狀發生變化。例如，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將StSR4基因敲除后，突變株系盡管對晚疫病的抗性有所提高，但同時也導致馬鈴薯出現矮化的現象［35］。在植物抗細菌方面，針對植物基因的編輯主要是以假單胞桿菌屬、歐文氏桿菌屬和黃單胞桿菌屬為主，對于細菌基因組的編輯主要以假單胞桿菌屬和黃單胞桿菌屬為主，目前，尚未見利用CRISPR-Cas9基因編輯技術對植物病原細菌歐氏桿菌屬、土壤桿菌屬和棒桿菌屬進行相關研究的報道。與植物真菌和細菌不同的是，關于植物抗病毒的研究，對于病毒本身的編輯要多于寄主植物。在編輯寄主植物時，圍繞eIF4E進行的相關研究較多。例如，關于PepMoV、WYMV以及PVY等多個病毒的研究中均以eIF4E為靶標設計sgRNA［64-66］。雖然相對于DNA病毒，RNA病毒在農業生產中造成的危害更大，但是利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對于病毒的研究則是以DNA病毒為主，針對RNA病毒基因組的研究較少。

作為一種強大而通用的基因編輯和調控工具，CRISPR/Cas9基因編輯技術已經在加速各個科學領域的發展，并成為農業可持續發展的源泉［82］。目前，基于CRISPR/Cas9基因編輯技術的植物抗病性研究取得了一定的成果，但多數研究以室內研究為主，在田間條件下的抗病性并未經過驗證，在未來應該要加強田間試驗，選育穩定遺傳抗病性，且不影響農藝性狀的優良品系。許多科學家認為，CRISPR/Cas9基因編輯技術只涉及到植物本身DNA的變化，而不設計外源基因的插入，應該是屬于誘變，但歐盟法院作出判決，認為使用基因組編輯技術創造的生物將被監管為轉基因生物，而此決定勢必會影響相關研究的積極性［83］。雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術存在一些不足和挑戰，但在未來仍然是作物抗病育種研究的優勢技術，特別是在野生抗性資源稀缺時，CRISPR/Cas9基因編輯技術誘導的突變將為植物抗病育種提供多種選擇，促進農業可持續發展。

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