虎杖苷對AML細胞增殖、遷移、侵襲及腫瘤生長的影響 Δ

華 敏，張偉麗 （滕州市中心人民醫院輸血科，山東 滕州 277599）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種異質性血液系統惡性腫瘤，以骨髓、血液和其他組織中髓系原始細胞克隆性擴增為主要特征[1―2]。盡管化療手段有所進展，但AML 患者預后仍然較差[3]。因此，有必要進一步了解AML 的相關機制并尋找新型治療藥物。

虎杖苷（polydatin，PD）是一種從虎杖根中分離出來的活性成分，具有抑制血小板聚集、降低血脂水平、減少脂質過氧化等多種活性。研究發現，PD 可以通過誘導細胞凋亡來抑制AML 的發展，但具體機制尚未明確[4]。上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型特征細胞的生物學過程，是腫瘤得以進展的重要分子機制之一[5]。EMT過程涉及多種標志蛋白，包括鋅指轉錄因子Snail、上皮鈣黏素（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）等[6]。環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是AML研究領域的常見通路，激活該信號通路可抑制AML 細胞的增殖，對AML 的治療具有積極效果[7―8]；此外，cAMP/PKA 信號通路還可參與調控EMT 進程[9]。結合現有文獻，本研究擬基于EMT和cAMP/PKA信號通路，初步探討PD對AML細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并通過構建裸鼠移植瘤模型，從體內水平初步驗證PD的抗AML活性，以期為AML的治療藥物開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括iMark680 型多功能酶標儀、Gel Doc EZ 型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司），Eclipse Ti-S型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

PD 對照品（批號20210407，純度≥98%）購自滁州仕諾達生物科技有限公司；cAMP 抑制劑SQ22536 對照品（批號HY-100396，純度98.41%）購自美國MedChem-Express 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；MTT細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自江西艾博因生物科技有限公司；兔源vimentin、Snail、E-cadherin、PKA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（貨號分別為ab92547、ab229701、ab40772、ab75991、ab9485、ab6721）均購自英國Abcam 公司；cAMP 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；RPMI 1640 培養基、ECL顯色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細胞與實驗動物

人AML細胞KG-1（批號CL-0132）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人原代正常骨髓單核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMC；批號905810）購自北京諾為生物技術有限公司。

SPF 級雄性BALB/c 裸鼠（4～6 周齡，體重18～20 g）24 只，購自山東博安生物技術股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）2020 0006。所有動物均飼養于每12 h 光照/黑暗交替、溫度18～23 ℃、相對濕度55%～65%的環境中，自由攝食、飲水。本研究方案經滕州市中心人民醫院動物倫理委員會審核批準（編號2020-10-171）。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 細胞培養

將BMMC 和KG-1 細胞分別接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養。

2.1.2 PD干預濃度篩選

采用MTT 法檢測。收集BMMC 和KG-1 細胞，按1×104個/mL、每孔100 μL 接種在96 孔板上，培養24 h待細胞進入對數生長期時，以不同濃度[0（對照）、10、30、60、90、120 μmol/L]的PD[4]繼續培養24 h，每濃度設置6個復孔，并設置只含培養基的空白孔。隨后，在每孔中加入5 mg/mL的MTT試劑25 μL，室溫孵育4 h后，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，充分振蕩后，使用酶標儀于570 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，計算細胞活力[細胞活力（%）＝（OD實驗組－OD空白孔）/（OD對照組－OD空白孔）×100%]，并根據檢測結果篩選后續實驗的PD干預濃度。

2.1.3 細胞分組與處理

取對數生長期的KG-1細胞，分為正常組，低、中、高濃度PD組（L-PD、M-PD、H-PD組），SQ22536組，高濃度PD 和SQ22536 聯用組（H-PD+SQ22536 組），每組設置6個復孔。正常組細胞正常培養24 h，L-PD、M-PD、H-PD組細胞分別以10、30、60 μmol/L的PD（濃度參考相關文獻[4]和“2.1.2”項下結果設置）培養24 h，SQ22536 組細胞以100 μmol/L 的cAMP 抑制劑SQ22536（濃度參考相關文獻[10]設置）培養24 h，H-PD+SQ22536 組細胞同時以60 μmol/L的PD和100 μmol/L的SQ22536培養24 h。

2.1.4 PD對KG-1細胞活力的影響考察

采用MTT法檢測。取對數生長期的KG-1細胞，按“2.1.3”項下方法分組、處理，隨后按“2.1.2”項下方法檢測各組細胞的OD值，用以表示其活力。

2.1.5 PD對KG-1細胞凋亡的影響考察

采用流式細胞術檢測。取對數生長期的KG-1 細胞，按“2.1.3”項下方法分組、處理。收集各組細胞，于室溫下以1 000×g離心5 min，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再用Annexin Ⅴ結合緩沖液500 μL 重懸；于避光環境下，加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 試劑各5 μL，染色15 min，使用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

2.1.6 PD對KG-1細胞侵襲、遷移能力的影響考察

采用Transwell 實驗檢測。用上室涂有基質膠的Transwell 小室評估KG-1 細胞的侵襲能力，用上室未涂基質膠的Transwell 小室評估KG-1 細胞的遷移能力，具體操作如下：取對數生長期的KG-1細胞，用不含血清的RPMI 1640 培養基重懸至4×105個/mL；取上述細胞懸液100 μL 置于Transwell 上室，同時將含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基600 μL 置于Transwell 下室，于37 ℃下孵育24 h。將上層細胞按“2.1.3”項下方法分組、處理后，收集穿膜細胞，以4%多聚甲醛固定后，再用0.05%結晶紫染液染色2 h。使用顯微鏡觀察各組細胞的侵襲、遷移情況并記錄侵襲、遷移細胞數。

2.1.7 PD對KG-1細胞上清液中cAMP水平的影響考察

采用ELISA 法檢測。取對數生長期的KG-1 細胞，按“2.1.3”項下方法分組、處理。收集各組細胞，用PBS洗滌3 次，以1 500×g離心10 min，取上清液，使用酶標儀于450 nm 波長處檢測cAMP 水平。具體操作嚴格參照相應試劑盒說明書執行。

2.1.8 PD對KG-1細胞EMT相關蛋白和PKA蛋白表達的影響考察

采用Western blot 法檢測。取對數生長期的KG-1細胞，按“2.1.3”項下方法分組、處理。收集各組細胞，用PBS 洗滌2 次，以裂解液裂解，再于4 ℃下以12 000×g離心10 min，收集上清液，測定蛋白含量后作加熱變性處理。取變性蛋白，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，于室溫下以5%脫脂奶粉封閉1 h；洗膜后，加入E-cadherin、vimentin、Snail、PKA、GAPDH 一抗（稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶4 000），于室溫下孵育2 h，使用ECL顯色試劑盒顯影，于凝膠成像儀下成像。使用Image J 1.8.0軟件分析各蛋白的灰度值，并計算目的蛋白的相對表達量[目的蛋白的相對表達量＝目的蛋白的條帶灰度值/內參蛋白（GAPDH）的條帶灰度值]。

2.2 動物實驗

取對數生長期的KG-1細胞，以PBS配制細胞懸液。取上述懸液，按1×107個/只接種于裸鼠右側腋窩皮下。接種后15 d，將24 只裸鼠分為對照組、PD 組、SQ22536組、PD+SQ22536 組，每組6 只。PD 組裸鼠腹腔注射5 mg/kg 的PD（以0.1%DMSO 為溶劑，劑量參考相關文獻[11]設置），SQ22536 組裸鼠腹腔注射3.2 mg/kg 的SQ22536（以0.1%DMSO 為溶劑，劑量參考相關文獻[12]設置），PD+SQ22536 組裸鼠腹腔注射5 mg/kg 的PD 和3.2 mg/kg 的SQ22536，對照組裸鼠腹腔注射0.1%DMSO，每天1 次，連續4 周。末次給藥次日，所有裸鼠經麻醉后處死，取出其瘤體并稱重，同時計算瘤體體積（瘤體體積＝腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2）。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 細胞實驗結果

3.1.1 PD干預濃度篩選結果

10、30、60、90、120 μmol/L 的PD 對BMMC 活力均無顯著影響（P＞0.05），表明其對該細胞無明顯毒性。與對照組比較，10、30、60、90、120 μmol/L 的PD 均可顯著降低KG-1 細胞活力（P＜0.05），且其對KG-1 細胞的半數抑制濃度（IC50）接近60 μmol/L，因此選擇10、30、60 μmol/L 作為后續實驗PD 的干預濃度。結果見圖1。

a：與對照組比較，P＜0.05。圖1 PD干預濃度篩選的折線圖（±s，n＝6）

3.1.2 PD對KG-1細胞活力和凋亡的影響

與正常組比較，PD各濃度組細胞的OD值均顯著降低，凋亡率均顯著升高，均呈濃度依賴性（P＜0.05）；而SQ22536 組細胞的OD 值顯著升高，凋亡率顯著降低（P＜0.05）。與H-PD 組比較，H-PD+SQ22536 組細胞的OD值顯著升高，凋亡率顯著降低（P＜0.05）。結果見表1、圖2。

表1 各組KG-1細胞OD值和凋亡率比較（±s，n＝6）

表1 各組KG-1細胞OD值和凋亡率比較（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與L-PD組比較，P＜0.05；c：與M-PD組比較，P＜0.05；d：與H-PD組比較，P＜0.05。

組別正常組L-PD組M-PD組OD值0.88±0.09 0.72±0.08a 0.51±0.06ab凋亡率/%14.76±1.62 18.51±1.91a 23.95±2.52ab組別H-PD組SQ22536組H-PD+SQ22536組OD值0.34±0.03abc 0.99±0.15a 0.83±0.07d凋亡率/%29.48±3.16abc 10.04±1.27a 17.68±1.79d

圖2 各組KG-1細胞凋亡情況的流式圖

3.1.3 PD對KG-1細胞遷移、侵襲的影響

與正常組比較，PD各濃度組的遷移、侵襲細胞數均顯著降低，均呈濃度依賴性（P＜0.05）；而SQ22536 組的遷移、侵襲細胞數均顯著升高（P＜0.05）。與H-PD組比較，H-PD+SQ22536 組的遷移、侵襲細胞數均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3、表2。

表2 各組KG-1細胞遷移和侵襲情況比較（±s，n＝6）

表2 各組KG-1細胞遷移和侵襲情況比較（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與L-PD組比較，P＜0.05；c：與M-PD組比較，P＜0.05；d：與H-PD組比較，P＜0.05。

組別正常組L-PD組M-PD組遷移細胞/個280±30 142±16a 113±12ab侵襲細胞/個154±28 117±14a 71±8ab組別H-PD組SQ22536組H-PD+SQ22536組遷移細胞/個71±7abc 337±37a 161±18d侵襲細胞/個37±4abc 205±28a 109±15d

圖3 各組KG-1 細胞遷移、侵襲情況的顯微圖（結晶紫染色）

3.1.4 PD 對KG-1 細胞上清液中cAMP 水平和細胞中PKA蛋白表達的影響

與正常組比較，PD各濃度組細胞上清液中cAMP水平和細胞中PKA蛋白相對表達量均顯著升高，均呈濃度依賴性（P＜0.05）；而SQ22536 組cAMP 水平和PKA 蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。與H-PD組比較，H-PD+SQ22536 組上述指標均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3、圖4。

表3 各組KG-1 細胞上清液中cAMP 水平和細胞中PKA蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

表3 各組KG-1 細胞上清液中cAMP 水平和細胞中PKA蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與L-PD組比較，P＜0.05；c：與M-PD組比較，P＜0.05；d：與H-PD組比較，P＜0.05。

組別正常組L-PD組M-PD組cAMP/（pmol/mL）0.70±0.06 0.93±0.09a 1.22±0.13ab PKA/GAPDH 0.43±0.05 0.64±0.07a 0.85±0.07ab組別H-PD組SQ22536組H-PD+SQ22536組cAMP/（pmol/mL）1.51±0.17abc 0.37±0.02a 0.85±0.09d PKA/GAPDH 1.23±0.15abc 0.21±0.02a 0.52±0.06d

圖4 各組KG-1細胞中PKA蛋白表達的電泳圖

3.1.5 PD對KG-1細胞中EMT相關蛋白表達的影響

與正常組比較，PD各濃度組細胞中E-cadherin蛋白的相對表達量均顯著升高，vimentin、Snail蛋白的相對表達量均顯著降低，均呈濃度依賴性（P＜0.05）；而SQ22536組細胞中E-cadherin蛋白的相對表達量顯著降低，vimentin、Snail 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。與H-PD 組比較，H-PD+SQ22536 組細胞中Ecadherin 蛋白的相對表達量顯著降低，vimentin、Snail 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。結果見表4、圖5。

表4 各組KG-1細胞中EMT相關蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

表4 各組KG-1細胞中EMT相關蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與L-PD組比較，P＜0.05；c：與M-PD組比較，P＜0.05；d：與H-PD組比較，P＜0.05。

組別正常組L-PD組M-PD組H-PD組SQ22536組H-PD+SQ22536組E-cadherin/GAPDH 0.34±0.04 0.63±0.07a 0.91±0.11ab 1.25±0.14abc 0.13±0.02a 0.48±0.05d vimentin/GAPDH 0.95±0.15 0.73±0.09a 0.54±0.06ab 0.25±0.03abc 1.27±0.13a 0.88±0.09d Snail/GAPDH 0.95±0.13 0.76±0.09a 0.53±0.07ab 0.32±0.02abc 1.32±0.15a 0.87±0.09d

圖5 各組KG-1中細胞EMT相關蛋白表達的電泳圖

3.2 動物實驗結果

與對照組比較，PD 組裸鼠的瘤體體積及質量均顯著降低（P＜0.05），而SQ22536 組裸鼠的瘤體體積及質量均顯著升高（P＜0.05）；與PD組比較，PD+SQ22536組裸鼠的瘤體體積及質量均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖6、表5。

表5 各組裸鼠瘤體體積及質量比較（±s，n＝6）

表5 各組裸鼠瘤體體積及質量比較（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與PD組比較，P＜0.05。

組別對照組PD組瘤體體積/mm3 333.35±36.57 130.69±15.27a瘤體質量/g 0.54±0.07 0.26±0.03a組別SQ22536組PD+SQ22536組瘤體體積/mm3 426.80±45.35a 306.59±25.57b瘤體質量/g 0.82±0.09a 0.45±0.04b

圖6 各組裸鼠瘤體圖示

4 討論

PD 為白藜蘆醇衍生物，是一種天然的二苯乙烯類多酚化合物，具有抗癌、保護心臟、抗糖尿病、保胃、保肝、保護神經、抗微生物等作用[13]。Wang等[4]發現，PD可通過將細胞阻滯于S期來誘導其凋亡，進而發揮對AML的治療作用；王春美等[14]也發現，PD 可有效抑制人單核細胞白血病細胞THP-1的增殖，并可通過阻滯細胞周期來誘導細胞凋亡，從而對AML 起到改善作用。本研究用PD處理BMMC，結果顯示，10、30、60、90、120 μmol/L的PD 對BMMC 活力無明顯影響，表明PD 對正常細胞無明顯毒性；而上述濃度的PD可使KG-1細胞活力顯著下降，凋亡率顯著升高，與既往研究結果[4，14]基本一致。此外，體內實驗結果顯示，PD可顯著降低裸鼠瘤體體積及質量，以上結果提示PD 可能成為AML 的潛在治療藥物。

惡性腫瘤細胞具有高度遷移性和侵襲性，抑制腫瘤細胞遷移和侵襲可抑制腫瘤進展[15]。Zhang 等[16]發現，抑制AML 細胞遷移和侵襲，可以阻止AML 的惡化。EMT 是上皮細胞轉換為間質細胞并獲得遷移和侵襲能力的過程，涉及E-cadherin、vimentin、Snail 等標志蛋白。其中，E-cadherin 是上皮細胞黏附分子，在EMT 過程中表達明顯下調；vimentin 是一種中間絲蛋白，在EMT 過程中表達明顯上調；Snail 可與Smad 相關蛋白1 競爭性結合E-cadherin 編碼基因啟動子近端的E-box 序列，從而抑制E-cadherin表達、上調vimentin表達，可誘導EMT的發生；E-cadherin 表達的下調和vimentin、Snail 表達的上調均與細胞遷移、侵襲能力的增強有關[5―6]。本研究發現，經PD 處理后，遷移、侵襲細胞數均顯著減少，vimentin、Snail蛋白的表達均顯著下調，E-cadherin蛋白的表達顯著上調，表明PD 可能通過升高KG-1 細胞Ecadherin 蛋白的表達來阻止其獲得間質表型，使細胞維持上皮表型特征，進而抑制KG-1細胞的遷移和侵襲。

cAMP/PKA 信號通路是細胞內經典途徑之一，cAMP 是首個被發現的第二信使，在細胞信號轉導中具有關鍵作用，并可通過下游PKA來調節各種靶基因的轉錄，參與腫瘤細胞生長、遷移、侵襲等多種生理病理過程[17]。研究指出，激活cAMP/PKA 信號通路可抑制AML細胞的增殖，并誘導其凋亡[8，18]。本研究結果顯示，經PD 處理后，KG-1 細胞上清液中cAMP 水平和細胞中PKA 蛋白的表達均顯著升高，推測PD 可能通過激活cAMP/PKA信號通路來發揮抑制AML發展的作用。為了進一步證實此推測，本研究分別以cAMP 抑制劑SQ22536 和PD+SQ22536 處理KG-1 細胞，結果發現，SQ22536 的作用效果與PD 相反，并可逆轉PD 對KG-1細胞的抑制活性。這提示PD 對KG-1 細胞惡性生物學行為的抑制作用可能是通過激活cAMP/PKA 信號通路實現的。

綜上所述，PD 可能通過激活cAMP/PKA 信號通路來抑制KG-1細胞的增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡，抑制EMT進程及腫瘤生長，從而發揮抗AML作用。