基于“初生-次生代謝產物”互作途徑的大果沙棘和中華沙棘差異性研究

楊興晶，劉妍如*，唐志書, ，宋忠興，周 篷，常百金，趙艷婷，劉長樂

1.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心，陜西 咸陽 712083

2.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117

3.中國中醫科學院，北京 100700

沙棘HippophaeFructus為胡頹子科植物中華沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果實，本品系蒙古族、藏族習用藥材[1]，也是一種重要的藥食同源藥材[2]。其具有可健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功能[3]和調血脂、降血糖、抗癌等功效[4]。沙棘含有黃酮[5]、鞣質、萜類、多糖、維生素等多種活性成分，其中黃酮類成分是沙棘的主要功效物質[3]。

大果沙棘Hippophaerhamnoidesvat.sp L.原產自俄羅斯，是近年來中國從俄羅斯引進的新品種和雜交選育的品種，表現出枝條無刺或少刺、果實大、果柄長、單株產量高等特性。其果實中含有黃酮、氨基酸、維生素等多種生物活性物質[6]，具有廣泛的食用、美容和藥用開發價值[7]。

沙棘許多藥用功效都是通過黃酮類化合物發揮作用才實現的，其含有的黃酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比較豐富，在將沙棘果實作為保健和藥用方面有著十分廣闊的前景[8]。大果沙棘作為俄羅斯引進的選育良種的沙棘，其在國內的研究多以種植、栽培和雜交為主[9-11]，而中華沙棘在藥用上使用較多，且已有研究表明引進沙棘（大果沙棘）的黃酮類化合物含量較低[8,12]，安雄韜等[13]、付依依等[14]對不同品種大果沙棘果實與不同品種的沙棘總黃酮含量進行分析，結果表明總黃酮含量最高的均是中華沙棘，所以中華沙棘在藥用方面的使用頻率要大于大果沙棘。由于品種不同，藥用植物中化學成分含量不同，高韻等[15]用紅外光譜對不同種屬、不同產地的黃精進行鑒別研究，李國衛等[16]利用多元統計分析對不同柯子屬藥材進行多指標成分含量測定，得到不同種黃精屬、柯子屬藥材間所含化學成分及含量亦存在明顯差異，結果都可系統、全面地為藥材的質量評價提供科學依據。

植物代謝物組學研究不同物種、不同基因類型或不同生態類型的植物在不同生長時期或受某種刺激干擾前后的所有小分子代謝產物，對其進行定性、定量分析，并找出代謝變化的規律[17]。本研究采收了不同產地中華沙棘和大果沙棘，借鑒植物代謝組學的思路，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對中華沙棘、大果沙棘的差異性成分進行分析，通過多元統計分析與定量分析找出其中差異顯著的化學成分及其變化規律，最后通過化學成分的含量差異對生物合成途徑的進行分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290 型高效液相色譜串聯AB Sciex 4500 Qtrap 三重四級桿線性離子阱質譜儀（美國Agilent 公司，美國AB Sciex 公司）；Waters Acquity UPLC H-Class 型超高效液相色譜串聯 Triple TOFTM5600 三重四級桿飛行時間質譜儀（美國Waters 公司，美國AB Sciex 公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（Sartorius 科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；TQ-200 型高速多功能粉碎機（上海市天祺盛世科技有限公司），Milli-Q 型水純化系統（美國Millipore 公司）。

1.2 材料

對照品鼠李素（批號wkq21083007，質量分數98%）、二水槲皮素（批號wkq-21080908，質量分數97%）、木犀草苷（批號wkq18032905，質量分數98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品異鼠李素（批號MUST-21082713，質量分數99.27%）、木犀草素（批號MUST-21072311，質量分數98.52%）、水仙苷（批號MUST-20101407，質量分數99.99%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（批號HR2711W2，質量分數98%）、山柰酚（批號HR1832W2，質量分數98%）購自寶雞辰光生物科技有限公司；異槲皮苷（批號111809-201403，質量分數92.9%）、金絲桃苷（批號111521-201809，質量分數94.9%）、槲皮苷（批號111538-202007，質量分數93.5%）、槲皮素（批號100081-201610，質量分數99.1%）、蘆?。ㄅ?00080-201811，質量分數91.7%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號112007-202103）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品L-酪氨酸（批號0609-0109）、L-苯丙氨酸（批號624-200104）購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮素（批號200824，質量分數98%）購自成都植標化純生物技術有限公司。甲醇（分析級，成都市科隆化學品有限公司），乙腈（質譜級，批號205179，賽默飛世爾科技有限公司公司），甲醇（色譜級，德國默克公司），甲酸（批號205775，賽默飛世爾科技有限公司公司），水為超純水（密理博Milli-Q Integral 5 超純水機制備）。

樣品為不同產地沙棘（表1），經陜西中醫藥大學藥學院白吉慶副教授鑒定為胡頹子科植物中華沙棘H.rhamnoidesL.和大果沙棘H.rhamnoidesvat.sp L.的干燥成熟果實。

表1 各批次沙棘信息Table 1 Hippophae Fructus information for each batch

2 方法

2.1 樣品的干燥

取各批次中華沙棘和大果沙棘果實進行清洗，分別取各批次2 種果實適量，進行標記，裝入不銹鋼托盤中均勻攤開，所有樣品在60 ℃烘箱中干燥12 h，干燥后粉碎，過三號篩，裝袋保存。

2.2 總黃酮含量測定[1]

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品20 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加60%乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL 蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉約2 g，精密稱定，加60%乙醇30 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘渣再分別加60%乙醇25 mL，加熱回流2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，置100 mL 量瓶中，殘渣用60%乙醇洗滌，洗液并入同一量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液l、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL 量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在500 nm 的波長處測定吸光度（A）值，以A值為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

2.2.4 總黃酮的測定 按“2.3.2”項下方法測定A值。根據標準曲線計算沙棘中總黃酮的含量。

2.4 成分表征測定

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁、槲皮苷、異鼠李素、鼠李素、水仙苷、槲皮素、木犀草素、金絲桃苷、柚皮素、木犀草苷、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、二水槲皮素、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸對照品適量，制成質量濃度分別為0.15、0.21、0.21、0.16、0.11、0.13、0.12、0.20、0.17、0.10、0.10、0.11、0.14、0.13、0.16、0.14 mg/mL 的對照品儲備液。儲備液于4 ℃條件下保存備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取“2.1”項下14批產地的沙棘藥材粉末各1.5 g 于錐形瓶中，分別加入60%甲醇30 mL，85 ℃水浴回流1 h，放冷，濾過，取續濾液，過膜，備用。

2.3.3 UPLC 色譜條件 采用5600 型質譜儀進行成分表征，色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，6% B；1～8 min，6%～20% B；8～30 min，20%～95% B；30～32 min，95% B；32～33 min，95%～5% B；33～35 min，5% B；柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

2.3.4 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），負離子模式下，采用信息依賴采集（IDA）、動態背景扣除（DBS）和高靈敏度模式采集數據。離子掃描范圍m/z100～2 000，負離子模式下源噴射電壓為?4 500 V，裂解電壓（declustering potential，DP）為80 V，碰撞能量（collision energy，CE）為35 eV，負離子模式下，霧化氣（ion source gas 1，GS1）和輔助氣（ion source gas 2，GS2）為氮氣，均為344.7 kPa，氣簾氣（curtain gas，CUR）為241.3 kPa，霧化溫度（temperature，TEM）550 ℃。

2.4 二水平析因（plackett burman，PB）-星點設計（central composite design，CCD）法（PB-CCD）實驗設計

2.4.1 影響因子設計 采用比例特定的乙腈-水混合洗脫系統，以不同比例甲酸調節流動相系統pH 值。選用不同色譜柱類型、檢測波長、柱溫、線性梯度時間、體積流量、乙腈初始比例和進樣體積作為考察變量，以2 峰分離度之和（∑Rs）、歸一化分離因子（r*）、色譜信息量（Ф）和色譜分層響應效能（HCRF）作為響應因子[18]，因素水平見表2。

表2 影響因子及響應因子設計Table 2 Impact factor and response factor design

2.4.2 數據分析 以各因素無相互作用且對設計結果干擾少作為設計前提，采用Design-Expert Version 8.0.7 統計軟件，首先對檢測波長、柱溫、梯度時間、進樣體積、體積流量、酸濃度、乙腈初始比例和色譜柱類型進行PB 因子篩選；然后以CCD 響應曲面法對重要因素進行尋優，以確定最優的參數設置，見表3。

表3 Plackett-Burman 設計實驗方案 (n = 3)Table 3 Placket-Burman design experimental scheme (n = 3)

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 UPLC 色譜條件 色譜柱為Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫程序：0～3 min，2%～9% B；3～20 min，9%～15% B；20～26 min，15%～16.5% B；26～30 min，16.5%～23% B；30～33 min，23%～24% B；33～42 min，24%～38% B；42～43 min，38%～95% B；43～45 min，95%～5% B。檢測波長370 nm，柱溫35 ℃，體積流量0.3 mL/min，進樣量5 μL。

2.5.2 指紋圖譜方法學驗證 按照《中國藥典》2020年版一部對中藥質量控制方法的規定，對優化結果進行精密度、重復性、穩定性等方法學驗證。以金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素為對照，鑒定指紋圖譜中共有成分。

2.6 沙棘差異性成分聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）及偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）

2.6.1 HCA 為了初步說明樣品與樣品間是否存在一定關系，本研究選用HCA 進行建模分析。首先對中華、大果沙棘樣品進行色譜分析，再將處理后的峰面積導入simca-p 14.1 版軟件，最后采用HCA方法對各批數據進行分析。

2.6.2 PLS-DA 為了更直觀地評價模型對樣品的分類能力，對各樣品數據進行降維處理，將數據導入simca-p 14.1 版軟件，采用PLS-DA 方法觀察樣品差異情況。本研究對中華、大果沙棘樣品進行成分鑒定與色譜分析，將測定后的中華沙棘、大果沙棘相同的成分的峰面積進行處理，將處理并分組后的數據采用PLS-DA 進行分析。

2.7 差異代謝物定量分析

2.7.1 定量UPLC 色譜條件 采用4500 型質譜儀進行成分定量，色譜條件同“2.6.1”項指紋圖譜色譜條件。

2.7.2 質譜條件 定量質譜分析采用ESI 負離子模式進行掃描，檢測模式為多反應檢測（MRM）。離子化參數為離子噴霧電壓，負離子模式?4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮氣；離子源溫度550 ℃，霧化氣和輔助為413.7 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，離子掃描范圍m/z100～1 000，掃描速率：200 Da/s，化合物離子對，優化后的采集參數：去簇電壓（declustering potential，DP）、碎裂能量（collision energy，CE）和碰撞池出口電壓（cell exit potential，CXP）等信息見表4。

表4 沙棘中11 種黃酮類、氨基酸化合物多反應檢測參數Table 4 Multiple reaction parameters of 11 kinds of flavonoids and amino acids in Hippophae Fructu

2.8 統計分析

3 結果與分析

3.1 總黃酮含量測定結果

按“2.3.3”項下方法繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y＝12.491X＋0.003 8（r2＝0.999 3），線性范圍為0.008 0～0.048 0 mg/mL。按“2.3.3”項下方法對14 批沙棘樣品進行總黃酮含量的測定，結果見表5。

表5 不同產地中華沙棘、大果沙棘總黃酮含量測定結果 (n = 6)Table 5 Determination results of total flavonoids of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp from different producing areas (n = 6)

3.2 成分表征測定結果

通過Peakview 2.2 查看采集數據，以AB Sciexmaster view 1.1.0.0 中藥成分數據庫（TCM library 1.0）作為中華沙棘和大果沙棘的成分匹配庫。通過比對精確質量數、同位素峰度比以及碎片離子裂解規律等信息，初步鑒定出中華沙棘和大果沙棘中含量差異較大的有9 個黃酮類成分和2 個氨基酸成分并對其進行分析，見表6，總離子流圖見圖1。

圖1 中華沙棘 (A) 和大果沙棘 (B) 化學成分表征的UPLC-MS/MS 總離子流圖Fig.1 UPLC-MS/MS total ion flow maps of characterization of chemical constituents of H.rhamnoides (A) and H.rhamnoides vat.sp (B)

表6 中華沙棘、大果沙棘中11 個重要共有成分Table 6 A total of 11 important common components in H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.3 PB-CCD 實驗設計結果

3.3.1 液相色譜優化因子選擇 由于甲醇和分析物間氫鍵的相互作用，可能引入額外的共振結構并可能引起拖尾峰，因此，選擇乙腈作為有機相。另外，色譜柱溫度也是影響極性化合物保留時間的重要參數，一般溫度升高，擴散系數也升高，這樣會導致更窄的峰和更高的分離效率。為了增加色譜柱使用壽命，將柱溫優化范圍設置為25～35 ℃。

3.3.2 PB 試驗設計 為了在最少的試驗次數下獲得最佳的參數設置，選擇因子設計中的PB 法作為篩選設計方法，以CCD 響應曲面法對優化后的因素進行進一步優化，以∑Rs、r*、Ф、HCRF評價樣品的分離效能，見公式（1）～（3）。結果見表7。

表7 PB 響應因子結果Table 7 PB response factor results

R表示2 峰間分離度；n為理論塔板數；Rmin為最小分離度；tm?t1為最大與最小保留時間差；A為色譜峰面積?！芌s、r*是用于評價色譜分離質量的參數；Ф值指色譜信息量值，是用于評價色譜交互信息的參數；HCRF為分層色譜響應值，用于評價方法中分離峰個數、分離度和分析時間性能

PB 試驗的ANOVA 結果顯示，Ф和HCRF項的P值分別為0.030 9 和0.039 2，均小于0.05，說明各變量與HCRF回歸方程的關系顯著。擬合系數（R-Squared）分別為0.970 9 和0.965 7，說明模型擬合度好。

根據各影響因子對各響應因子的最大值運算結果，將影響不顯著的影響因子進行最大值預測并作為固定條件：檢測波長為370 nm，柱溫為35 ℃，體積流量為0.3 mL/min；甲酸濃度為0.1%進樣量為5 μL，色譜柱類型為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

3.3.3 CCD 試驗設計 在PB 設計結果的基礎上，通過對Ф和HCRF影響顯著的因子檢測波長、進樣體積和流速進行尋優。試驗采用通用旋轉組合設計（Rotatable＝6），以Ф和HCRF作為響應因子進行3 水平CCD 試驗（表8）。根據試驗結果，找到Ф和HCRF最大值。

表8 CCD 響應因子結果Table 8 CCD response factor results

從Ф和HCRF項的ANOVA 表中變量顯著性P值的大小可以確定對Ф和HCRF的影響大小，對Ф影響顯著的因素為進樣體積（P＝0.004 8）、體積流量（P＝0.042 3）和色譜柱類型（P＝0.030 5）；對HCRF影響顯著的因素為進樣體積（P＝0.007 6）、乙腈初始比例（P＝0.048 3）和色譜柱類型（P＝0.037 6）。從Ф和HCRF主效應圖（圖2-a、c）可以看出，3 因素交互作用顯著，進樣體積（因素A）越大，圖譜Ф和HCRF越高；體積流量（因素B）越大，圖譜Ф和HCRF越低。

圖2 分離效果影響因素主效應及響應曲面分析圖Fig.2 Main effect diagrams of influencing factors of separation effect and response surface analysis diagrams

根據該篩選的結果，在設計水平范圍內對響應因子做最大值計算。因此，根據評價結果，得到最后的優化參數，用3 次重復試驗來驗證因子分析結果，得到初步的色譜分析條件為：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），檢測波長370 nm，柱溫35 ℃，梯度時間45 min，進樣體積5 μL，體積流量0.3 mL/min，乙腈初始比例2%，甲酸濃度0.1%。

3.4 指紋圖譜結果

3.4.1 精密度試驗 取同一產地沙棘供試品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄370 nm 波長下色譜圖。對10 個共有峰以均值法進行差異性評價，結果表明10 個共有峰相對保留時間RSD為0.006%～0.061%，皆小于1.5%。共有峰相對峰面積RSD 為0.232%～2.701%，皆小于3%。精密度考察結果符合指紋圖譜的要求。

3.4.2 穩定性試驗 取同一產地沙棘供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、24 h 按“2.6.1”項下色譜條件進樣，記錄370 nm 色譜圖。共有峰以均值法進行評價，結果表明各共有峰相對保留時間RSD 為0.015%～0.134%，皆小于1.5%。各共有峰相對峰面積RSD 為0.325%～2.789%，皆小于3%，證明供試品溶液在24 h 內穩定。

3.4.3 重復性試驗 取同一產地沙棘供試品6 份，分別制備供試品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件進樣，記錄370 nm 下色譜圖。對其共有峰分別進行差異性評價，結果表明，各主要成分共有峰相對保留時間RSD 為0.007%～0.103%，皆小于1.5%。共有峰相對峰面積RSD為0.104%～2.877%，皆小于3%，重復性考察結果符合指紋圖譜的要求。

3.4.4 沙棘共有峰鑒定 取14 批沙棘及對照混標，按“2.1”項下方法分別制備供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。通過與混合對照品圖譜比較，確定10 個共有峰，分別為金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素，各批次樣品疊加圖與對照圖譜見圖3。

圖3 各批次沙棘和混合對照品溶液指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of each batch of Hippophae Fructus and mixed control solution

3.5 沙棘差異性成分HCA 及PLS-DA 結果

3.5.1 聚類分析 得到樹狀圖結果見圖4-A。結果表明，沙棘樣品主要分為2 類，中華沙棘樣品歸為一類，大果沙棘樣品聚為一類。說明中華沙棘和大果沙棘的樣品在成分上存在一定的差異。

圖4 中華沙棘、大果沙棘PLS-DA、聚類與KEGG 結果Fig.4 PLS-DA, cluster analysis and KEGG results of H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

3.5.2 PLS-DA 結果得到前2 個主成分的貢獻度為93.1%，包含差異信息最多，模型擬合度為90.0%，模型擬合度良好，故選取前2 個主成分進行模型預測，反映出不同種屬間樣品的基本特征。以2 個主成分建立投影，得到散點圖（圖4-B）。由圖可以看出所有中華沙棘樣品分為一類，所有大果沙棘樣品分為另一類，這一結果與聚類分析（圖4-A）結果一致。說明中華沙棘、大果沙棘在成分上有明顯的差異。利用VIP（variable importance in projection）值（VIP＞1）與MetaboAnalyst 分析平臺（https://www.metaboanalyst.ca/）將處理后的數據進行差異初生代謝物的篩選與KEGG 通路富集分析，通過VIP 值篩選到19 個差異代謝物，KEGG 通路富集分析得到14 條代謝途徑（圖4-D）。結果得到2 個重要的差異代謝物L-苯丙氨酸與L-酪氨酸與3 個重要代謝途徑：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝、苯丙氨酸代謝與酪氨酸代謝。

3.6 差異代謝物定量分析結果

根據PLS-DA 分析中得到的差異代謝物信息，對已鑒定得到的重要差異初生代謝物及其次生代謝物進行定量方法學考察。

3.6.1 標準曲線、定量限和檢測限試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液，配制為不同體積的對照品儲備液，按照優化的液質條件進行測定。將對照品儲備液按梯度體積稀釋，精密吸取11 個稀釋成不同質量濃度梯度的混合對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以標準溶液中化合物質量濃度橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算各成分的回歸方程和線性范圍。中華沙棘、大果沙棘中11 個不同化合物的線性范圍為0.003 6～30.00 μg/mL，且相關系數均大于0.999，表明各對照品線性關系良好。各種化合物的線性方程、相關系數、線性范圍及方法定量限、檢測限見表9。

3.6.2 精密度試驗 取同一產地中華沙棘的供試品溶液，按“2.8.1”項下色譜條件連續進樣6 次，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰的峰面積，計算中華沙棘中11 種化合物峰面積的RSD 在1.12%～3.99%，表明儀器精密度良好。

3.6.3 穩定性試驗 取同一產地中華沙棘的供試品溶液，按“2.8.1”項下色譜條件分別于制備后0、2、4、6、10、14、20、24 h 進樣，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰面積，計算中華沙棘中11 種化合物峰面積的RSD 在1.42%～4.87%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3.6.4 重復性試驗 取同一產地中華沙棘藥材粉末6 份，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.8.1”項下色譜條件，進樣，測得異鼠李素、山柰酚、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分各色譜峰面積，計算中華沙棘中11 種化合物質量分數的RSD 在2.27%～4.82%，表明此方法重復性良好。

3.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一產地中華沙棘的供試品各約1.5 g，共6 份，置于150 mL錐形瓶中，分別精密加入與中華沙棘樣品含量等同量的混合對照品溶液（異鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等11 個成分），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項色譜條件下進樣，計算加樣回收率。各成分含量、加入量以及最后得到的平均加樣回收率和RSD 的結果，異鼠李素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、柚皮素、水仙苷、鼠李素、二水槲皮素、木犀草素平均加樣回收率分別為95.32%、103.30%、95.46%、99.28%、95.26%、101.22%、104.61%、101.41%、98.86%、102.62%、96.48%；RSD 分別為3.42%、3.67%、1.37%、2.07%、0.87%、2.10%、0.72%、2.75%、1.31%、2.84%、3.12%。3.6.6 差異成分含量測定 為了更準確地應用定性數據，針對PLS-DA 中得到的差異代謝物信息，將已鑒定得到的差異初生代謝物及其次生代謝物進行定量分析，以精確研究中華沙棘與大果沙棘成分的差異性，按“2.8.1”項下的色譜條件和“2.8.2”項下的質譜條件，采用MRM 模式進行定量分析（表4），標準化合物、樣品、空白溶液MRM 提取離子流圖見圖5，結果見圖6。

圖5 空白 (A)、中華沙棘樣品 (B)、大果沙棘樣品 (C) 和11 種對照品 (D) 負離子模式MRM 提取離子圖Fig.5 Blank (A), H.rhamnoides (B), H.rhamnoides vat.sp (C), and 11 standards (D) MRM extracted ion chromatograms under negative ion mode

圖6 中華沙棘、大果沙棘中11 種黃酮類、氨基酸化合物含量測定結果Fig.6 Determination results of 11 flavonoids and amino acids in the H.rhamnoides and H.rhamnoides vat.sp

4 討論

4.1 沙棘中黃酮類成分的生物合成途徑分析及驗證

根據“3.2”項成分表征得到含量差異較大的9 個黃酮類成分和2 個氨基酸成分，分別為異鼠李素、山柰酚、槲皮素、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸等。黃酮類成分的合成主要以L-苯丙氨酸和L-酪氨酸為前體物質，通過不同的分支合成途徑合成黃酮類成分[25]，見圖7，通過對中華沙棘和大果沙棘的代謝產物分析，發現2 個沙棘中的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的含量有區別，大果沙棘中的2 種代謝物的含量大于中華沙棘，通過含量測定得到了大果沙棘中9 種黃酮類成分和2 種氨基酸的含量要大于中華沙棘，也進一步驗證了不同種屬的沙棘，其黃酮類成分的含量有明顯的不同。

圖7 黃酮類化合物合成途徑Fig.7 Synthetic pathway of flavonoids

4.2 中華沙棘、大果沙棘中總黃酮含量分析

總黃酮含量顯示，中華沙棘中總黃酮含量要大于大果沙棘中總黃酮含量。成分表征結果初步得到沙棘中26 個黃酮類成分，其中含量差異較大的黃酮類成分有9 個，其在大果沙棘中含量較高，其余已確定的黃酮類化合物含量均是中華沙棘大于大果沙棘。

分析原因一可能是總黃酮含量顯示在中華沙棘中較高，而實驗中所測得在大果沙棘中含量較高、差異較大的9 個黃酮類成分，是為研究不同種類沙棘差異顯著的化學成分及其變化規律，其并不能代表大果沙棘中總黃酮含量，由于表征出的黃酮類成分較少，所以2 個種類之間更多的差異成分還有待深究；原因二可能與黃酮類成分的生物合成途徑有關，大量實驗證實，植物黃酮類生物合成的前期途徑是相同的，都是以丙二酸單酰CoA 與香豆酰CoA（coumaroyl-CoA）為直接前體[26]，其分別與糖代謝、脂質代謝以及氨基酸代謝有關。本研究實驗以氨基酸代謝為主要代謝途徑，由于KEGG 結果表明苯丙氨酸代謝途徑較為顯著，所以實驗中所測得在大果沙棘中含量較高、差異較大的9 個黃酮類成分可能通過苯丙氨酸代謝途徑進行合成。有研究表明，苯丙氨酸代謝途徑還涉及常被認為是黃酮類化合物生物合成途徑限速酶之一的C4H[27]，所以可能導致大果沙棘中總黃酮含量較中華沙棘低，而實驗中所測得的9 個黃酮類成分含量較高。

4.3 中華沙棘、大果沙棘在功效上的評價

由于沙棘許多藥用功效都是通過黃酮類化合物發揮作用來實現的，其含有的黃酮糖苷、苷元等一些生物活性成分比較豐富，國內大果沙棘的研究多以種植和雜交為主，其常用于食品、化妝品和醫療保健品方面[7]；而中華沙棘多作為藥用，以兩者中總黃酮含量結果來看，中華沙棘在功效上可能強于大果沙棘。

綜上所述，不同品種沙棘的黃酮類成分在含量上是有差異的，首先其總黃酮含量在中華沙棘中含量較高，說明中華沙棘在藥用功效上可能強于大果沙棘；其次異鼠李素測定結果在大果沙棘中含量較高，說明其對臨床的質控和應用可能不太適用。實驗結果表明可以通過植物代謝組學研究不同品種植物的小分子代謝產物，對其生物合成途徑進行分析，并通過定性、定量分析找其初生及次生代謝產物的代謝變化的規律，從而對植物進行更加合理的分類，以上研究方法和結果可以為不同品種沙棘藥性、藥效差異的物質基礎提供依據，并對其成分分析、質量評價的研究提供技術支持和科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突