雞血藤指紋圖譜的建立及抗腫瘤譜效關系研究

聶鈺湘，郭占京，閤雪晴，韋敏珍，余遠智，何麗霞，黃宏妙

廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn 的干燥藤莖，具有活血補血、調經止疼，活絡筋脈的功效[1]?，F代藥理研究表明雞血藤粗提物或者總黃酮類物質也具有顯著的抗腫瘤作用[2-6]，如雞血藤醇提物可抗鼠肝癌S180活性[4]，總黃酮類物質可不同程度地抑制肝癌細胞凋亡[6]，但是其具體的藥效物質基礎并未明確。為了尋找雞血藤抗腫瘤物質基礎，王宏等[7]和富琦等[8]在發現雞血藤黃酮類組分具有顯著抗腫瘤作用的基礎上，建立了富含黃酮類化合物的有效組分雞血藤黃酮類抗腫瘤活性部位的HPLC 指紋圖譜，王妮佳[9]也基于UPLC 色譜法建立了8 個產地的雞血藤鞣質類成分（抗腫瘤活性組分）的指紋圖譜。但是這些研究只是采用指紋圖譜闡明了雞血藤抗腫瘤活性部位或某物質大類的化學成分組成，并未與其藥效聯系起來，未能直接闡明雞血藤抗腫瘤活性具體的藥效物質基礎，具有一定局限性。

中藥譜效關系則可以將中藥指紋圖譜與中藥藥效通過各種數據處理進行分析，篩選出與藥效密切相關的中藥成分[10]。因此，本研究通過建立雞血藤HPLC 指紋圖譜，采用灰色關聯度和偏最小二乘回歸分析等數理統計方法，將雞血藤指紋圖譜信息與雞血藤體外抗人肝癌HepG2 細胞藥效進行綜合分析，期望篩選出雞血藤主要抗腫瘤活性成分（群），初步揭示雞血藤體外抗腫瘤活性的藥效物質基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

雞血藤藥材購買于不同市場，經廣西中醫藥大學藥學院馬雯芳教授鑒定為豆科植物密花豆S.suberectusDunn 的干燥藤莖。樣品詳細信息見表1。

表1 雞血藤樣品信息Table 1 Sample information of Spatholobi Caulis

1.2 試劑

對照品原兒茶酸（批號RP190605）成都麥德生科技有限公司，質量分數≥99.99%；對照品兒茶素（批號 DST220929-047）、葛根素（批號DSTDG000202 ）、大 豆 苷 元 （ 批 號DSTDD002001）、染料木素（批號DSTDR000202）均購于樂美天醫藥德思特生物，質量分數≥98%；對照品芒柄花素（批號PS000674）成都普思生物科技股份有限公司，質量分數≥98%；紫杉醇（批號RL211020），質量分數≥98%，西安瑞林生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購于天津市富宇精細化工有限公司；胎牛血清（FBS）購于浙江天杭生物科技股份有限公司；四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）購于阿拉??； HepG2 細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.3 儀器

Waters 2998 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；CKX41SF 倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；HR1200-IIB2 生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；SQP電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；全波長酶標儀，生命技術控股有限公司；HVA-110 全自動立式高壓滅菌，日本Hirayama 公司。

2 方法

2.1 雞血藤HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液配制 精密稱取原兒茶酸、兒茶素、葛根素、大豆苷元、芒柄花素、染料木素適量，用乙醇溶解，并置于容量瓶中定容，配制成一定質量濃度的對照品溶液。再分別吸取上述對照品溶液，稀釋為原兒茶酸0.063 0 mg/mL、兒茶素0.166 5 mg/mL、葛根素0.163 5 mg/mL、大豆苷元0.157 5 mg/mL、芒柄花素0.153 0 mg/mL、染料木素0.151 5 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液配制 取雞血藤藥材約50 g，以1∶50 加入70%乙醇，超聲提取30 min（40 Hz、240 W），重復提取3 次，濾過，合并提取液，濃縮，干燥，得提取物粉末。取各批次雞血藤提取物粉末，以70%乙醇制成質量濃度為0.1 mg/mL 供試品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，轉移至進樣瓶備用。

2.1.3 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，10% A；10～140 min，10%～23% A；140～160 min，23%～27% A；160～200 min，27%～33% A；200～210 min，33%～37% A；體積流量為0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長260 nm。

2.1.4 精密度試驗 按“2.1.2”項制備雞血藤（S14）供試品溶液，以“2.1.3”項色譜條件連續進樣6 次，以1 號峰為參照峰（S），計算共有峰相對保留時間RSD≤2.43%，相對峰面積RSD≤2.75%

2.1.5 重復性試驗 按“2.1.2”項平行制備6 份雞血藤（S14）供試品溶液，以“2.1.3”項色譜條件進樣，以1 號峰為參照峰（S），計算共有峰相對保留時間RSD≤2.78%，相對峰面積RSD≤2.50%。

2.1.6 穩定性試驗 按“2.1.2”項制備雞血藤（S14）供試品溶液，在0、4、8、12、16、20、24 h，以方法“2.1.3”項色譜條件進樣，以1 號峰為參照峰（S），計算共有峰相對保留時間RSD≤2.35%，相對峰面積RSD≤2.83%。

2.1.7 指紋圖譜的建立及相似度評價 按“2.1.2”項制備27 批雞血藤藥材供試品溶液，以“2.1.3”項色譜條件進樣，將液相譜圖以cdf 格式導出，用“中藥指紋圖譜評價系統（2012.1 版）”打開進行數據分析。采用SPSS 21.0 進行聚類分析，采用SPSS 21.0和SIMCA 14.1 進行主成分分析。

2.2 抗腫瘤活性測定

2.2.1 樣品溶液準備 精密稱取雞血藤提取物粉末20.0 mg，DMEM 培養基溶解，0.22 μm 細胞專用濾膜濾過，用培養基稀釋為不同質量濃度，冷藏備用。

2.2.2 細胞培養 將HepG2 細胞培養在添加10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養基中，置37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。

2.2.3 MTT 法測定各樣品的抗腫瘤活性 取對數生長期的HepG2 細胞制成1×105個/mL 的單細胞混懸液，按照文獻[11]方法測定各雞血藤樣品的細胞抑制率。將雞血藤樣品質量濃度及對應測定的腫瘤細胞抑制率導入軟件SPSS 21.0 中，經處理可得半數抑制濃度（IC50）[12]。

2.3 譜效關系分析

2.3.1 灰色關聯度分析 將27 批雞血藤提取物的抗HepG2 細胞IC50值的倒數與HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積以初值法進行歸一化處理，并以IC50值的倒數為母序列（Yk），共有峰峰面積為子序（Xi），通過公式計算參考序列與比較序列的灰色關聯度[13-14]。

Aik＝(Δikmin＋ρΔikmax)＋(Δikman＋ρΔikmax)

Δik＝∣Yk－Xi∣

k為樣品編號，i為共有峰編號，Aik為關聯系數，ρ為分辨系數取0.5

2.3.2 偏最小二乘回歸分析 以各批次雞血藤HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為自變量（X），雞血藤提取物抗HepG2 細胞IC50值的倒數為因變量（Y），利用SIMCA14.0 軟件，進行偏最小二乘回歸[15]分析，建立回歸方程。

3 結果與分析

3.1 雞血藤HPLC 指紋圖譜分析

3.1.1 方法學考察 雞血藤樣品在重復性、精密度、穩定性考察中，各色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3.0%，說明該方法具有良好的可行性，可用于建立雞血藤的指紋圖譜。

3.1.2 雞血藤指紋圖譜的建立及共有峰指認 用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012.1 版” 27 批不同地區雞血藤的液相譜圖，以S1 為參照圖譜，采用平均數法，時間窗寬度0.1 min，經多點校正，生成雞血藤HPLC 色譜疊加圖（圖1），得到共有峰對照圖譜（圖2-B），共標定出14 個共有峰；將共有峰對照圖與混合對照品（圖2-A）比對，確定1 號峰為原兒茶酸，2 號峰為兒茶素，3 號峰為葛根素，9 號峰為大豆苷元，13 號峰為染料木素，14 號峰為芒柄花素。

圖1 雞血藤HPLC 指紋圖譜疊加圖Fig.1 Superimposed HPLC fingerprint of Spatholobi Caulis

圖2 混合對照品HPLC 圖 (A) 與雞血藤HPLC 對照指紋圖譜 (B)Fig.2 HPLC fingerprint of mixed standard (A) and HPLC fingerprint of Spatholobi Caulis (B)

3.1.3 相似度評價 在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012.1 版”中得到27 個不同地區雞血藤相似度結果見表2。其中來自中國廣西（S8～S12、S27）、越南（S6、S7、S13～S16、S23～S25）、中國廣東（S21）、老撾（S22）的藥材相似度大于0.9，說明這些產區的藥材化學特征接近；而來自中國云南的部分藥材（S2～S4、S19、S20）的相似度小于0.9，說明該產區藥材與中國廣西、越南、中國廣東、老撾等產區藥材的化學特征存在一定的差異性。

表2 雞血藤樣品相似度評價結果Table 2 Results of similarity evaluation of Spatholobi Caulis samples

3.1.4 聚類分析 在SPSS 21.0 軟件中導入27 批雞血藤共有峰峰面積，采用組間聯系，以平方歐氏距離進行聚類分析，結果見圖3。當歐式間距為13 時，可聚為4 類，第1 類：S1～S6、S8、S17～S21、S24、S26；第2 類：S7、S9、S10、S13、S23、S25、S27；第3 類：S11、S12；第4 類S15、S22、S14、S16，表明不同產地的雞血藤藥材中化學成分存在一定差異，相同產地雞血藤的化學成分類似，如當歐式間距為6 時，中國云南產地雞血藤聚為一類。

圖3 雞血藤聚類分析樹狀圖Fig.3 Clustering analysis tree diagram of Spatholobi Caulis

3.1.5 主成分分析

（1）特征值與貢獻率：將27 批雞血藤中14 個共有峰峰面積為評價指標導入SPSS 21.0 軟件，經描述統計及標準化處理，得到各主成分相關特征值及貢獻率，結果見表3。以主成分特征值＞1 為依據，得到3 個主成分，第1 主成分方差貢獻率為49.765%，第2 主成分方差貢獻率為14.653%，第3主成分方差貢獻率為10.865%，累積方差貢獻率為75.274，該3 個主成分可基本反映出雞血藤藥材成分的質量評價指標。

表3 主成分分析特征值和貢獻率Table 3 Characteristic values and contribution rates of principal component analysis

（2）成分矩陣：通過SPSS 21.0 軟件分析得到特征值與貢獻率的同時，也得到雞血藤共有峰。由成分矩陣見表4。以因子載荷大于0.5[16]分析，主成分1 信息主要來源于峰1～3、5、8～14；主成分2信息主要來源于峰6、4、7；主成分3 信息主要來源于峰13、12，由此可知引起雞血藤質量差異的原因可能是多因素導致的結果。

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Load matrix table of principal components

（3）主成分得分與綜合得分分析：通過SPSS 21.0 方差貢獻率及成分矩陣分析，將27 批雞血藤共有峰峰面積經標準化處理，以各主成分的方差貢獻率為分配系數，計算27 批雞血藤各主成分得分與綜合得分，并進行排序，樣品得分越高，表明該樣品質量越好[17]。

結果顯示見表5，主成分綜合得分依次排序為S14＞S22＞S11＞S16＞S15＞S12＞S10＞S23＞S9＞S17＞S25＞S7＞S27＞S13＞S2＞S26＞S19＞S18＞S3＞S6＞S4＞S1＞S21＞S20＞S24＞S5＞S8，綜合排名靠前大部分為越南、老撾、中國廣西的雞血藤，與聚類分析結果相似，說明雞血藤藥材中共有成分在含量積累上受原產地生長環境的影響，存在組間差距。

表5 雞血藤主成分得分和綜合得分Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of Spatholobi Caulis

運用 SIMCA 14.1 軟件對27 批雞血藤藥材進行主成分分析，以HPLC 指紋圖譜中14 個共有峰峰面積為變量，以此構建27×14 的原始數據矩陣，繪制27 批不同地區雞血藤藥材的PCA 得分圖。結果見圖4，可將其分為3 類，S14 單獨為一類；S9～S12、S15～S17、S22、S23 為第2 類，主要為中國廣西、越南、老撾；S1～S8、S13、S18～S21、S24～S27 為第3 類。與SPSS 主成分分析綜合得分排序基本一致，排名第1 為第1 類，排名第2～10 為第2 類，主要為中國廣西、越南、老撾，及個別中國云南地區（S17），排名第10 以后為第3 類。由于地理環境，不同地區雞血藤存在質量差異，而同地區間可能由采摘時節不同也有所差異。

圖4 雞血藤PCA 圖Fig.4 PCA of Spatholobi Caulis

3.2 雞血藤抗腫瘤活性考察

按照上述“2.2”項步驟對HepG2 細胞進行體外抗腫瘤活性實驗，將雞血藤提取物對HepG2 細胞抑制率導入SPSS 21.0 軟件中，用Probit 回歸分析計算IC50值。結果見表6，27 批雞血藤樣品對HepG2細胞的抑制IC50值在1.319～2.769 mg/mL，其中S14對HepG2 細胞的抑制作用最強，其次為S23、S24，均為越南地區；而S1、S2、S26 對HepG2 細胞的抑制作用較弱，均來自于中國云南。初步說明雞血藤對HepG2 細胞有抑制作用，不同產地雞血藤對HepG2 細胞抑制作用強弱有所不同。

表6 雞血藤對HepG2 細胞的IC50 值Table 6 IC50 value of HepG2 cells induced by Spatholobi Caulis

3.3 雞血藤抗腫瘤譜效關系研究

3.3.1 灰色關聯度分析 灰色關聯度計算結果見表7，其中特征峰1（原兒茶酸）、7、6、3（葛根素）、11、12、14（芒柄花素）、4、8、13（染料木素）關聯度大于0.9，即這些峰在雞血藤發揮抗腫瘤作用方面有主要貢獻；同時，雞血藤中14 個特征峰與抗腫瘤關系總體關聯度均大于0.7[18]，可表明雞血藤是通過其內部的“有效組分群”共同發揮其抗腫瘤作用。

表7 灰色關聯度分析結果Table 7 Results of grey relational analysis

3.3.2 偏最小二乘回歸分析 偏最小二乘法回歸分析結果如下，圖5 為雞血藤抗HepG2 細胞標準回歸系數圖，即14 個特征峰抗HepG2 細胞活性標準回歸方程為：YHepG2＝?0.052X1＋0.190X2＋0.193X3－0.213X4＋0.078X5－0.252X6－0.224X7＋0.077X8＋0.122X9＋0.088X10＋0.073X11＋0.099X12＋0.036X13＋0.102X14；其中回歸方程系數的正、負代表各成分抗腫瘤活性的正相關或負相關。結果表明，有10 個共有峰回歸系數為正數，即與抗腫瘤活性呈正相關，相關性大小依次為峰3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）、14（芒柄花素）、12、10、5、8、11、13（染料木素）；有4 個共有峰回歸系數為負值，即與抗腫瘤活性呈負相關，相關性大小依次為峰6、7、4、1（原兒茶酸）。對各色譜峰VIP 進行分析（圖6），VIP 值大于1 的特征峰有6 個，分別為峰6、2、3、4、7、9。綜合相關系數和VIP 值2 個指標，即抗腫瘤活性呈正相關且VIP 值大于1的共有峰有3 個，分別為2（兒茶素）、3（葛根素）、9（大豆苷元）。綜合以上灰色關聯度分析結果可得出3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）是與雞血藤抗腫瘤作用的主要物質基礎。

圖5 抗HepG2 細胞標準回歸系數圖Fig.5 Standard regression coefficient of anti-HepG2 cells

圖6 抗HepG2 細胞VIP 貢獻圖Fig.6 VIP contribution of anti-HepG2 cells

3.3.3 單體化合物抗腫瘤活性驗證 通過灰色關聯度與偏最小二乘法分析結果，篩選出峰3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）可能為雞血藤抗HepG2 細胞的物質基礎。為了驗證譜效分析結果的可靠性，以紫杉醇作為陽性對照，對葛根素、兒茶素、大豆苷元進行抗HepG2 細胞活性實驗。分別稱取化合物適量，配制為不同濃度含藥培養基，計算各單體化合物對HepG2 肝癌細胞抑制率，結果見圖7。各單體化合物均具有抑制HepG2 細胞生長作用；陽性對照紫杉醇的IC50值為6.016 μg/mL，葛根素、兒茶素、大豆苷元IC50值分別為250.73、321.43、364.30 μg/mL，雖然各單體化合物細胞抑制率均低于陽性對照藥紫杉醇，但是各單體化合物對HepG2細胞的抑制率隨著濃度的升高而增強，存在劑量相關關系；且在相同質量濃度下，各單體化合物對HepG2 細胞的抑制率次依為葛根素＞兒茶素＞大豆苷元，體外驗證結果與譜效相關性程度一致?？蛇M一步驗證葛根素、兒茶素、大豆苷元可能是雞血藤抗肝癌活性基礎物質。

圖7 紫杉醇、葛根素、兒茶素、大豆苷元對HepG2 肝癌細胞生長抑制率Fig.7 Growth inhibition rates of paclitaxel, puerarin,catechin, and daidzein on HepG2 hepatoma cells

4 討論

4.1 HPLC 色譜條件優化

本實驗用Waters 2998 PDA 檢測器的液相型號，在210～400 nm 對雞血藤醇提液全波長掃描，篩選出在260 nm 波長下，色譜峰出峰較多，特征性強，因此，選擇波長為260 nm。同時考察流動相種類甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液，其中乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，色譜峰分離效果較佳。進一步探究乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）洗脫比例，洗脫程序為0～10 min，10%A；10～140 min，10%～23% A；140～160 min，23%～27% A；160～200 min，27%～33% A；200～210 min，33%～37% A 時，各色譜峰出峰時間適宜，峰型較好。

4.2 指紋圖譜

通過HPLC 法得到不同產區雞血藤指紋圖譜，比較相似度可發現相似度低于0.9 的批次均來自中國云南地區；而越南、中國廣西一帶中有效成分相似度高，均大于0.9；同時，雞血藤通過聚類分析可分為4 類，中國云南地區全部在第1 類中，第3 類與第4 類主要來自越南和中國廣西，與主成分分析分析相符。因此，相似度、聚類分析、主成分分析均說明不同產地間藥材中有效成分組成受地理位置、生長環境、采摘時節等影響較大，該分析可為種植雞血藤藥材在選址上提供參考價值。

4.3 譜效關系研究

中藥譜效關系主要是通過數理統計方法分析指紋圖譜與藥效間的潛在關系，預測和篩選處中藥中的有效成分；其中，偏最小二乘回歸分析是以線性關系預測有效成分的作用強弱，具有一定的誤差性；灰色關聯度是根據開放數據的幾何曲線進行評估，將2 種分析方法綜合比較，可以得到更全面的分析[18]?；谧V效關系中灰色關聯度與偏最小二乘回歸分析方法，將雞血藤HPLC 指紋圖譜共有峰與抗腫瘤活性數據通過數理統計手段進行綜合評價，結果表明2 號峰兒茶素、3 號峰葛根素、9 號峰大豆苷元偏最小二乘標準方程回歸系數為正值，且VIP值＞1.0；通過對葛根素、兒茶素、大豆苷元抗HepG2肝癌細胞藥效驗證研究發現，各單體成分均具有一定的抑制作用，其IC50值分別為250.73、321.43、364.30 μg/mL，在一定程度上驗證了譜效關系研究結果。同時，有文獻表明兒茶素可通過調控腫瘤相關蛋白、抗氧化抗炎等相關途徑，抑制腫瘤細胞活性[19-22]，葛根素與大豆苷元屬于異黃酮類物質，可抑制腫瘤細胞周期、影響線粒體調控、基因蛋白的表達等途徑發揮抗腫瘤作用[23-25]。綜上所述，可認為兒茶素、葛根素、大豆苷元是雞血藤抗HepG2 細胞的物質基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突