三種抗氧化劑對斑馬魚卵母細胞冷凍保存效果比較

黃柯嘉 蔡心清 郭冰玉 張全根 張俊芳 韓兵社

摘 要：為研究抗氧化劑對斑馬魚卵母細胞冷凍保存效果的影響，在基礎冷凍保護液配方中分別添加褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等3種抗氧化劑進行了冷凍保存試驗，比較冷凍后卵母細胞的活性氧（ROS）含量、總抗氧化能力（T-AOC）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、凋亡基因表達水平和存活率。試驗結果顯示：經過篩選，3種抗氧化劑的最優添加濃度分別為褪黑素1×10-3 mol/L、谷胱甘肽5×10-4 mol/L、甜菜堿1×10-3 mol/L。與對照組相比，添加最優濃度抗氧化劑的3個試驗組（褪黑素組、谷胱甘肽組和甜菜堿組）的ROS含量均顯著降低，ATP含量和SDH活性均顯著提高，褪黑素組和甜菜堿組的T-AOC水平顯著提高（P＜0.05）；褪黑素組卵母細胞的caspase3、caspase9和bax基因表達量顯著降低，bcl-2基因表達量則顯著升高（P＜0.05）；谷胱甘肽組卵母細胞的caspase3基因表達量顯著下降，bcl-2基因表達量顯著上升（P＜0.05）；甜菜堿組卵母細胞的caspase9和bax基因表達量顯著降低（P＜0.05）。復蘇后的卵母細胞在體外培育120 min，褪黑素組、谷胱甘肽組、甜菜堿組卵母細胞的存活率分別比對照組提高10.13%、14.20%和15.99%；冷凍保存1、7、30、60、90 d，3個試驗組卵母細胞的存活率均顯著高于對照組（P＜0.05）；冷凍保存90 d，褪黑素組、谷胱甘肽組、甜菜堿組的存活率分別提高了9.05%、7.34%、6.68%。試驗結果說明，在斑馬魚卵母細胞冷凍保存過程中添加1×10-3 mol/L褪黑素或5×10-4 mol/L谷胱甘肽或1×10-3 mol/L甜菜堿，均能夠增強冷凍保存后卵母細胞的線粒體功能，降低細胞氧化應激水平，減少細胞凋亡，從而提高斑馬魚卵母細胞冷凍效率。

關鍵詞：冷凍保存；卵母細胞；斑馬魚；抗氧化劑；褪黑素；谷胱甘肽；甜菜堿

冷凍保存是在超低溫下長期保存生物配子的技術，可以減少遺傳漂變，保持活躍的繁殖群體，為保護種質資源提供一種方案［1］。由于母體遺傳的存在，母本基因組在種質資源保護中十分重要，卵母細胞的冷凍保存能夠提高物種的保護效率［2］。迄今，對卵母細胞冷凍保存的研究已開展了40多年，并已成功實現了人、小鼠、兔、牛、羊、豬等哺乳動物卵母細胞的冷凍保存［3］。對于魚類，目前研究者已對斑馬魚、鯉、鱘、彩虹魚、褐鱒、鯽等的卵巢組織或卵母細胞進行了冷凍保存，但是由于魚類卵母細胞具有體積大、卵膜通透性差、卵黃含量多、對抗凍劑毒性敏感等特點，對魚類卵母細胞凍存的效果還不夠理想，保存方案的可重復較差［4］，再加上長期凍存研究數據的缺乏，卵母細胞的凍存方案亟待進一步優化。

冷凍保存過程中細胞內活性氧（ROS）的積累是引起氧化應激，導致細胞損傷的重要原因［5］。近年來，在哺乳動物卵母細胞冷凍保存過程中會使用一些抗氧化劑，如褪黑素、白藜蘆醇、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、槲皮素和甜菜堿等來改善保存效果。褪黑素是一種高效的抗氧化劑，它可以清除細胞內的自由基，提高抗氧化酶的活性，減少細胞的氧化損傷，維持卵膜的通透性，從而改善卵母細胞的體外成熟和胚胎發育歷程［6-7］。谷胱甘肽作為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，在細胞抗氧化應激中，其分子中的巰基能夠與活性氧自由基結合，將體內的有害毒物進行無害轉化［8］。研究發現，在小鼠卵母細胞玻璃化、升溫或體外成熟培養基中補充谷胱甘肽可以減少卵母細胞受到的冷凍損傷，提高受精卵的發育能力［9］。甜菜堿具備抗氧化特性，能夠抑制ROS的產生，并清除部分氧化自由基［10］。研究發現，含有甜菜堿的CaCO3微?？梢蕴岣哓埪雅菥€粒體的活性、降低活性氧從而提高存活率［11］。然而，目前有關抗氧化劑在魚類卵母細胞冷凍保存中的研究尚不多見。

斑馬魚（Danio rerio）是一種常見的熱帶觀賞魚，其個體小、繁殖周期短、產卵量大，并且具有胚胎體外受精、體外發育、胚體透明等特點，是重要的脊椎動物模式生物之一，也是開展水產動物基礎技術研究的重要模式生物。本試驗在冷凍過程中分別添加褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等3種抗氧化劑，通過檢測斑馬魚卵母細胞的活性氧（ROS）含量、總抗氧化能力（T-AOC）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、凋亡基因表達水平以及存活率的變化，分析抗氧化劑種類及其濃度對斑馬魚卵母細胞冷凍保存效果的影響，以期為魚類卵母細胞冷凍保存技術的的優化提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑（來源）：褪黑素、L-15培養基（北京索萊寶科技有限公司），谷胱甘肽（上海泰坦科技股份有限公司），甜菜堿（源葉生物科技有限公司），三卡因、甲醇、二甲基亞砜（賽默飛公司），蔗糖（上海百研科技生物有限公司），ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，S0033S），增強型ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，S0027），T-AOC檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，A015-3-1），SDH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，A022-1-1），TransScript Uni All-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Remo-val）（北京全式金生物技術有限公司，AU341），Perfectstart? Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司，AQ601）。

主要儀器：體視顯微鏡（蔡司Stemi 2000），熒光定量PCR儀器（羅氏LightCycler48）。

1.2 斑馬魚卵母細胞的采集

挑選性成熟（腹部飽滿）的雌性斑馬魚，用質量濃度為168 mg/L的三卡因溶液麻醉后置于冰上，解剖取出其兩側的卵巢并轉移到L-15培養基中。用外科鑷將卵巢分散，再使用5 mL無菌巴氏吸管對卵母細胞輕輕吹打，分離出單個卵母細胞。使用L-15培養基清洗后，將卵母細胞放在培養基中待用。

1.3 冷凍保護劑的配制

冷凍保護劑的基礎配方為：1.5 mol/L甲醇+5.5 mol/L二甲基亞砜+0.5 mol/L蔗糖。根據文獻［9，11-12］，在基礎配方上分別添加褪黑素（0、1×10-3、1×10-5、1×10-7 mol/L）、谷胱甘肽（0、5×10-4、2×10-3、4×10-3 mol/L）和甜菜堿（0、1×10-3、1×10-4、1×10-5 mol/L）制備成含有不同濃度抗氧化劑的冷凍保護液。

預平衡溶液：1.5 mol/L甲醇+2.75 mol/L二甲基亞砜，稀釋液為90%的L-15培養基。

1.4 卵母細胞的冷凍與復蘇

將卵母細胞分裝進2 mL凍存管中，加入500 μL預平衡溶液。室溫預平衡15 min后，將預平衡溶液吸出，分別加入各濃度的冷凍保護劑200 μL，靜置90 s后，放進液氮中冷凍。24 h后，將凍存管從液氮中取出，迅速在28 ℃水浴條件下解凍30 s。待玻璃化液解凍后，迅速將卵母細胞轉移到離心管中，采用三步平衡法，依次在1.00、0.50、0.25 mol/L的蔗糖溶液中分別平衡1、3、5 min，再用L-15培養基洗滌2～3遍。

1.5 斑馬魚卵母細胞存活率的檢測

將4種凍存方案的卵母細胞解凍，每種取5管重復，每管取出至少100顆卵母細胞，加0.4%臺盼藍染色5 min。使用顯微鏡觀察、拍照、計數，其中被染色的卵母細胞判定為死細胞，未被染色的細胞為活細胞，根據以下公式計算存活率。

細胞存活率＝未染色細胞數/細胞總數×100%（1）

1.6 斑馬魚卵母細胞ROS含量和T-AOC水平檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細胞解凍，每種取3管重復，按質量（g）∶體積（mL）=1∶6加入預冷的0.5 mol/L Tris-HCl，進行勻漿。在4 ℃下以 3 500 g 離心10 min，用預冷的PBS緩沖液將上清稀釋100倍，檢測總蛋白濃度。在白色不透光酶標板的每個孔內加入20 μL樣品，再加180 μL濃度為 10 μmol/L的DCFH-DA（ROS熒光探針），28 ℃孵育2 h。使用488 nm激發波長、525 nm發射波長進行檢測，參照標準曲線計算ROS含量。

將4種凍存方案凍存的卵母細胞解凍，每種取3管重復，按質量（g）∶體積（mL）=1∶4加入PBS緩沖液，進行勻漿。在4 ℃下以3 500 g 離心10 min，取上清，按照總蛋白（TP）和T-AOC檢測試劑盒說明書檢測T-AOC水平。

1.7 斑馬魚卵母細胞ATP和SDH水平檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細胞解凍，每種取3管重復，按質量（g）∶體積（mL）=1∶6加入預冷的裂解液，進行勻漿。在4 ℃下以12 000 g離心5 min，取上清待測。按照ATP、總蛋白定量（TP）試劑盒說明書檢測ATP含量。

將4種凍存方案凍存的卵母細胞解凍，每種取3管重復，按質量（g）∶體積（mL）=1∶9加入預冷的PBS緩沖液，進行勻漿。在4 ℃以2 500 g離心10 min，取上清待測。按照SDH、總蛋白定量（TP）試劑盒說明書檢測SDH活性。

1.8 凋亡相關基因表達檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細胞解凍，每種取3管重復，采用TRIzol法提取斑馬魚卵母細胞的總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉成cDNA后，進行qPCR擴增。在NCBI網站設計凋亡相關基因引物（見表1）。以β-actin為內參，用相對定量方法（2-△△Ct）進行數據分析。

1.9 數據分析

試驗數據以（平均值±標準差）表示，采用SPSS Statistics 26.0軟件統計進行數據分析，采用單因素分析方法（one-way ANOVA）檢驗分析不同組別之間的顯著差異性，設顯著性水平為0.05。

2 結果和分析

2.1 不同抗氧化劑最優濃度的篩選

由圖1可見，與對照組（未添加組）相比，褪黑素添加濃度為1×10-3、1×10-5和1×10-7 mol/L的試驗組均可顯著提高卵母細胞的存活率（P＜0.05），3個組的存活率分別為（84.04±1.45）%、（84.30±4.01）%和（87.88±2.55）%，分別提高了6.58%、6.84%和10.42%，但3個組間差異不顯著（P＞0.05）。谷胱甘肽添加濃度5×10-4、2×10-3 mol/L的試驗組均可顯著提高卵母細胞的存活率（P＜0.05），與對照組相比分別提高了8.48%和7.60%，其中5×10-4 mol/L組卵母細胞的存活率最高，為（89.18±4.70）%。添加濃度1×10-3 mol/L甜菜堿的試驗組可顯著提高卵母細胞的存活率（P＜0.05），其存活率為（85.88±8.75）%，與對照組相比提高了11.16%。試驗結果顯示，上述3種抗氧化劑均可以提高凍存斑馬魚卵母細胞的存活率，其最優添加濃度分別為褪黑素1×10-3 mol/L，谷胱甘肽5×10-4 mol/L，甜菜堿1×10-3 mol/L。

2.2 不同抗氧化劑對凍存卵母細胞ROS含量和T-AOC水平的影響

由圖2可見，與對照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿這3種抗氧化劑均可顯著降低卵母細胞的ROS含量（P＜0.05），3個添加組的ROS含量分別為（111.86±2.76）、（112.58±2.93）、（88.11±9.04）RFU/μg，分別降低了13.72%、13.17%、31.27%。褪黑素和甜菜堿可以顯著提高卵母細胞的T-AOC水平（P＜0.05），其T-AOC分別為（0.129±0.009）、（0.133±0.016）mmol/L，與對照組相比分別提高約35.79%、40.00%。

2.3 抗氧化劑對凍存卵母細胞ATP含量和SDH活性的影響

由圖3可見，與對照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿3種抗氧化劑均可顯著提高斑馬魚卵母細胞的ATP含量，其中褪黑素組的ATP含量最高（P＜0.05），3個添加組的ATP含量分別為（5 515.74±1 189.94）、（4 086.64.62±369.72）、（3 717.11±167.18）nmol/mg，分別比對照組提高了140.98%、78.54%、62.40%。褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿3種抗氧化劑均可顯著提高斑馬魚卵母細胞的SDH活性（P＜0.05），3個添加組的SDH活性分別為（14.70±0.89）、（15.44±0.10）、（13.64±0.27）U/mg，分別比對照組提高了20.39%、26.45%、11.71%。

2.4 抗氧化劑對凍存卵母細胞凋亡相關基因表達的影響

由圖4可見，與對照組相比，褪黑素組斑馬魚卵母細胞的凋亡相關基因caspase3、caspase9和bax的表達量顯著下降，bcl-2表達量顯著上升（P＜0.05）；谷胱甘肽組斑馬魚卵母細胞的凋亡基因caspase3表達量顯著下降，bcl-2表達量顯著上升（P＜0.05）；甜菜堿組斑馬魚卵母細胞的凋亡相關基因caspase9和bax的表達量顯著下降（P＜0.05）。

2.5 抗氧化劑對復蘇后卵母細胞體外培育過程中存活率的影響

由圖5可見，復蘇后的卵母細胞在體外培育30 min，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿添加組卵母細胞的存活率分別為（76.02±1.28）%、（75.69±1.58）%、（76.35±3.57）%，3個添加組之間沒有顯著差異（P＞0.05）；體外培育60 min后，谷胱甘肽、甜菜堿組卵母細胞的存活率分別為（72.62±3.32）%、（73.28±1.88）%，顯著高于對照組（P＜0.05），分別比對照組提高了5.26%、5.92%；體外培育120 min后，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿添加組卵母細胞的存活率分別為（43.37±4.59）%、（47.44±3.00）%、（49.23±3.31）%，均顯著高于對照組（P＜0.05），分別比對照組提高了10.13%、14.20%、15.99%。

2.6 抗氧化劑對斑馬魚卵母細胞長期凍存存活率的影響

由圖6可見，與對照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿均可顯著提高玻璃化凍存1 d、7 d、30 d、60 d、90 d后的卵母細胞的存活率（P＜0.05）。凍存1 d后，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿組卵母細胞的存活率分別為（89.32±0.62）%、（89.19±1.93）%、（89.20±1.29）%，分別提高了4.98%、4.85%、4.86%；凍存7 d后，上述3組的存活率分別為（78.60±0.51）%、（74.37±2.95）%、（76.18±2.94）%，分別提高了16.54%、12.31%、14.12%；凍存30 d后，上述3組的存活率分別為（56.60±5.19）%、（58.58±4.07）%、（60.55±0.51）%，分別提高了7.88%、9.86%、11.83%；凍存60 d后，上述3組的存活率分別為（48.74±3.37）%、（46.00±4.59）%、（48.42±4.16）%，分別提高了10.18%、7.44%、9.86%；凍存90 d后，上述3組的存活率分別為（34.66±2.47）%、（32.95±3.59）%、（32.29±2.89）%，分別提高了9.05%、7.34%、6.68%。

3 討論

褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等抗氧化劑已在人、小鼠、水貂、豬、貓等動物配子的冷凍保存中得到應用，但在魚類卵母細胞冷凍保存研究中尚未見相關報道［3，6-11］。本試驗在斑馬魚卵母細胞冷凍保存和體外培育過程中分別添加1×10-3 mol/L的褪黑素、5×10-4 mol/L的谷胱甘肽和1×10-3 mol/L的甜菜堿，結果發現，3種濃度的抗氧化劑均可顯著提高復蘇后的卵母細胞在體外培育120 min和長期凍存1、7、30、60、90 d的存活率。試驗結果說明，在魚類卵母細胞冷凍保存過程中加入抗氧化劑同樣能改善保存效果，該方法在魚類卵母細胞冷凍保存中具有應用前景。

本試驗結果顯示，在冷凍保存過程中分別添加褪黑素、谷胱甘肽或甜菜堿可以顯著降低卵母細胞的ROS含量；褪黑素和甜菜堿組斑馬魚卵母細胞的T-AOC水平顯著升高。以上結果與褪黑素用于人卵母細胞冷凍保存［7］和甜菜堿用于貓卵泡冷凍保存［11］中的研究結果相一致。這說明上述抗氧化劑可以清除細胞內的自由基，提高抗氧化酶的活性，對降低冷凍引起的卵母細胞氧化損傷有一定的保護作用。

本試驗結果顯示，在冷凍保存過程中添加褪黑素、谷胱甘肽或甜菜堿可以顯著提高斑馬魚卵母細胞的ATP含量和SDH活性。線粒體數量減少和活性降低會導致卵母細胞發育障礙，影響其成熟、受精及早期胚胎發育，而線粒體的功能通?？梢杂葾TP含量和SDH活性來反映［13-14］。有研究發現，在小鼠GV卵母細胞和人卵母細胞冷凍保存過程中加入褪黑素，能夠保護線粒體功能，提高ATP含量［15-16］。本研究結果表明，在魚類卵母細胞凍存中，添加褪黑素等抗氧化劑均可以增強其線粒體功能，促進ATP的產生，進而提高凍存效率。

本試驗結果顯示，在冷凍保存過程中添加褪黑素、谷胱甘肽后，卵母細胞的caspase3表達量顯著降低；添加褪黑素、甜菜堿后，caspase9表達量顯著降低；添加褪黑素、甜菜堿后，bax表達量顯著降低；添加褪黑素、谷胱甘肽后，bcl-2表達量顯著提高。上述結果與Shirzeyli等［17］在冷凍保存中添加抗氧化劑可以降低bax/bcl-2比率和caspase3的mRNA相對表達量、降低細胞凋亡的結果相一致。有研究表明，冷凍損傷會對線粒體功能造成負面影響，并且啟動相關凋亡通路，線粒體損傷能夠誘導細胞凋亡［18］。線粒體在細胞凋亡中通過釋放caspases激活因子，使caspase活化，最終使蛋白質裂解和細胞解體死亡［19］，同時，BCL-2家族蛋白，包括抗凋亡bcl-2成員和促凋亡bax成員等通過相互作用來調節線粒體的外膜通透性，控制線粒體向細胞質釋放的細胞死亡信號分子［20］。本試驗表明，所用的3種抗氧化劑可改善線粒體功能，減少細胞凋亡，與添加3種抗氧化劑后斑馬魚卵母細胞ATP含量上升的試驗結果相符。

綜上所述，在冷凍保存和體外培育斑馬魚卵母細胞時，在基礎冷凍保護液配方中添加1×10-3 mol/L的褪黑素或5×10-4mol/L的谷胱甘肽或1×10-3 mol/L的甜菜堿，能減少細胞氧化損傷，改善線粒體功能，降低細胞凋亡水平，從而提升卵母細胞的存活率。上述3種抗氧化劑均可提高斑馬魚卵母細胞冷凍保存的存活率，且三者的存活率較為接近?？寡趸嚓P指標顯示，甜菜堿表現出最佳的抗氧化效果；線粒體功能相關指標顯示，褪黑素對于卵母細胞線粒體的保護作用最為明顯。綜合來看，3種抗氧化劑可能通過不同的機制對斑馬魚卵母細胞的冷凍保存起到了改善作用。本研究揭示了褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿作為魚類卵母細胞冷凍保護劑的可能性，為卵母細胞的冷凍保存提供了新的思路。

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Comparison of the effects of three antioxidants on the cryopreservation of zebrafish oocytes

HUANG Kejia ， CAI Xinqing ， GUO Bingyu ， ZHANG Quangen3， ZHANG Junfang ， HAN Bingshe

（1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，

Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;

2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries

Science Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;

3. Shanghai Dianyuan Aquatic Seed Farm，Shanghai 201722，China）

Abstract： To investigate the effects of antioxidants on the cryopreservation of zebrafish oocytes，melatonin，glutathione and betaine were added to the basic cryoprotective solution in this study.The antioxidant capacity，mitochondrial function，expression of apoptosis-related genes and survival rate were tested.The results showed that the optimal concentration of the three antioxidants were melatonin 1×10-3 mol/L，glutathione 5×10-4 mol/L，and betaine 1×10-3 mol/L.ATP content and SDH activity were significantly increased in the three experimental groups（melatonin group，glutathione group and betaine group） supplemented with the optimal concentration of antioxidants，while ROS content was significantly decreased（P<0.05）.The level of T-AOC in betaine and melatonin groups significantly increased（P<0.05）.The expression of caspase3，caspase9 and bax genes in melatonin group significantly decreased，while the expression of bcl-2 significantly increased（P＜0.05）.The expression of caspase3 in glutathione group was significantly decreased，while the expression of bcl-2 was significantly increased.The expression of caspase9 and bax in betaine group was significantly decreased.The survival rate of oocytes in melatonin，glutathione and betaine groups increased by 10.13%，14.20% and 15.99%，respectively after 120 min vitro incubation.After 1，7，30，60 and 90 days of cryopreservation，the survival rate of oocytes in three experimental groups were significantly higher than that of the control group.After 90 days of cryopreservation，the survival rate was increased by 9.05%，7.34% and 6.68%，respectively.The results indicated that the addition of antioxidants melatonin，glutathione and betaine during zebrafish oocyte cryopreservation could protect mitochondrial function，reduce oxidative damage and cell apoptosis，and improve the quality of zebrafish oocytes.

Key words： cryopreservation; oocyte; zebrafish; antioxidant; melatonin; glutathione; betaine