分光光度法測定湖泊水中葉綠素a含量的研究

趙榮龍 梁欣欣 吳玉萍 崔丹 張玲

摘 要：葉綠素a含量是評價水體富營養化水平的重要依據，水體營養化程度過高會影響水生生物的生存和繁殖，導致水體生態系統紊亂，生物多樣性受到破壞。葉綠素a幾乎是所有浮游植物類別都含有的葉綠素類型。所以，葉綠素a含量既是水體富營養化的判斷標準，又是浮游植物現存量的重要推斷依據。水體富營養化是我國當前水環境面臨的主要問題。為闡明分光光度法測定水體中葉綠素a含量結果的快速性和準確性，本研究用研磨機代替手工研磨進行樣品制備，用標準物質進行加標測定。結果顯示葉綠素a檢測值符合標準要求。

關鍵詞：分光光度法，水體，葉綠素a

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.07.041

0 引 言

葉綠素a的含量是評價水體富營養化水平的重要依據，通過葉綠素a的含量可以估算出水體中浮游植物生物量[1-2]。浮游植物存量過高會造成水體的透明度降低，陽光難以穿透水面阻礙水體中植物進行光合作用，植物本身的呼吸作用會導致水體中氧氣被消耗，所以造成水體局部缺氧，而水體表面的浮游植物通過光合作用又會釋放大量氧氣，這樣會形成水體中缺氧，水面氧氣過飽和的情況，水生動物（如魚類）會因為缺氧而死亡；浮游植物生物量過高還會造成底層浮游生物堆積，在厭氧條件下分解發酵產生有害氣體和毒素，傷害水生生物[3]；營養化程度高的水體中含有大量的硝酸鹽和亞硝酸鹽，高含量硝酸鹽和亞硝酸鹽水體對人類和其他動物飲用水安全有很大危害。所以，如何快速、準確地檢測水體中葉綠素a含量并對水體中葉綠素a含量進行合理控制，這對保護水資源、改善水環境尤為重要。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和材料

玻璃纖維濾膜（孔徑：0.45 μm）。

離心管（PTFE材質15 mL）。

研磨珠（材質：氧化鋯；規格：5 mm）。

Tiss-24多樣品組織研磨機（上海凈信實業發展有限公司）。

DT5-1低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）。

D R 2 8 0 0 便攜式可見分光光度計（美國哈希）。

針式濾器（直徑：25 mm；孔徑：0.45 μm）。

比色皿（1 cm）。

1.2 試劑

丙酮：GR（西隴科學）。

丙酮溶液（配比9+1：9 0 0 m L丙酮+10 0 m L純水）。

葉綠素a溶液標準物質（含量：10 0±3% μg /mL；產品編號：BW91697-01，北京普析標準技術有限公司）。

葉綠素a標準中間液：ρ（葉綠素a）=1.00 μg/mL。

移取1.00 mL葉綠素a標準貯備液于100 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至標線，混勻。

1.3 樣品

1.3.1 樣品的采集

采集分析葉綠素a樣品的水樣可以使用500 mL的玻璃瓶作為采樣瓶，在距離水面0.5 m的地方進行水樣采集，如果水深不足0.5 m時采集距離水面中部的水樣。如果有泥沙和其他雜物時應將水樣靜止30min后取水面下5 ㎝的水樣作為分析樣品。水樣采集完畢宜盡快送實驗室。

1.3.2 樣品的制備

用量筒準確量取水樣100 mL，將水樣倒入事先準備好帶濾膜的過濾裝置上進行抽濾，注意抽濾時負壓不要過大以免抽破濾膜。待抽濾快結束時用水清洗抽濾器內壁，抽濾結束后取出濾膜，撕去多余空白濾膜然后將有抽濾物的部分對折放入離心管中。在每個離心管中加入一顆研磨珠，將抽濾物和研磨珠壓至離心管底部，用分液器在每支離心管中定量加入丙酮溶液10 mL蓋上蓋子，將離心管移至多樣品組織研磨機上充分研磨5 min。取出離心管移至離心機以轉速3000 r/min的速度離心10 min，取出離心管用紙包好放入0～4℃的冰箱中避光浸泡提取2 h。以實驗室用水代替樣品做空白實驗。

1.4 分析

打開分光光度計電源并預熱15 min，以丙酮溶液進行儀器調零。用針式濾器將浸泡提取好的樣品過濾至比色皿中在波長750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處測量并記錄吸光度。波長750 nm處吸光度測量值應小于0.005，測定值不滿足要求時需檢查比色皿中樣品是否存在氣泡，如有必要進行二次過濾后測定。

結果計算[4]，按照實驗流程首先計算出定容后提取液中葉綠素a的質量濃度為：

然后再計算出水樣中葉綠素a的質量濃度為：

式中：

ρ1——水樣的葉綠素a質量濃度，μg/L；

ρ2——提取液的葉綠素a質量濃度，mg/L；

A 664——提取液在664 nm波長測定的吸光度；

A 647——提取液在647 nm波長測定的吸光度；

A 630——提取液在630 nm波長測定的吸光度；

A 750——提取液在750 nm波長測定的吸光度；

V1——提取液定容體積，mL；

δ——比色皿光程，cm；

V——水樣體積，L。

2 結果與討論

2.1 分析結果

2.1.1 準確度

為驗證本方法的準確度對滇池某采樣點（葉綠素a含量：79 ug/L）的水樣進行6次加標平行檢測，在每個樣品中加入1.00 ug/mL的葉綠素a標準物質0.50 mL。計算該樣品的加標回收率，結果顯示加標回收率為78.00%～106.0%，見表1。

2.1.2 精密度

為驗證本方法的精密度分別對滇池某采樣點A（葉綠素a含量：27 ug/L）和樣點B（葉綠素a含量：46 ug/L）的水樣各進行10次平行檢測，計算該樣品分析結果的相對標準偏差（RSD），結果顯示相對標準偏差在1.0%～6.0%之間，見表2。

2.2 方法注意事項

（1）丙酮溶液的配制要嚴格按照90 mL丙酮+10 mL純水的比例進行配制，否則在測試過程中可能會造成吸收峰的漂移，影響檢測結果的準確性。

（2）葉綠素a見光易分解，實驗過程中浸泡提取要注意避光操作。

（3）抽濾的過程中要避免因為抽濾壓力過大而造成葉綠素a的損失，因為過大的抽濾壓力會造成樣品細胞被破壞或穿透濾膜。

（4）為保證浮游植物能夠被充分研磨，研磨時間至少應保證5 min以上，研磨充分的樣品比較容易提取和分離。

3 結 語

提高工作效率，降低工作負荷和勞動強度，保護工作人員身心健康是現代企業管理的重要組成部分。用研磨機代替手工研磨進行樣品制備，不但能夠有效地降低分析人員的勞動強度，還能減少工作人員在研磨過程中造成葉綠素a的損失，提高分析準確度。丙酮對人體的傷害極大，人工操作過程中丙酮易揮發，對研磨過程進行密閉處理是不現實的。所以不論從分析結果的準確性、人工操作的安全性還是從人機功效方面的考慮，采用機器研磨的方式代替手工研磨都勢在必行。

參考文獻

[1]黃曉麗，羅婭敏，趙志友，等.葉綠素a分光光度法的研究[J].科學技術創新，2021（24）：41-42

[2]張婧.水中葉綠素a測定方法的比較研究[J].科技創新與應用，2022，12（19）：130-134

[3]鄒敏，蹇川，李文俊.葉綠素a分光光度法測定探討[J].皮革制作與環?？萍?，2021，2（2）：18-20.

[4]生態環境部.水質 葉綠素a的測定 分光光度法：HJ 897—2017[S].

作者簡介

趙榮龍，本科，工程師，研究方向為環境分析與保護。

（責任編輯：張瑞洋）