產愈創木酚菌株篩選及其在醬油釀造中的應用

張穎超 于鑫 趙祥穎 劉麗萍 王新文 黃艷紅 劉建軍

摘要：從日式高鹽稀態發酵醬油醬醪中分離獲得一株能轉化阿魏酸（ferulic acid，FA）生成4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）和4-乙基愈創木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）的酵母菌株JLY60-1，通過ITS rDNA測序和同源序列檢索分析鑒定為Wickerhamiella versatilis，其最適生長溫度為30 ℃，在20%鹽濃度下培養15 d，發酵液中的4-EG濃度最高，達13.6 mg/L。在傳統醬油釀造過程中強化菌株JLY60-1，采用高效液相色譜法和離子遷移色譜法測定不同發酵醬醪中酚酸及揮發性風味組分的含量，結果表明，菌株JLY60-1可以高效轉化醬醪中的FA生成4-VG 和4-EG，發酵30 d的醬油中4-VG和4-EG含量分別達到16.5，30.5 mg/L，對照組含量分別為1.83，3.03 mg/L。同時，強化菌株JLY60-1還提高了醬油中醛類、酮類芳香化合物的含量，豐富了醬油香氣，對改善和提升醬油品質具有重要實用價值。

關鍵詞：醬油；阿魏酸；4-乙基愈創木酚；4-乙烯基愈創木酚；Wickerhamiella versatilis

中圖分類號：TS264.21????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0042-07

Screening of Guaiacol-Producing Strains and Their Application in Soy Sauce Brewing

Abstract： A yeast strain JLY60-1 that can convert ferulic acid （FA） into 4-vinylguaiacol （4-VG） and 4-ethylguaiacol （4-EG） is isolated from Japanese-style high-salt dilute fermented soy sauce mash. It is identified as Wickerhamiella versatilis by ITS rDNA sequencing and homologous sequence retrieval and analysis. The optimal growth temperature is 30 ℃， and when it is cultured at 20% salt concentration for 15 days， the concentration of 4-EG in the fermentation broth is the highest of 13.6 mg/L. In the traditional soy sauce brewing process， the strain JLY60-1 is strengthened. The content of phenolic acids and volatile flavor components in different fermented soy sauce mashes are determined by high-performance liquid chromatography and ion migration chromatography. The results show that the strain JLY60-1 could efficiently convert FA in soy sauce mash into 4-VG and 4-EG， and the content of 4-VG and 4-EG in soy sauce fermented for 30 days reaches 16.5，30.5 mg/L respectively， compared to?1.83，3.03 mg/L respectively in the control group. At the same time， the strengthened strain JLY60-1 also increases the content of aldehyde and ketone aromatic compounds in soy sauce， enriches the aroma of soy sauce， and has important practical value for improving the quality of soy sauce.

Key words： soy sauce; ferulic acid; 4-ethylguaiacol; 4-vinylguaiacol; Wickerhamiella versatilis

醬油是一種起源于中國的傳統調味品，其特有的咸鮮滋味和醬香味深受消費者喜愛[1]。醬油的鮮味主要來自原料蛋白酶解生成的游離氨基酸[2-4]，香氣主要來源于非酶催化和微生物代謝[5-6]。醬油中的特征性香氣化合物有4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）[7]、4-乙基愈創木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）[8]、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮[9]、苯乙醛[10]、3-甲硫基丙醇[11]、吡嗪類化合物等[12-13]。在這些特征香氣成分中，4-乙烯基愈創木酚（4-VG）、4-乙基愈創木酚（4-EG）等酚類物質是我國醬香型白酒的主要風味物質[14]，后來發現這些物質也是醬油風味的重要組成部分。4-VG 和4-EG呈發酵香氣，具有煙熏味、丁香味和辛香味，屬醬香型香氣，其作為醬油的關鍵風味成分，具有緩和咸味的作用，香氣很受消費者歡迎[15]，并且4-EG可以對抗異常氧化應激，具有保護細胞和抑制炎癥免疫反應的作用[16-17]。4-VG和4-EG的風味閾值低，微量4-VG和4-EG就可以明顯提高醬油的風味[18]。

本文從醬醪中分離出一株可以高效利用FA合成4-VG 和4-EG的酵母，經鑒定為Wickerhamiella versatilis（產4-乙基愈創木酚酵母），具有代謝酚類物質的能力[19]。W. versatilis主要存在于葡萄酒中[20]，很少有研究探討其在醬油中的作用，酚類物質是醬油醬香味的主要來源，雖然它們的含量不高，但是具有相對較高的氣味活度值，因此對醬油的風味特性（如濃郁的醬香香氣）具有決定性作用。因此，分離篩選能代謝合成4-EG的微生物、研究其生長特性以及應用于醬油發酵生產為豐富醬油香氣奠定了基礎，對醬油類產品品質提升有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

豆粕、炒麥、麥麩、米曲霉3.042的孢子粉、生醬油、醬醪：均由山東玉兔食品股份有限公司提供；食鹽（未加碘，氯化鈉）：購于市場；大豆蛋白胨、MRS肉湯：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸出物：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖：山東西王糖業有限公司；麥芽汁培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；阿魏酸（FA）、4-乙烯基愈創木酚（4-VG）、4-乙基愈創木酚（4-EG）：均為優級純，上海麥克林生化科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

7200型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；PB-10型pH計 德國賽多利斯集團； Diane Ultimate 3000型高效液相色譜儀（HPLC）、U3000型紫外檢測器 賽默飛世爾科技公司。

1.3 培養基

菌種初篩培養基：30%生醬油、20%麥芽汁、15% MRS肉湯、2%瓊脂、10%氯化鈉、0.01%氯霉素，pH為7.1；YPD培養基：大豆蛋白胨2%、酵母浸粉1%、葡萄糖2%；產4-EG菌種篩選培養基：YPD+0.01% FA；高鹽YPD培養基：YPD+10%氯化鈉。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的篩選

在無菌條件下將醬醪用10%的鹽水稀釋1倍制成懸浮液，再用10%的鹽水進行梯度稀釋后涂布于菌種初篩培養基平板，30 ℃培養24～48 h，挑取單菌落移接于高鹽YPD斜面，30 ℃培養24～48 h。將純化的菌株接種于產4-EG菌種篩選培養基中，在30 ℃、150 r/min條件下搖瓶培養72 h，然后測定發酵液中4-EG含量，篩選4-EG產量高的菌株。

1.4.2 菌株的鑒定

將菌株接種于YPD培養基中，在30 ℃、200 r/min條件下搖瓶培養24 h制備種子液，收集菌體，送樣測定ITS序列，測序結果通過NCBI數據庫進行序列同源性BLAST比對，然后下載比對相似度在99%以上的前10個菌種的DNA序列，并利用MEGA 11.0構建系統發育樹，進行1 000次Bootstrap檢驗，計算支持率。

1.4.3 菌株性能測試

將所篩選的菌株活化后接種到YPD培養基中，在不同溫度（25，30，35 ℃）條件下靜置培養24 h，測定培養液的菌體濃度（OD600 nm值），根據菌體濃度確定菌株的最佳生長溫度；在最佳生長溫度條件下，測定菌株在不同轉速下培養的生長情況，確定氧對菌株生長的影響；配制不同鹽濃度（0%、5%、10%、15%、20%）的YPD培養基，在最適條件下培養，測定菌株的生長情況，考察菌株對鹽濃度的耐受性。

1.4.4 高鹽濃度下菌株轉化FA進程

將所篩選的菌株活化培養成種子液，接種至不同鹽濃度（10%、15%、20%）的YPD+FA培養基中，初始FA濃度為100 mg/L。在30 ℃、100 r/min條件下培養，分析培養5，10，15 d的發酵液中FA、4-VG、4-EG含量。

1.4.5 菌株在醬油發酵中的應用

1.4.5.1 制曲

將豆粕和炒麥按質量比4∶6充分拌勻，用1.1倍的水浸泡20 min，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻至室溫。按原料質量（混合后總質量）接入質量分數為0.3%的米曲霉3.042孢子粉，混合均勻，在30 ℃生化培養箱中培養，適時翻曲，培養30 h左右，至曲料表面剛開始出現黃綠色孢子時結束培養。

1.4.5.2 醬油發酵

將成曲與含18% NaCl的溶液按體積比1∶2混合，其中實驗組接種5%的產4-EG菌株種子液（在30 ℃、200 r/min條件下搖瓶培養24 h制備種子液），對照組加入5%的YPD培養基，于30 ℃發酵，在制作曲料和醬醪發酵過程中保持無菌操作，確保實驗結果的準確性。發酵過程中每天8 h以120 r/min培養，16 h靜置培養，取發酵0，5，10，15，30 d的樣品，測定醬油發酵液中FA、4-VG、4-EG含量，選取發酵15 d和30 d的樣品測定揮發性風味物質，并對發酵結束時的醬油進行感官品評。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度的測定

將菌體培養液適當稀釋，用UNICO 7200型紫外可見分光光度計測定600 nm處的吸光度。

1.5.2 酚酸的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定發酵液中FA、4-VG和4-EG含量。色譜條件：色譜柱為AcclaimTM Polar Advantage Ⅱ （PA2） C18柱（4.6 mm×100 mm），流動相為甲醇和1% 甲酸，梯度洗脫，載體流速為1 mL/min，紫外檢測器：柱溫30 ℃；進樣量20 μL，用外標法測定樣品濃度。樣品處理：發酵液離心后取上清液于離心杯中，加入乙酸乙酯混合均勻，將混合液于渦旋器上振蕩2 min，振蕩結束后于離心機中以4 000 r/min離心3 min，吸取上層有機相于試管中隔水加熱，將乙酸乙酯蒸發干凈后向試管中加入甲醇溶液，用甲醇將試管底部的物質復溶后，用有機濾膜過濾，將過濾后的濾液放入液相小瓶中，使用色譜儀測定物質含量[11]。標準曲線的繪制：取色譜純FA、4-VG、4-EG溶于甲醇配制的質量濃度為100 mg/L的混合標準溶液中，依次稀釋為20，40，60，80，100 mg/L，以甲醇為空白對照，用HPLC測定標準液后使用外標法測定樣品濃度，以標準溶液質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線[21]。

1.5.3 揮發性風味物質的測定

GC-IMS分析：在FlavourSpecGC-IMS設備（G.A.S. Dortmund，Germany）上進行。首先，取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵育15 min后進樣500 μL。隨后，在85 ℃下將500 μL樣品用氮氣（純度99.999%）泵入加熱的進樣器。揮發性化合物首先通過MXT-5毛細管柱分離（15 m×0.53 mm）。載氣的初始流速為2 mL/min，持續2 min，隨后在18 min內增加到100 mL/min[22]。揮發性化合物的保留指數（RI）以C4～C9的n-酮為外部參考進行計算。將RI和漂移時間與GC-IMS NIST 11庫中的數據進行比較，鑒定出揮發性化合物，化合物根據峰值強度進行定量。

1.5.4 感官評價

選取7位接受過系統培訓的品評員對滅菌的醬油發酵液進行盲評，口感方面分別從鮮味、酸味、甜味、苦味、厚味、煙熏味、綜合口感、偏愛程度8個維度對樣品進行評分[23]；香氣方面分別從花果香、醇香、醬香、焦香、麥芽香、大豆香、綜合香氣、偏愛程度8個維度對樣品進行評分。評分方法：每個維度滿分為10分，感官強度大則得分高；每位品評員對每組樣品盲評3次，時間間隔30 min，計算平均分，各維度得分為7位品評員3次評分的算術平均數[24]。

1.6 數據處理

每個實驗均設置3次平行，實驗數據使用SPSS 2018和Origin 2019處理。

2 結果與分析

2.1 產4-VG和4-EG菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的篩選

將醬醪樣品進行多次稀釋涂布培養和劃線分離，根據菌落生長情況獲得8株耐高鹽的酵母，編號為JQY-1、JQY-2、JQY-3、JQY-4、JQY-5、JLY30-1、JLY30-2、JLY60-1。將初篩分離的8種菌株接到YPD+FA培養基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養120 h，以不接種的發酵液為對照，用HPLC檢測發酵樣品中FA和4-VG、4-EG含量，檢測結果見表1。

由表1可知，JQY-5、JLY30-1、JLY30-2、JLY60-1菌株均可利用發酵培養基中的FA產生4-VG、4-EG，其中菌株JLY60-1產4-EG能力最強，該菌株發酵產物的4-VG含量可達7.62 mg/L，4-EG含量可達15.49 mg/L，選取該菌株進一步研究。

2.1.2 菌株JLY60-1的鑒定

菌株JLY60-1經生理鹽水稀釋后涂布在YPD平板上，30 ℃培養48 h，觀察菌落形態。

由圖1可知，菌落初期為乳白色，成熟期為淡黃色，不透明，形狀規則，中央隆起，邊緣整齊；在顯微鏡下觀察顯微形態，菌體為球狀或橢球狀，出芽生殖。

將測序菌株的ITS核苷酸序列提交到NCBI數據庫用BLAST程序進行同源性比對，結果顯示：菌株ITS核苷酸序列與Wickerhamiella versatilis菌株（典型的耐高鹽產香菌株）同源度最高，為99.81%。經多序列同源性分析，得到10個同源性大于99.12%的菌株，用MEGA 11軟件構建系統發育樹，獲得菌株的系統發育地位，系統進化樹見圖2。

由圖2可知，菌株JLY60-1與Wickerhamiella versatilis屬于同一分支。綜合該菌株的形態特征和生化特性，初步確定該菌株為Wickerhamiella versatilis（產4-乙基愈創木酚酵母）。

2.2 菌株JLY60-1培養特性研究

2.2.1 溫度對菌株JLY60-1生長的影響

菌株 JLY60-1在不同溫度下的生長情況見圖3。

由圖3可知，在25 ℃條件下菌體生長緩慢，在30 ℃時菌體濃度最高，在35 ℃條件下幾乎不生長，說明菌株JLY60-1的溫度耐受范圍較窄，不適合高溫發酵。篩選的W.versatilis JLY60-1菌株最佳生長溫度為30 ℃，而大多數醬油都是在中低溫條件下發酵的，如日式醬油和我國的高鹽稀態醬油的發酵溫度均為30 ℃，傳統的日曬夜露和澆淋工藝發酵醬油的平均溫度也在20 ℃左右，因此，將W. versatilis JLY60-1作為產香菌株添加到醬油中能很好地發揮作用。

2.2.2 菌株JLY60-1好氧情況

將菌株接種到液體YPD培養基中，分別置于不同轉速的搖床上在30 ℃下培養24 d，測定菌體濃度，結果見圖4。

由圖4可知，搖床轉速越高，菌體濃度越大，由此可知菌株JLY60-1為偏好氧酵母。因為醬油發酵長時間處于微氧狀態，因此觀察了菌株JLY60-1在低氧條件下延長培養時間的生長情況，結果見圖5。

由圖5可知，在低氧條件下菌株仍能較好生長，并且隨著發酵時間的延長，發酵液的菌體濃度逐漸增加，在靜置的條件下發酵7 d，發酵液的菌體濃度可達14.3。由此可知，菌株JLY60-1能適應醬醪的低氧環境，為其作為產香酵母添加到醬油中應用提供了可能。

2.2.3 鹽濃度對菌株JLY60-1生長的影響

醬油釀造所需的高鹽濃度影響微生物的生長和繁殖，能在這種環境下生存的微生物必須具有一定的耐鹽特性。因此，對菌株JLY60-1的耐鹽性進行了分析，見圖6。

由圖6可知，在相同培養條件下，隨著培養基鹽濃度的增加，菌株JLY60-1的生長雖然受到抑制，但是在20%的高鹽濃度下菌株仍能緩慢生長。由此可知，菌株JLY60-1能耐受醬油的高鹽環境。

2.3 鹽濃度對菌株JLY60-1轉化FA的影響

為確定高鹽環境對菌株轉化FA的影響，將菌株JLY60-1接種到不同鹽濃度的培養基中，在低溶氧條件下分別發酵5，10，15 d，測定發酵液中FA、4-VG和4-EG的含量。測定了醬油醪液中FA含量約為90 mg/L，因此，將培養基中FA的初始濃度定為100 mg/L。

由表2可知，在發酵過程中FA濃度逐漸下降，4-VG和4-EG濃度逐漸升高；在10%鹽濃度的發酵液中FA的轉化速度最快，發酵15 d時FA濃度降至39.73 mg/L，轉化率為60.63%；隨著鹽濃度升高，菌體生長受到抑制，轉化速度相應變慢，在20%鹽濃度下，發酵15 d 時FA濃度降至55.76 mg/L，轉化率仍能達到44.24%；4-VG含量為7.90 mg/L，4-EG含量為12.82 mg/L。由此可知，菌株JLY60-1可以適應高鹽條件，在高鹽培養基中發酵可以轉化FA生成4-VG和4-EG。

2.4 菌株JLY60-1在醬油發酵中的應用

為確定菌株W.versatilis JLY60-1在醬油發酵中的影響，將菌株接種到醬油發酵液中與米曲霉共同培養，模擬醬油發酵過程，為了減少染菌的概率，采用間斷搖床培養的方式來加速醬油發酵過程，縮短發酵時間，在發酵過程中定時取樣分析醪液中的FA、4-VG、4-EG含量，用GC-IMS分析揮發物成分，并對發酵結束后的醬油進行感官品評。

2.4.1 強化菌株JLY60-1對醬醪中4-VG 和4-EG含量的影響

由圖7可知，醬油中初始FA含量為90 mg/L，隨著發酵時間的延長，對照組和實驗組FA含量越來越低，4-VG和4-EG含量越來越高。在發酵30 d時，實驗組FA含量為1.37 mg/L，4-VG含量為16.5 mg/L，4-EG含量為30.5 mg/L，而對照組FA含量為63.41 mg/L，4-VG含量為1.83 mg/L，4-EG含量為3.03 mg/L，由發酵結果可知，菌株JLY60-1能夠在醬油發酵液中生長并且能高效轉化FA生成4-VG和4-EG。添加菌株JLY60-1能顯著增加醬油醬醪中的4-VG和4-EG含量。

2.4.2 添加菌株JLY60-1對醬醪揮發性物質的影響

采用GC-IMS分析了實驗組（強化菌株JLY60-1）和對照組醬油發酵15 d和30 d的揮發性物質組成。

由圖8可知，對照組和實驗組主要揮發性成分組成有明顯區別，并且隨著發酵時間的延長，每組樣品揮發性成分組成變化也比較顯著，在發酵15 d時含量較高的組分到發酵30 d時含量顯著下降甚至消失，同時有較多的成分生成，說明在醬油發酵過程中其揮發性成分是變化的。各組主要揮發性化合物含量見表3。

由表3可知，發酵15 d的對照組中物質含量較多的主要是酯類和醇類，如乙酸異戊酯、乙酸乙酯、3-甲基丁烷-1-醇、2-甲基-3-呋喃硫醇，發酵15 d的實驗組中含量較多的主要是醇類和酮類，如3-甲基丁烷-1-醇、2，3-丁二醇、苯乙醛、辛醛、2，3-丁二酮，除實驗組的酸類含量低于對照組外，其余物質含量均高于對照組；隨著發酵時間的延長，兩組醬油中含量較多的物質逐漸發生變化，發酵30 d的對照組中酸類和醛類物質含量顯著增多，醇類物質含量減少，其中含量較多的主要是酸類物質，如2-甲基丁酸、3-甲基丁酸，發酵30 d的實驗組中酸類和醛類物質含量顯著增多，成為含量較多的兩種物質，醇類物質含量減少，除實驗組的醇類含量低于對照組外，其余物質含量均高于對照組；由實驗數據可以說明菌株JLY60-1的添加能顯著提高醬油中各種揮發性風味物質的含量，其中酸類、醛類及酮類物質含量增加較多，醛類和酮類物質含量的增加有助于增加醬油的醬香及醇香，對醬油的風味有極大提升作用。

2.4.3 菌株對醬油感官的影響

對兩組醬油的味道和香氣特征進行評分，結果見圖9。

由圖9可知，在口感方面，實驗組的鮮味、煙熏味、酸味和厚味高于對照組，綜合口感和偏愛程度也優于對照組；在香氣方面，實驗組的花果香、焦香、醇香、醬香、麥芽香、綜合香氣和偏愛程度高于對照組。高鹽稀態醬油本身具有酸味、焦糖味、土豆味，還有微弱的水果味和甜味[13，15]，在添加W. versatilis JLY60-1菌株后可以提升成品醬油的醇香、花果香和焦香；同時能夠提升鑒評人員的偏好程度和醬油的品質，這與最近報道的添加W.versatilis或其他產香酵母[25]可以改善醬油感官質量的研究結果一致，說明W.versatilis JLY60-1菌株在醬油風味和口感的改善方面有較大的應用前景，對于滿足消費者需求具有重要意義。

3 結論

本研究從日式高鹽稀態醬油的醬醪中分離篩選到一株能夠將FA轉化成4-VG和4-EG的酵母菌株，經形態觀察及ITS序列分析等方法判斷該菌株為Wickerhamiella versatilis（產4-乙基愈創木酚酵母）。經驗證，W.versatilis JLY60-1菌株能在20%鹽濃度以及低氧醬油釀造環境下有效轉化醬醪中的FA，生成4-VG和4-EG。在醬油釀造過程中強化菌株JLY60-1，在發酵30 d時，醬油發酵液中4-VG含量為16.5 mg/L，對照組4-VG含量為1.83 mg/L，4-VG含量提高了約8倍；醬油發酵液中4-EG含量為30.5 mg/L，對照組4-EG含量為3.03 mg/L，4-EG含量提高了約9倍，同時增加了醬油中醛類和酮類揮發性風味物質的含量，對提升醬油品質具有重要的實用價值，是一株具有工業應用潛力的優良菌株。在醬油實際生產中強化該菌以提高產品的4-VG和4-EG含量，改善醬油的香氣，提升醬油的品質。

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