高產色素低產桔青霉素紅曲霉菌篩選及發酵工藝優化研究

殷倩倩 左勇

摘要：該研究通過擴大菌株分離源，選育優質紅曲霉菌M7-5。以該菌株為發酵菌株，采用單因素試驗研究大米糊化水量、發酵溫度、碳源種類及添加量、氮源種類及添加量對紅曲發酵色價及桔青霉素含量的影響，在此基礎上，利用響應面試驗優化最佳控制參數。結果表明，紅曲最佳發酵條件為大米糊化水量13%、甘油添加量8%、硝酸鈉添加量1.85%，在此條件下，色價與桔青霉素含量的比值（p/c值）達到22 158.2。該研究可為傳統紅曲發酵工藝的改進和工業化應用提供參考。

關鍵詞：紅曲；發酵工藝；色價；桔青霉素；響應面

中圖分類號：TS202.3????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0062-07

Study on Screening and Fermentation Process Optimization of Monascus?with High-Yield Pigment and Low-Yield Citrinin

Abstract： In this study， high-quality Monascus M7-5 is selected by expanding the source of strain isolation. Using this strain as the fermentation strain， the effects of rice gelatinization water amount， fermentation temperature， carbon source type and addition amount， nitrogen source type and addition amount on the color value of Monascus fermentation and citrinin content are studied by single factor test. On this basis， response surface test is used to optimize the optimal control parameters. The results show that the optimum fermentation conditions of Monascus are as follows： the rice gelatinization water amount is 13%， glycerin addition amount is 8% and sodium nitrate addition amount is 1.85%. Under these conditions， the ratio of color value to citrinin content （p/c value） reaches 22 158.2.This study can provide references for the improvement of traditional Monascus fermentation process and industrial application.

Key words： Monascus; fermentation process; color value; citrinin; response surface

傳統紅曲是由紅曲霉菌以大米為基質發酵而成，屬于藥食兩用產品。紅曲色素是從發酵完成的紅曲米中提取的一種天然色素，營養價值高，現代藥理學研究證實紅曲色素具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[1]，在釀酒、制醋、食品防腐、食品添加劑、醫藥等方面有著廣泛的應用[2]。然而紅曲霉菌代謝產生色素的同時，也會產生桔青霉素，對哺乳動物的肝臟和腎臟都具有一定的生殖毒性，給紅曲類制品帶來食品質量安全風險[3]。

隨著紅曲色素的推廣應用，其產量常常供不應求，提高色素產量、降低桔青霉素含量成為亟待解決的問題。紅曲色素的生產工藝分為液態和固態兩種：液態發酵工藝雖操作簡單，但紅曲色素產量低；固態發酵工藝紅曲色素產量高，但桔青霉素污染嚴重，產品質量不穩定[4]。目前大多數紅曲霉菌株產紅曲色素能力較低，且發酵性能不穩定。因此，選育高產色素、低產桔青霉素的菌株并研究其發酵條件，對獲得高品質、高產量的紅曲顯得尤為重要。

本研究通過篩選高產色素、低產桔青霉素的紅曲霉菌，采用單因素試驗探究大米糊化水量、制曲溫度、外加碳源種類及添加量、外加氮源種類及添加量對紅曲色素產量和桔青霉素含量的影響，以色價與桔青霉素含量的比值（p/c值）為響應值，通過響應面法優化發酵工藝，以獲得紅曲霉菌高產色素、低產桔青霉素的最佳工藝條件，為高品質紅曲制品的工業化、規?；?、可控化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

菌株分離源：紅曲米、紅曲粉、紅曲米酒、瀘州老窖酒曲；商業菌株紅色紅曲霉菌、紫色紅曲霉菌：由實驗室購買并保藏；大米：購于成都恩圖吉家市場。

1.1.2 培養基

PDA固體/斜面培養基：馬鈴薯200 g，加1 000 mL蒸餾水，煮沸1 h，過濾，補水至1 000 mL，加瓊脂2%，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養基：麥芽浸粉13.1 g，水100 mL，121 ℃下滅菌15 min。

固體培養基：大米清洗后，浸泡2 h，瀝干水分，根據后續試驗調整水分含量，取20 g分裝入250 mL錐形瓶中，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

麥芽浸粉、2×Rapid Taq Master Mix：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；桔青霉素標準品：上海源葉生物科技有限公司；磷酸、乳酸（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；HLB固相萃取小柱：納譜分析技術（蘇州）有限公司。

1.1.4 主要儀器設備

Agilent 1200高效液相色譜儀（配熒光檢測器） 美國安捷倫科技有限公司；GI54DW高壓滅菌鍋 南京庚辰科學儀器有限公司；HZQ-F160恒溫振蕩培養箱 上海坤誠科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；多樣品快速平行濃縮儀 東京理化器械株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉菌分離純化

從紅曲霉菌分離源樣品中，取適量紅曲米經研缽研碎后，轉至盛有適量生理鹽水的錐形瓶中，經搖床30 ℃，160 r/min培養2 d后進行梯度稀釋。接種100 μL上述梯度稀釋液，涂布于固體培養基上，在30 ℃下培養3 d，挑取符合紅曲霉微生物學特征的菌株再次進行分離純化，將純化3次后得到的較純菌株進行編號和甘油管藏。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 菌落形態觀察

采用點種法將純化得到的單菌落接種于PDA固體培養基上，在30 ℃下培養5 d，觀察并記錄菌落形態。

1.2.2.2 菌株顯微形態觀察

取適量種子液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，制成臨時裝片，進行顯微形態觀察。

1.2.2.3 分子生物學鑒定

采用CTAB法提取紅曲霉菌總DNA，通過真菌通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證并送去測序。測序結果在NCBI上利用BLAST程序進行比對，通過MEGA 10.0軟件構建系統發育樹[5]。

1.2.3 紅曲發酵指標檢測方法

紅曲色價的測定參考 GB 1886.19－2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》；桔青霉素含量的測定參考GB 5009.222－2016《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》第二法C18固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法以及彭碧寧等[6]的方法，部分步驟有所改動。

樣品提?。壕芊Q取樣品粉末（1.00±0.05） g，置于具塞離心管中，加入甲醇-水（70∶30）5 mL，振搖提取30 min，8 000 r/min離心5 min，殘渣中加入5 mL甲醇-水（70∶30），振搖提取30 min，8 000 r/min離心5 min，合并上清液。加純水稀釋至15 mL，振搖1 min，靜置2 min，再振搖1 min，靜置3 min，用微纖維濾紙過濾，即得提取液。樣品經過凈化后，轉移至平行濃縮儀中，50 ℃真空濃縮至1 mL后，經0.22 μm微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），美國安捷倫公司；熒光檢測器：檢測波長為λex=331 nm，λem=500 nm；柱溫28 ℃；流動相A為磷酸水溶液（pH為2.5），流動相B為乙腈，流動相A∶流動相B為33∶67；洗脫條件：流速1 mL/min；進樣量20 μL。

1.2.4 紅曲菌株固態發酵初篩

1.2.4.1 紅曲發酵流程[7]

紅曲發酵流程見圖1。

1.2.4.2 紅曲發酵初篩

將分離得到的紅曲霉菌株在PDA斜面上培養4 d后，用無菌生理鹽水洗下紅曲霉孢子，制成孢子懸浮液，按照10%的接種量接種到已滅菌的固體培養基中，30 ℃靜置培養24 h后將紅曲米搖散，此后每隔24 h進行一次振蕩搖瓶，直到發酵結束[8]。

1.2.5 紅曲菌株固態發酵復篩

選取4種不同類型的大米，以p/c值為指標對初篩菌株進行固態發酵復篩[9]。

1.2.6 固態發酵單因素試驗

以紅曲色素含量和桔青霉素含量為指標，采用一系列單因素試驗研究大米糊化水量、發酵溫度、外加碳源種類及添加量、外加氮源種類及添加量對紅曲固態發酵的影響。試驗水平分別選取大米糊化水量5%、15%、25%、35%、45%；發酵溫度28，30，32 ℃，前3 d 30 ℃，后期28 ℃；前3 d 30 ℃，后期26 ℃；外加碳源種類葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘油、乙醇；甘油添加量1%、3%、5%、7%、9%；外加氮源種類谷氨酸、麩皮、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉；硝酸鈉添加量0.5%、1.25%、2%、2.75%、3.5%、4.25%。

1.2.7 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取甘油添加量（A）、硝酸鈉添加量（B）、大米糊化水量（C）3個因素進行三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計，以p/c值作為考核指標進行試驗，響應面試驗因素水平見表1[10-11]。

1.2.8 數據處理

繪圖采用Origin 2021，響應面試驗設計及分析采用Design Expert 10.0.1，顯著性分析采用IBM SPSS 20，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選

2.1.1 菌株分離

從篩菌分離源中共分離出42株菌株，部分菌株的菌落形態見圖2。對菌株進行鏡檢，見圖3。發現它們的形態呈閉囊殼，生于菌絲頂端，部分被菌絲包裹，符合紅曲霉菌的特性[12]。

2.1.2 菌種初篩

以實驗室保藏的兩株商業菌株紫色紅曲霉菌、紅色紅曲霉菌為對照，對分離菌株進行發酵指標的初篩，菌株初篩結果見表2。分離菌株中有15株菌株的色素產量高于商業菌株，其中有5株桔青霉素含量低于商業菌株。因此，選擇M3-2、M6-3、M7-3、M7-5、M9-2 5株菌株進行后續復篩。

2.1.3 菌種復篩

選取4種常用于紅曲發酵的大米為發酵基質，檢測發酵結束后固態紅曲米中色素、桔青霉素含量。不同類型大米編號見表3。5株菌株復篩后色價和桔青霉素含量見圖4和圖5。 M7-5菌株以編號為“T”的泰香軟米為發酵基質時，色素產量達到2 656 U/g，在高產色素的同時，桔青霉素的含量也較低，因此選擇M7-5菌株進行后續研究。

2.1.4 菌種鑒定

以ITS1、ITS4為引物，對菌株M7-5進行ITS區域序列擴增，擴增產物送去測序，測序結果在NCBI核酸數據庫中比對，結合菌落形態、顏色、生理生化數據，將M7-5菌株鑒定為紅色紅曲霉菌，系統發育樹見圖6。

2.2 紅曲固態發酵單因素試驗

2.2.1 大米糊化水量對紅曲固態發酵的影響

基質含水量是影響大米糊化度和紅曲霉菌生長的重要因素[13-14]。含水量少，大米糊化度太低，會導致米粒內部化學物質反應不充分，大米過硬，紅曲霉對其利用較少；但水分太多，糊化度過高，會導致大米黏結，不適合紅曲霉菌著床生長。通過前期糊化度分級試驗，以不額外加水的試驗組為對照，選擇加水量5%、15%、25%、35%、45%進行試驗。加水量45%試驗組發酵效果差，色素含量遠低于500 U/g，因此圖中未展示。

由圖7可知，隨著大米糊化水量的增加，紅曲發酵產物中色素含量先增加后減少，桔青霉素含量先減少后增加。當大米糊化水量為15%時，色素含量達到最高，為3 279.1 U/g，桔青霉素含量最低，僅為0.91 μg/g，此時p/c值達到最高。因此，選取15%的糊化水量作為M7-5菌株固態發酵的最適糊化度。

2.2.2 發酵溫度對紅曲固態發酵的影響

相關研究報道，桔青霉素的合成時間稍晚于色素的合成時間[15]，采取變溫發酵的策略可以在保證色素產量的同時，有效降低桔青霉素的含量。

由圖8可知，溫度在28～32 ℃區間內，隨著溫度的上升，紅曲發酵產物的色素含量和桔青霉素含量也逐漸增加，當溫度設置為前3 d培養溫度為30 ℃、后8 d培養溫度為28 ℃時，紅曲發酵色素含量較高，為3 320.8 U/g，桔青霉素含量最低，為0.69 μg/g，此時p/c值達到最高，當降低紅曲后期發酵溫度為26 ℃時，其p/c值明顯下降。因此，選取前期30 ℃、后期28 ℃作為M7-5菌株固態發酵的最適發酵溫度。

2.2.3 外加碳源對紅曲固態發酵的影響

不同種類的碳源會影響紅曲霉菌代謝產物的產量。由圖9可知，添加乙醇的試驗組中，色素含量低于對照組，桔青霉素含量高于對照組，說明乙醇不適合作為M7-5菌株固態發酵的外加碳源；添加葡萄糖、麥芽糖、乳糖的試驗組中，色素含量均高于對照組，桔青霉素含量也高于對照組，說明三者不適合作為M7-5菌株固態發酵的外加碳源。在添加甘油的試驗組中，色素含量較高，為3 291.7 U/g，桔青霉素含量最低，為0.49 μg/g，p/c值達到最高，選取其作為M7-5菌株固態發酵的最適外加碳源。

2.2.4 碳源添加量對紅曲固態發酵的影響

由圖10可知，隨著甘油質量濃度的逐漸增加，紅曲色素含量變化較小，呈現先增加后減少的趨勢，桔青霉素含量呈現先減少后增加的趨勢，在甘油添加量為7%時達到最低，為0.41 μg/g。在甘油添加量為總發酵質量的7%時，紅曲色素含量較高，桔青霉素含量最低，此時p/c值達到最高，選取其作為M7-5菌株固態發酵的最適碳源添加量。

2.2.5 外加氮源對紅曲固態發酵的影響

不同種類的氮源會影響紅曲霉菌的生長，進而影響代謝產物的產量。由圖11可知，添加酵母粉的試驗組中，色素含量低于對照組，桔青霉素含量高于對照組，說明酵母粉不適合作為M7-5菌株固態發酵的外加氮源；添加麩皮和蛋白胨的試驗組中，色素含量高于對照組，桔青霉素含量也高于對照組，說明兩者不適合作為M7-5菌株固態發酵的外加氮源；添加谷氨酸和硝酸鈉的試驗組中，色素含量均高于對照組，桔青霉素含量均較低，無顯著性差異，其中添加硝酸鈉的試驗組，紅曲色素含量為2 766.7 U/g，桔青霉素含量最低，為0.35 μg/g，此時p/c值達到最高，選取其作為M7-5菌株固態發酵的最適外加氮源。

2.2.6 氮源添加量對紅曲固態發酵的影響

由圖12可知，隨著硝酸鈉添加量的逐漸增加，紅曲色素含量總體呈現先增加后減少的趨勢，桔青霉素含量總體呈現先減少后增加的趨勢。硝酸鈉添加量為2%時，紅曲發酵產物的p/c值達到最高，此時桔青霉素含量最低，選取其作為M7-5菌株固態發酵的最適氮源添加量。

2.3 紅曲固態發酵響應面分析

基于單因素試驗的數據，選取甘油添加量（A）、硝酸鈉添加量（B）、大米糊化水量（C）3個因素進行三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計，以p/c值作為考核指標進行試驗，應用Design-Expert 10.0.1軟件對試驗數據進行分析，Box-Behnken響應面設計及試驗結果見表4，回歸模型方差分析見表5[16-17]。

根據響應面試驗結果，得到紅曲質量指標p/c值對A（碳源添加量）、B（氮源添加量）、C（大米糊化水量）的多元回歸方程：Y=21 403.51+1 994.35A+667.03B－2 587.76C－1 581.55AB－2 054.57AC+1 312.79BC－3 561.97A2－4 773.14B2－3 719.32C2。

由表4可知，模型的F=103.22，P<0.000 1，表明試驗所采用的二次模型極顯著，在統計學上有意義。本試驗失擬項的P值為0.682 4（P>0.05），表明該試驗回歸模型的擬合程度良好。通過3個因素的F值可知，影響紅曲發酵指標p/c值的因素主次順序為C（大米糊化水量）>A（碳源添加量）>B（氮源添加量），在回歸模型方程二次項中A2、B2、C2均極顯著（P<0.01），交互項中AB、BC均極顯著（P<0.01），AC顯著（P<0.05）。

根據Design-Expert 10.0.1軟件獲得了大米糊化水量、碳源添加量、氮源添加量3個因素的交互作用對紅曲發酵指標p/c值影響的響應面圖和等高線圖，見圖13～圖15。通過回歸模型的預測，得到高產色素低產桔青霉素的紅曲發酵最佳工藝條件為碳源添加量7.97%、氮源添加量1.85%、大米糊化水量13.24%，在該條件下紅曲發酵p/c值預測值為22 264.4。

2.4 最佳工藝條件驗證試驗

考慮實際操作情況，將響應因素調整為甘油添加量8%、硝酸鈉添加量1.85%、糊化水量13%，其他條件不變，進行3組平行試驗。色價和桔青霉素含量分別為2 769.78 U/g和0.125 μg/g，p/c值為22 158.2，相對誤差為0.47%。因此，通過響應面法優化得到的紅曲發酵工藝回歸模型符合實際。

3 結論

本研究篩選出優質紅曲霉菌株，并利用單因素試驗和響應面法優化紅曲發酵工藝條件，其發酵最佳條件為甘油添加量8%、硝酸鈉添加量1.85%、大米糊化水量13%，在此條件下，紅曲發酵的p/c值最高，色價和桔青霉素含量分別為2 769.78 U/g和0.125 μg/g，p/c值為22 158.2，相對誤差為0.47%，色素產量顯著超過1 000 U/g的標準，桔青霉素的含量較低。本研究結果可為紅曲發酵的進一步工業化應用提供借鑒。

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