低共熔溶劑輔助酶法高效合成香草酸的工藝研究

許令俠 梁喆 孫建中 朱道辰

摘要：針對化學合成香草酸會造成環境污染、活性低，從植物中提取香草酸產量低、生產成本過高等問題，采用來源于Bacillus ligniniphilus L1的香草醛脫氫酶進行香草酸的生物轉化。為了更好地提高酶促反應效率，在反應體系中添加適量的低共熔溶劑（DES，氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3）可以有效提升酶活并使其保持較高的穩定性。隨即考察了反應溫度、反應pH、反應時間和DES添加量對香草酸轉化率的影響，并通過響應面實驗進行工藝研究，得到最佳的轉化工藝參數為反應溫度36 ℃、反應pH 6.8、DES添加量17%，在此條件下香草酸的轉化率達到84.57%，與未添加DES相比，轉化率提升了37.98%。采用DES輔助酶法進行香草酸的生物轉化，可以有效地提升香草醛脫氫酶的酶活和香草酸的轉化率，制備過程綠色、安全、經濟，符合香草酸綠色工業化生產的要求。

關鍵詞：香草酸；低共熔溶劑；香草醛脫氫酶；生物轉化；響應面優化

中圖分類號：TS201.1????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0178-08

Study on Process of Efficient Synthesis of Vanillic Acid Using Deep Eutectic Solvent-Assisted Enzymatic Method

Abstract： In response to the issues of environmental contamination and low activity caused by chemical synthesis of vanillic acid， as well as the low yield and high production cost of extracting vanillic acid from plants， vanillin dehydrogenase derived from Bacillus ligniniphilus L1 is used for the biotransformation of vanillic acid. In order to better improve the efficiency of enzymatic catalysis reaction， adding an appropriate amount of deep eutectic solvent （DES， choline chloride∶1，4-butanediol is 1∶3） into the reaction system can effectively improve the enzyme activity and make it maintain high stability， and then the effects of reaction temperature， reaction pH， reaction time and the addition amount of DES on the conversion rate of vanillic acid are investigated. Response surface experiment is applied to study the process， and the optimal transformation process parameters are determined as follows： reaction temperature is 36 ℃， reaction pH is 6.8 and DES addition amount is 17%. Under these conditions， the conversion rate of vanillic acid reaches 84.57%， which is 37.98% higher than that of vanillic acid without adding DES. The use of DES-assisted enzymatic method for the biotransformation of vanillic acid can effectively improve the enzyme activity of vanillin dehydrogenase and the conversion rate of vanillic acid. The preparation process is green， safe and economical， which meets the requirements for green industrial production of vanillic acid.

Key words： vanillic acid； deep eutectic solvent； vanillin dehydrogenase； biotransformation； response surface optimization

香草酸，別名4-羥基-3-甲氧基苯甲酸，作為一種高檔香料，在食品和化妝品領域被廣泛應用，屬于肉桂酸類衍生物，廣泛存在于香蘭豆科植物中[1]。其除了具有較高的經濟價值外，還具有較廣泛的醫學用途，例如抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、化感作用、調節神經和促凝血活性等作用[2-5]。目前香草酸的獲得方式主要有兩種：一種是工業合成香草酸，主要通過堿性條件下裂解香草醛來獲得；另一種是從天然植物中進行提取。前者產量高、活性低，會給環境造成嚴重負擔，后者產量低、活性高，但是存在植物原料嚴重不足的問題[6-7]。國內外對醫藥、食品行業原料來源以及生產過程的要求越來越嚴苛，例如香草酸的前體物質香草醛，只有生物來源或者通過生物途徑合成的香草醛才可以被用于食品、化妝品以及藥品領域[8]。生物合成香草酸的途徑主要有兩種：一種是以香草酸的前體物質為底物，通過微生物進行轉化；另一種是通過酶催化合成[9]。由于香草酸及其前體物質多為芳香族化合物，過量的芳香族化合物會對參與轉化的細胞宿主產生毒性，從而抑制香草酸的合成，在工業上很難通過微生物途徑實現香草酸的大批量生產。酶催化合成香草酸具有專一性強、轉化效率高、轉化過程綠色清潔等優勢，因此成為眾多香草酸生產方式中的最佳選擇之一。

低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）是繼離子液體（ionic liquid，IL）之后的新一代綠色溶劑，是一種由氫鍵供體（HBA）和氫鍵受體（HBD）按照特定摩爾比例和條件混合形成的均相透明液體，具有無毒、低揮發、不易燃、易保存、可定向設計等優點，被廣泛應用于食品和化工領域[10-11]。關于DES的研究主要集中于植物中天然產物的分離提取以及生物質秸稈中纖維素、半纖維素、木質素的三素分離[12-15]。近年來也有研究表明DES與一些生物材料（酶、微生物細胞）表現出了較好的生物相容性，并且被證明在提升全細胞催化和酶催化效率方面具有積極意義[16-19]。例如在對黃酮苷的生物轉化過程中，徐萬軍[20]選擇DES作為酶促反應溶劑，使得β-葡萄糖苷酶活性提高，黃酮苷轉化率達到96.63%。Lindberg等[21]研究發現，DES可以改變酶本身的Km值，進而影響整個酶促反應。也有研究報道DES可以提高底物和中間產物在緩沖溶液中的溶解能力，進而提升酶促反應的轉化效率[22]。這預示著DES作為助溶劑或者助催劑在生物催化領域具有廣闊的應用前景。

本課題組長期從事生物質資源轉化及利用的研究，從南海海底泥土中篩選出1株對木質素具有高效降解能力的菌株Bacillus ligniniphilus L1，在闡明香草酸代謝途徑的基礎上，挖掘出香草醛向香草酸轉化的關鍵基因，并通過基因敲除和大腸桿菌中異源表達驗證了其功能[23-24]。本研究在此基礎上篩選出最佳的DES，并優化反應條件，以期獲得從香草醛到香草酸的最佳轉化效率，為香草酸的生物催化合成提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

香草醛、香草酸、氯化膽堿、尿素、1，4-丁二醇、甘油、蘋果酸、乳酸、蔗糖、果糖、葡萄糖：上海麥克林生化科技股份有限公司；乙腈、磷酸、IPTG、硫酸卡那霉素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 實驗菌株和培養基

所用菌株為實驗室構建的香草醛脫氫酶工程菌E.coli-VDH，于－80 ℃冰箱中用甘油管保藏。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L， pH 7.0。LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂1.6 g/L，pH 7.0。

1.1.3 實驗主要溶液

考馬斯亮藍（G250）染色液：G250 37 mg，無水乙醇25 mL，磷酸50 mL，去離子水425 mL，均勻混合，于棕色瓶中保存備用。

Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）：Tris 36.3 g，用去離子水溶解，用濃鹽酸調 pH 至7.4，定容至 100 mL，于棕色瓶中避光保存。

PBS緩沖溶液（pH 7.2）、0.9% NaCl溶液均于4 ℃保藏。

1.2 儀器與設備

LB-RH-250 37 ℃恒溫培養箱 青島路博建業環?？萍加邢薰?；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；FS-1800N超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計 伯樂生命醫學產品公司；NanoDrop One蛋白濃度檢測儀、MK3型酶標儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DES的制備

選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，氫鍵供體為蘋果酸、甘油、果糖、1，4-丁二醇、蔗糖、尿素、蘋果酸、乳酸、葡萄糖，按照設定的摩爾比例參考文獻[14]中的方法制備DES。

1.3.2 菌株的活化與培養

從－80 ℃冰箱中取出保藏的香草醛脫氫酶工程菌E.coli-VDH，取50 μL菌液置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養12 h，培養完成后在含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中劃線培養，于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養，直至生長出單菌落。

挑取1環單菌落，置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中過夜培養，按照10%接種量，置于200 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中培養3～4 h，使得OD600處于0.6～0.8。加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導，30 ℃、200 r/min搖床培養16～20 h。

1.3.3 香草醛脫氫酶的獲取和純化

將培養完成的菌株在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，離心后棄上清，加入0.9% NaCl溶液重懸，清洗2次，最后加入8 mL PBS緩沖液（pH 7.2），重懸，破碎。破碎后，于4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為獲得的粗酶液。

將粗酶液采用鎳親和層析柱分離純化香草醛脫氫酶，將純化好的香草醛脫氫酶用 SDS-PAGE 進行分析，隨即進行脫鹽處理，檢測最終蛋白濃度和初始酶活，最終于-20 ℃保存備用。

1.3.4 香草醛脫氫酶酶活和蛋白濃度檢測

參考文獻[25]中的方法，Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.4），不同濃度已制備的DES溶劑、組分混合溶劑（未制備DES）或單一組分溶劑，5 mmol/L香草醛、1 mmol/L NAD+，30 ℃水浴3 min，加入適量香草醛脫氫酶啟動反應，反應溶液總體積為3 mL，檢測5 min內溶液在340 nm波長處吸光值變化，并根據下式計算香草醛脫氫酶酶活。孵育前香草醛脫氫酶的酶活被定義為 100%。

酶活（U）=EW×V×103/（6 220×1）。

式中：EW為1 min內溶液在340 nm處吸光值變化；V為反應溶液總體積，mL；6 220為摩爾消光系數，L/（mol·cm）；1為光程距離，cm。

采用Bradford法測定香草醛脫氫酶的蛋白濃度。

1.3.5 香草酸和香草醛HPLC檢測

準確配制1 mmol/L香草醛和香草酸標準溶液，溶劑選擇甲醇，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL香草醛和香草酸標準溶液，加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL甲醇，用0.22 μm濾膜過濾，進行高效液相色譜檢測，最終繪制各自的標準曲線。高效液相色譜檢測條件：乙腈∶0.1%磷酸-水溶液（5∶5），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，檢測溫度為30 ℃。

1.3.6 香草醛脫氫酶穩定性測試

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖溶液為基準，加入10%的DES，酶促反應pH設定為5～10，共分為6組，分別測定最終的剩余酶活。在最適pH條件下，調整反應體系的溫度分別為20，30，40，50，60，70 ℃，按照同樣步驟測定最終的剩余酶活。

1.3.7 單因素實驗

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖溶液為基準，準確加入1 mL香草醛脫氫酶、終濃度為1 mmol/L的NAD+和香草醛。置于水浴恒溫振蕩器中，轉速設置為180 r/min。分別以反應溫度、反應pH、DES添加量和反應時間為變量，考察各因素對香草酸轉化率的影響。

1.3.8 響應面優化實驗

以單因素實驗結果為基礎，篩選出對香草酸轉化率影響顯著的因素，通過Design-Expert 12.0 軟件中的Box-Behnken進行實驗設計和模型構建，確定香草醛轉化為香草酸的最佳工藝條件。

1.3.9 香草酸轉化率的測定

將反應后的溶液加熱，直至蛋白變性析出，離心取0.5 mL上清液加入同等體積的甲醇溶液，用0.22 μm濾膜過濾，進樣體積設置為20 μL，進行HPLC檢測，將所得峰面積代入香草酸標準曲線，通過最終香草酸含量，計算香草酸轉化率α：

α=C1/C2×100%。

式中：C1為香草酸濃度，mmol/L；C2為初始香草醛濃度，mmol/L。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳

由圖1可知，條帶A為蛋白Marker，條帶B為未純化的粗酶液，條帶C為純化后的酶液。通過比對蛋白Marker，香草醛脫氫酶的分子量大約為56～58 kDa，說明蛋白在大腸桿菌中表達效果良好。純化后的蛋白濃度為5.69 mg/mL，初始酶活為2.71 U/mg。

2.2 DES緩沖液類型的確認

在脂肪酶、纖維素酶和過氧化酶的酶促反應中，多種以氯化膽堿作為氫鍵受體的DES已被證實可以用于提高酶促反應[26]。因此在DES組分的篩選中，選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，糖基、有機酸和醇基作為氫鍵供體來制備不同類型的DES，不同類型DES組分配比見表1。

由圖2可知，糖基作為氫鍵供體時，并不能提升香草醛脫氫酶的活性，果糖和蔗糖作為氫鍵供體時甚至表現出了一定的抑制作用，其原因可能是相較于醇基和有機酸組成的DES，糖基制備的DES通常黏度較高，阻礙了酶促反應中的傳質過程，進而抑制了酶促反應的進行[27]。有機酸作為氫鍵供體時，雖然并沒有抑制香草醛脫氫酶的活性，但是與醇基DES相比，提升效果并不明顯，原因可能是有機酸基DES通常pH較低，改變了催化體系的pH值，進而不利于香草醛脫氫酶酶促反應的進行。在醇基DES中，1，4-丁二醇和甘油各自有2個和3個羥基，而尿素并無羥基結構，在形成DES的過程中，前兩者形成的氫鍵數量多，氫鍵作用強，進而在提升香草醛脫氫酶酶活方面表現出了較好的效果。 通過最終的結果比較，選擇氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3的摩爾比合成DES。

高效的酶促反應離不開水的參與，水對酶促反應通常表現出促進作用，而當DES作為反應溶劑時，水的添加還可以起到調節反應介質的黏度的效果。由圖2可知，隨著DES添加量的增加，其對酶活的提升效果呈現先上升后下降的趨勢。但是DES添加量過低時，多種類型的DES表現出較低的提升效果，這意味著在酶促反應過程中，DES需有一個合適的添加量。以篩選的DES4為例，當DES添加量為5%時，酶活并未達到最佳值，10%添加量時達到最佳，但是隨著添加量增加到30%，酶活反而呈現出下降趨勢。形成這一現象的原因可能是DES添加量過多，黏度提高，酶促反應受到抑制；DES添加量過少，反應過程中的水分含量增加，DES中少量的氫鍵結構被破壞，但是對整體的氫鍵網絡沒有造成過大的影響，仍然可以提高反應的酶活[28]。因此，在后續實驗中選用10%的DES添加量作為酶促反應的最佳添加量。

2.3 溶劑體系組分對香草醛脫氫酶活性的影響

為了更好地驗證香草醛脫氫酶活性的增加是否與組成DES的單一組分或者混合組分有關，對以上組分進行了驗證性實驗。由圖3可知，在添加DES組分的體系中，香草醛脫氫酶的相對酶活最高達到166%，而在單一組分和混合組分反應體系中，香草醛脫氫酶的相對酶活則表現平穩，甚至出現了略微下降的趨勢。產生這一現象的原因可能是雖然選取的組分多為天然產物，但是隨著含量的增多，單一組分在反應體系中不斷擴散，很容易結合到酶的活性位點或者吸附在其附近，破壞分子內氫鍵或者阻斷其與底物結合，從而影響酶的活性。與之相反，DES經過合成后，形成了強大的氫鍵結構，對酶的活性位點起到了保護作用。同時在一定范圍內，隨著DES添加量的增加，酶活也隨之增加，這意味著DES對酶活的提升效果并不是由單一組分決定的，DES在反應體系中也具有較好的穩定性，并沒有完成單一組分的解離[29]。

2.4 香草醛脫氫酶的穩定性

酶活是影響酶促反應進行的一個重要因素，但是酶的穩定性也是酶促進行過程中不可或缺的因素。香草醛脫氫酶的穩定性主要包括酸堿穩定性和熱穩定性，因此選取溶劑體系的pH、溶劑體系的溫度2個因素對香草醛脫氫酶的穩定性進行研究，并確定適合香草醛脫氫酶的反應體系。

2.4.1 pH對香草醛脫氫酶穩定性的影響

反應溶劑的pH可以改變酶的活性位點，因此酶的活性通常對反應體系pH具有較大依賴性[30]。由圖4可知，香草醛脫氫酶在pH 5.0～8.0表現出了較高的穩定性，其中pH為7.0時，香草醛脫氫酶的穩定性最佳，18 h時相對酶活保持在77%，42 h后最終相對酶活仍能達到46%。這個結果可能表明香草醛脫氫酶是一種中性酶，能夠在中性以及弱酸、弱堿條件下保持較高的活性和穩定性，具有廣闊的工業應用前景。與之相比，在pH為9.0和pH為10.0的條件下，18 h后酶的活性基本喪失。造成這一現象的原因可能是在堿性條件下，反應體系的高pH會影響反應底物的電荷活性，酶正常的蛋白結構和形貌遭到破壞，酶的活性位點發生改變，從而阻礙了酶催化反應的進行，酶的穩定性降低[31]。

2.4.2 溫度對香草醛脫氫酶穩定性的影響

由圖5可知，在30 ℃以下以及60 ℃以上，大部分香草醛脫氫酶已經失去活性。在70 ℃維持18 h、20 ℃維持24 h后，酶的活性已經完全喪失。在30，40，50 ℃條件下，酶在DES體系中活性喪失不明顯，42 h后仍能達到72%、77%、57%的相對酶活。由此推斷香草醛脫氫酶屬于中溫酶，其空間結構中暴露在外的氨基酸殘基多為疏水基團，疏水性的氨基酸殘基可以提供更多的疏水相互作用來維持酶的結構，并最終使酶獲得更高的穩定性。而另一個原因可能是DES具有強大的氫鍵作用，可以在酶分子周圍形成保護性結構，避免酶結構遭到破壞，提高了酶的穩定性[32]。

2.5 單因素實驗

上述研究已經證明低共熔溶劑可以提升香草醛脫氫酶的酶活，并且在低共熔溶劑中酶可以穩定存在，但是在實際轉化過程中產物香草酸的生成仍然受多種因素的影響。香草醛脫氫酶的酶促反應需要NAD+的參與，在NAD+定量的情況下，添加過量的酶無法提升香草酸的最終產量，因此本次實驗并沒有考慮酶添加量對香草酸轉化率的影響。最終選取了反應溫度、反應pH、DES添加量、反應時間進行單因素實驗，并根據單因素實驗結果設計響應面優化實驗，進而使得香草酸的轉化率達到最高。

2.5.1 反應溫度對香草酸轉化率的影響

由圖6可知，在選取的溫度范圍內，香草酸的轉化率呈現先升后降的趨勢，在反應溫度為35 ℃時香草酸轉化率最高，達到了84%。這個結果與2.4.2中的結果相對應，香草醛脫氫酶在30～40 ℃內具有較高的穩定性。當反應溫度高于35 ℃時，香草酸轉化率下降，這是因為溫度過高影響了香草醛脫氫酶的活性，從而影響了香草酸的轉化率。因此，本實驗確定的最佳反應溫度為35 ℃。

2.5.2 反應pH對香草酸轉化率的影響

由圖7可知，當pH為7時香草酸轉化率最高，隨著pH繼續增加，香草酸轉化率呈現下降趨勢。這個結果與2.4.1中的結果相對應，香草醛脫氫酶在pH為7.0時具有較高的穩定性。因此，本實驗確定的最佳反應pH為7.0。

2.5.3 DES添加量對香草酸轉化率的影響

由圖8可知，當DES添加量為15%時，香草酸轉化率達到最高。當DES添加量大于15%時，香草酸轉化率呈下降趨勢。DES添加量過低，反應體系中的水含量較高，破壞了DES中的氫鍵結構，DES所提供的保護功能下降，酶活性提升不明顯，轉化率無法達到最大值。過高的DES添加量也會造成反應體系的黏度提升，影響產物香草酸的析出，從而使香草酸轉化率降低。因此，本實驗確定的最佳DES添加量為15%。

2.5.4 反應時間對香草酸轉化率的影響

由圖9可知，隨著反應時間的延長，香草酸轉化率呈上升趨勢。為了更好地了解香草酸的轉化趨勢，選取1 mmol/L香草醛作為底物最終濃度。當反應時間在10～30 min內香草酸轉化率增加較快，在30～50 min內香草酸轉化率的增加變得緩慢，50 min時轉化率達到最大。造成這一現象的原因可能是隨著香草酸析出，酶反應的平衡受到影響，產物的增加影響了反應的進行，從而使反應效率呈現減緩的趨勢。因此，本實驗確定的最佳反應時間為50 min。

2.6 響應面優化實驗

2.6.1 響應面模型的建立與分析

根據單因素實驗結果，確定反應溫度（A）、反應pH（B）和DES添加量（C）是影響從香草醛到香草酸轉化效果的主要因素，Box-Behnken設計因素與水平見表2。設計三因素三水平的響應面優化實驗，共17組實驗，實驗結果見表3。

通過Design-Expert 12軟件對表3中的數據進行模擬分析，得到香草酸轉化率（Y）對自變量反應溫度（A）、反應pH（B）和DES添加量（C）的二次多元回歸模型：Y=83.33+3.36A－0.572 5B+6.76C－4.40AB+5.56AC－0.815 0BC－14.04A2-14.06B2－10.51C2。

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，該回歸模型的P<0.000 1，模型極顯著，失擬項的P>0.05，不顯著，表明該回歸模型具有極好的擬合性。模型的R2=0.995 8， RAdj2=0.990 5，表明該模型擬合度好，預測值與真實值偏差不大。單因素影響方面，反應溫度（A）和DES添加量（C）的P值均小于0.01，表明二者對香草酸轉化率的影響極顯著，其中DES添加量（C）的P<0.000 1，表明其對香草酸轉化率的影響效果最顯著。反應pH（B）的P>0.05，表明該因素對香草酸轉化率的影響不顯著。因此，3個因素對香草酸轉化率的影響順序為DES添加量（C）>反應溫度（A）>反應pH（B）。

2.6.2 響應面圖分析與優化

各因素交互作用對香草酸轉化率影響的等高線和響應面見圖10，DES添加量與反應pH交互的等高線接近圓形，表明對香草酸轉化率的影響相對較??；反應溫度與反應pH、DES添加量與反應溫度交互的等高線為橢圓形，說明對香草酸轉化率的影響較大。同時也印證了2.4.1中的結果，香草醛脫氫酶在pH 5～8范圍內穩定性較強，在該范圍內pH的改變對酶活的影響較小，因而對香草酸轉化率的影響較小。

2.6.3 工藝優化與驗證

通過觀察響應面曲線可以看出，香草酸轉化率存在最大值，采用Design-Expert 12.0進行最終優化，得到香草酸轉化率最高的反應條件：反應溫度為35.94 ℃，反應pH為6.82，DES添加量為16.94%，在此條件下香草酸的轉化率為84.76%。為了更好地檢測結果的可信度以及考慮實際轉化過程中的操作性，將最佳轉化條件調整為反應溫度36 ℃、反應pH 6.8、DES添加量17%，在此條件下將上述條件進行3次驗證，最終得到香草酸轉化率為（84.57±0.15）%。同時在此條件下將DES添加量設置為0%，得到的香草酸轉化率為（61.29±0.37）%，轉化率提升了約40%，更加驗證了DES的添加促進了香草酸的轉化。

3 結論

以氯化膽堿作為氫鍵受體、1，4-丁二醇作為氫鍵供體的DES（氯化膽堿∶1，4-丁二醇為1∶3）可以有效提升香草醛脫氫酶的酶活，并且可以使酶在反應體系內保持較高的穩定性。以此為基礎構建了DES輔助酶轉化香草醛生成香草酸的綠色催化工藝。以提高香草酸轉化率為目標，通過單因素實驗以及響應面優化實驗優化轉化條件，利用Box-Behnken和Design-Expert 12.0優化獲得香草酸最佳轉化工藝條件為反應溫度36 ℃、反應pH 6.8、DES添加量17%，通過重復實驗進行驗證，得到香草酸最佳轉化率為84.57%，與理論值相比僅差0.19%。模型的可靠性驗證以及較高的香草酸轉化率預測為香草酸的生物合成提供了一種新的可行性途徑，為未來香草酸的大規模綠色生產提供了重要指導。

參考文獻：

[1]KAUR J， GULATI M， SINGH S K， et al. Discovering multifaceted role of vanillic acid beyond flavours： nutraceutical and therapeutic potential[J].Trends in Food Science & Technology，2022，122：187-200.

[2]龔玉圓.香草酸抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性及生物被膜機制研究[D].宜昌：三峽大學，2022.

[3]ALI W I， AL-ABBASY O Y， YOUNIS S A. Vanillic acid： an antioxidant used in preventing browning process in pear （Pyrus communis L.） juice[J].Annals of the Romanian Society for Cell Biology，2021，25（3）：5272-5285.

[4]SHARMA N， KHURANA N， MUTHURAMAN A， et al. Pharmacological evaluation of vanillic acid in rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J].European Journal of Pharmacology，2021，903（12）：174112.

[5]JUNG Y， PARK J， KIM H L， et al.Vanillic acid attenuates testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in rats and inhibits proliferation of prostatic epithelial cells[J].Oncotarget，2017，8（50）：87194-87208.

[6]錢偉.一種香草酸連續化生產設備及生產方法：中國，CN108129298A[P].2018-06-08.

[7]LUDWIKOWSKI T M， WAGNER A O， MARGESIN R. Bioconversion of ferulic acid and vanillin to vanillic acid by cold-adapted Paraburkholderia aromaticivorans AR20-38： impact of culture conditions[J].Annals of Microbiology，2023，73（1）：1-17.

[8]KHOYRATTY S， KODJA H， VERPOORTE R. Vanilla flavor production methods： a review[J].Industrial Crops and Products，2018，125：433-442.

[9]ASHENGROPH M， NAHVI I， ZARKESH-ESFAHANI H， et al. Novel strain of Bacillus licheniformis SHL1 with potential converting ferulic acid into vanillic acid[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：553-558.

[10]李金濤，張明祖，何金林，等.低共熔溶劑在高分子合成中的應用[J].化學進展，2022，34（10）：2159-2172.

[11]李凌娜，楊繼威，張麗芬，等.響應面法優化低共熔溶劑提取迷迭香中迷迭香酸和鼠尾草酸的工藝[J].食品工業科技，2023，44（16）：218-227.

[12]SHANG X， DOU Y， ZHANG Y， et al. Tailor-made natural deep eutectic solvents for green extraction of isoflavones from chickpea （Cicer arietinum L.） sprouts[J].Industrial Crops and Products，2019，140：111724.

[13]LIN J J， XIANG H， SUN-WATERHOUSE D X， et al. Deep eutectic solvents and alkaline extraction of protein from seabuckthorn seed meal： a comparison study[J].Food Science and Human Wellness，2022，11（4）：1028-1035.

[14]李利芬.基于氯化膽堿低共熔溶劑的木質素提取改性和降解研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2015.

[15]劉乾靜，陳曉淼，王芷，等.低共熔溶劑預處理楊木水解渣拆解木質素[J].化工進展，2022，41（10）：5612-5618.

[16]仝爭，王渝，何曉希，等.低共熔溶劑在生物催化中的應用研究進展[J].化學試劑，2022，44（12）：1723-1730.

[17]GORKE J， KAZLAUSKAS S R. Toward advanced ionic liquids. Polar， enzyme-friendly solvents for biocatalysis[J].Biotechnology & Bioprocess Engineering，2010，15（1）：40-53.

[18]DANESHJOU S， KHODAVERDIAN S， DABIRMANESH B， et al. Improvement of chondroitinases ABCI stability in natural deep eutectic solvents[J].Journal of Molecular Liquids，2017，227：21-25.

[19]XU P， CHENG J， LOU W Y， et al. Using deep eutectic solvents to improve the resolution of racemic 1-（4-methoxyphenyl）ethanol through Acetobacter sp. CCTCC M209061 cell-mediated asymmetric oxidation[J].RSC Advances，2014，5（9）：6357-6364.

[20]徐萬軍.低共熔溶劑輔助糖苷酶轉化黃酮苷的研究[D].重慶：重慶大學，2019.

[21]LINDBERG D， REVENGA M D L F， WIDERSTEN M. Deep eutectic solvents （DESs） are viable cosolvents for enzyme-catalyzed epoxide hydrolysis[J].Journal of Biotechnology，2010，147（3-4）：169-171.

[22]ZHAO K H， CAI Y Z， LIN X S， et al. Enzymatic synthesis of glucose-based fatty acid esters in bisolvent systems containing ionic liquids or deep eutectic solvents[J].Molecules，2016，21（10）：1294.

[23]ZHU D， XU L， SETHUPATHY S， et al. Decoding lignin valorization pathways in the extremophilic Bacillus ligniniphilus L1 for vanillin biosynthesis[J].Green Chemistry，2021，23：9554-9570.

[24]司海兵.嗜堿耐鹽菌Bacillus ligniniphilus L1解聚木質素生成香草酸的代謝途徑解析[D].鎮江：江蘇大學，2020.

[25]張雪瑩.睪丸酮叢毛單胞菌醛脫氫酶的挖掘、性質及其催化呋喃醛選擇性氧化的研究[D].廣州：華南理工大學，2019.

[26]王艷玲，陳小燕，余強，等.低共熔溶劑在生物轉化中的應用[J].新能源進展，2021，9（3）：211-217.

[27]YANG Z， PAN W. Ionic liquids： green solvents for nonaqueous biocatalysis[J].Enzyme & Microbial Technology，2005，37：19-28.

[28]WAITE S L， LI H， PAGE A J. NO2 solvation structure in choline chloride deep eutectic solvents-the role of the hydrogen bond donor[J].Journal of Physical Chemistry B，2018，122（15）：4336-4344.

[29]XU W J， HUANG Y K， LI F， et al. Improving β-glucosidase biocatalysis with deep eutectic solvents based on choline chloride[J].Biochemical Engineering Journal，2018，138：37-46.

[30]KOTOGN A， KECSKEMTI A， SZEKERES A， et al. Characterization of transesterification reactions by Mucoromycotina lipases in non-aqueous media[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2016，127：47-55.

[31]YANTA H， BELL E. The linkage between citrate， pH regulation and protein folding in glyoxysomal malate dehydrogenase[J].The FASEB Journal，2012，26（S1）：581.

[32]JUNEIDI I， HAYYAN M， HASHIM M A， et al. Pure and aqueous deep eutectic solvents for a lipase-catalysed hydrolysis reaction[J].Biochemical Engineering Journal，2017，117：129-138.