傳統釀造醬及醬油中微生物酶系研究進展

史?；? 劉香英 孫洪蕊 范杰英 孟悅 張佳霖 康立寧

摘要：釀造調味品是我國傳統食品中重要的一類，其發酵過程主要依賴于微生物的生命運動，微生物及代謝酶的相互作用賦予了發酵食品獨特的風味和風格。文章從傳統豆醬及醬油的釀造工藝、釀造主要微生物、微生物酶系的功能特性、國內外發展趨勢等方面進行論述。同時，分析并展望了微生物酶在食品工業中的應用前景，旨為生產營養、健康、美味的傳統發酵食品提供理論依據。

關鍵詞：豆醬；醬油；微生物；功能酶系

中圖分類號：TS264.2????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0216-05

Research Progress of Microbial Enzymes in Traditionally Brewed Paste and Soy Sauce

Abstract： Brewed condiment is an important kind of traditional food in China.The fermentation process mainly depends on the life movement of microorganisms.The interaction between microorganisms and metabolic enzymes gives fermented food a unique flavor and style. In this paper， the brewing technology of traditional soybean paste and soy sauce， the main brewed microorganisms， the functional characteristics of microbial enzymes and the development trend at home and abroad are discussed. At the same time， the application prospect of microbial enzymes in food industry is analyzed and prospected， in order to provide theoretical basis for the production of nutritious， healthy and delicious traditionally fermented food.

Key words： soybean paste; soy sauce; microorganism; functional enzymes

豆醬及醬油是以豆類為原料，經過熟制、制曲、發酵等工藝制成的發酵食品。它們的制曲方法及發酵理論基本相同或相似，均是由于環境和原料中的微生物及酶的作用使原料發生重要的生物化學反應后制得的食品。不同之處在于從成熟醬醅中抽濾出的汁液為醬油，而豆醬是由醬醅直接配制或研磨而制得的半固態產品[1]。醬醅發酵過程中的生化反應十分復雜，目前仍缺乏廣泛且深入的系統研究，但其基本反應原理已經明確，主要是微生物分泌的多種酶類相互作用、相互滲透的結果。

豆醬及醬油的釀造過程為半開放式，人們將原料和特定微生物充分混合，且通過對溫度、濕度等生態因子的有效控制，使成熟的醬醅產生豐富的微生物酶系，復雜酶系協同促進醛類、酸類、酚類等揮發性風味物質的釋放[2]。產生豐富酶系的微生物主要有曲霉菌、酵母菌、乳酸菌及其他細菌，它們具有不同的生理生化特性，這些微生物產生的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、氨肽酶等酶類能將原料中的營養成分充分降解，使豆醬及醬油具有降解產物多、醬香濃郁等特點，增加了豆醬及醬油特有的鮮味和甜味，且對豆醬及醬油的風味及品質調控有重要作用，形成色、香、味、體俱佳的調味品。目前，國內外學者的大量研究已經表明微生物酶系與風味之間有著緊密聯系。王軍喜[3]研究表明在醬油發酵過程中，醬油特征風味物質的形成與微生物的種類及酶活力密切相關。Wardhani等[4]研究發現醬醅質量與胞外酶分泌系統有直接關系，從而影響豆醬的風味。Zhao等[5]認為醬醅在發酵前期時蛋白酶、氨肽酶的分泌量較高，而葡萄糖苷酶、木聚糖酶在后期有較高分泌量，因不同時期酶分泌量不同，故醬醅的風味也不同。這些研究充分說明在豆醬及醬油釀造過程中，由于微生物的種類及特性不同，從而產生酶的種類及分泌量也不同，進而導致發酵產品的風味和品質不同，因此具有豐富的微生物種群及功能酶系是釀造高質量發酵調味品的重要保證。

本文闡述了傳統豆醬及醬油主要釀造工藝及微生物功能酶系的研究現狀，對微生物酶在食品工業中的應用前景進行了展望，將為傳統釀造調味品的開發和應用奠定理論基礎和技術支撐，對傳統釀造產業的健康發展具有促進作用。

1 傳統豆醬及醬油釀造工藝

豆醬及醬油的關鍵生產過程主要分為原料預處理、制曲、發酵3個階段。原料預處理主要是指原料經去皮、脫殼、浸泡、蒸煮等工藝，使原料中的淀粉、蛋白質等基本成分能夠被微生物充分利用和分解。原料去皮、脫殼工藝有助于提升豆醬及醬油的食用口感，為下一步原料浸泡工藝提供有利條件。原料浸泡工藝主要是使原料中含有大量的水分，有利于原料蒸煮時蛋白質變性和淀粉糊化。蒸煮工藝的目的是使原料熟化，且使原料的基本成分得到充分變性，為原料進行高質量的制曲打下堅實基礎。不同蒸煮工藝對原料有不同程度的影響和作用，傳統蒸煮工藝主要有常壓蒸煮工藝和高壓蒸煮工藝，常壓蒸煮工藝的原料能較好地保持原本形狀，而高壓蒸煮工藝常常不能保持其原來的形狀。此外，近年來，擠壓膨化技術作為一種熟化新技術也廣泛應用于豆醬及醬油生產中。成曉苑[6]在釀造醬油過程中，采用擠壓膨化技術對花生粕進行預處理，由于原料受到高溫、高壓、高剪切力的作用，其體積變得更大、內部結構更加疏松，這樣有利于制曲時菌絲在原料內部更好地生長繁殖，促使原料分解完全。

制曲方法一般包括圓盤通風制曲和厚層通風制曲兩種。圓盤通風制曲成曲質量不穩定，容易造成較低的酶活力，故人們通常采用厚層通風制曲方法，這種方式制備的成曲質量穩定，使微生物能在適宜溫度下生長繁殖，進而產生大量的淡綠色孢子。原料表面包裹的孢子越多，說明微生物生長越旺盛，且能夠分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等特色酶類，它們能將原料分解成糖類、多肽、氨基酸等代謝產物，對醬醅形成獨特的風味有一定貢獻。然而，微生物在生長代謝過程中，亦會積累大量的代謝廢物和有害物質，會抑制微生物生長，使豆醬產生不良風味，如霉味、酸味。因此，制曲直接影響微生物的產酶能力，進而影響醬醅風味體系的構建。

發酵方式一般分為天然曬露發酵、高鹽稀醪發酵、低鹽固態發酵等。天然曬露發酵和高鹽稀醪發酵的發酵周期較長，通常約為4～6個月，容易導致發酵過程中原料利用率低、生產成本過高等問題。目前，我國醬醅的生產一般采用低鹽固態發酵方式，這種方式發酵周期較短，能夠有效節約成本，它是將鹽水和成曲進行充分混合，同時控制一定的溫度和濕度，發酵一段時間后醬醅若呈紅褐色的半固體狀態且伴有濃郁的醬香味，說明醬醅成熟，可以停止發酵。此外，在發酵過程中，這種發酵方式會造成高鹽缺氧的環境，使霉菌的生長受到抑制，其代謝活動將逐漸停止，而此時酵母菌和乳酸菌開始大量繁殖，進行酒精發酵和乳酸菌發酵，它們在輔酶作用下能利用霉菌的降解產物葡萄糖生成乙醇、酯類等香氣成分，進而提高醬醅的風味及品質[7]。

2 醬醅中主要釀造微生物

2.1 曲霉菌

曲霉菌（如米曲霉、根霉、毛霉）具有豐富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，主要應用于發酵食品的制作。Lee等[8]發現豆醬中的曲霉具有較高的蛋白酶和淀粉酶分泌量。趙謀明等[9]通過分離純化、基因工程等手段鑒定出傳統醬油中菌屬大多為霉菌，其蛋白酶、葡萄糖苷酶及糖化酶等活力較高。陳方博等[10]發現米曲霉是豆醬發酵過程中的優勢菌種，能分泌大量的蛋白酶和淀粉酶。米曲霉通常為淡綠色，依靠無性孢子繁殖，主要利用淀粉、單糖、雙糖等碳源和蛋白質、銨鹽等氮源來維持生長繁殖及產酶需要[11]。它分泌的酶系十分復雜，主要有蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖維素酶等胞外酶，酶系的分泌量及種類對原料的利用率有較大影響。童佳[12]的研究證實了這一點，研究表明米曲霉具有較高的酶分泌量，能夠利用各種酶類將原料中的營養成分有效分解成氨基酸、糖類等風味物質，提高原料的利用率。

毛霉在釀造行業中的應用也十分廣泛，如總狀毛霉主要用于制備豆豉等。近年來，關于毛霉型豆豉的酶系也有大量學者研究。林親錄等[13]通過正交試驗確定了毛霉生長的最佳培養條件，結果表明在30 ℃條件下進行發酵培養，毛霉產酶能力最強，主要以產中性蛋白酶為主。沈祥森[14]通過對毛霉型豆豉的纖維素酶、糖化酶的活力進行測定，發現酶活性與毛霉的數量呈正相關。Disanto等[15]研究發現毛霉在孢子向菌絲轉化過程中氨肽酶表現出較高水平。曾濤等[16]通過PCR-DGGE技術對毛霉型豆豉微生物群落的動態變化進行了研究，發現總狀毛霉在制曲階段有一定的優勢，能夠產生豐富的酶系。這些研究為毛霉在釀造行業的可持續發展打下了堅實基礎。

2.2 酵母菌

目前，從醬醅中分離出的酵母菌有7個屬、23個種，其中魯氏酵母和球擬酵母對豆醬及醬油的風味和香氣有重要作用。魯氏酵母最適生長溫度為28～30 ℃，最適pH為4～5，最適食鹽濃度為5%～8%，但因其具有耐鹽性強、抗高滲透壓的特點，在18%食鹽濃度下仍能繼續生長繁殖，在食鹽濃度為24%的環境中也能緩慢生長。此外，由于發酵環境中食鹽濃度不同，魯氏酵母發酵利用的糖類情況也不同。在不添加食鹽的發酵環境下，魯氏酵母利用葡萄糖和麥芽糖進行發酵，而在食鹽濃度為18%時，魯氏酵母幾乎僅利用葡萄糖進行發酵。在醬醅發酵過程中，由于發酵前期醬醅中含糖量較高，酵母菌的酒精發酵比較旺盛，能夠生成甘油、琥珀酸及其他醇類等。而隨著發酵過程中糖類物質被大量消耗，且發酵體系中pH值逐漸降低，魯氏酵母會發生自溶，此時球擬酵母的生長繁殖開始活躍起來。球擬酵母屬于酯香型酵母，當發酵后期pH值較低時，分泌的酸性蛋白酶能將未分解的肽鏈進行降解，從而產生酯香成分。目前，大多數關于酵母菌在豆醬及醬油發酵中的應用主要集中于酵母菌與乳酸菌發揮協同作用的研究。劉超蘭等[17]研究表明乳酸菌和酵母菌共同培養制曲不僅能夠縮短豆醬的發酵時間，而且能夠促進酯類等風味物質的形成。酵母菌與乳酸菌發揮協同作用，可有效改善豆醬及醬油的風味，賦予其獨特香味。

2.3 乳酸菌

在傳統發酵豆制品中應用的乳酸菌主要有嗜鹽片球菌、植物乳桿菌等，它們能夠降低發酵環境的pH值，但這些乳酸菌耐乳酸的能力較弱，不會產生過量的乳酸而使發酵體系中的pH值過低，繼而導致醬醅質量下降且產生酸敗味。另外，由這些乳酸菌生成的乳酸不僅本身具有特殊的香味，而且能和醬醅發酵后期產生的大量乙醇生成乳酸乙酯，對豆醬及醬油的調味和增香起到重要作用。目前，已有大量關于乳酸菌調味增香作用的研究。Hamad等[18]研究表明，乳酸菌本身的酸性特質和發酵過程中積累的有機酸等物質能明顯改善醬醅的風味。戚晨晨等[19]研究發現，添加耐鹽乳酸菌醬油的風味和品質優于未添加耐鹽乳酸菌的醬油。李巧玉等[20]研究發現，乳酸菌有利于酸類、酯類等揮發性物質的生成與釋放，從而提高醬醅的風味和品質。乳酸菌是醬醅風味和香氣物質組成的重要來源，對醬醅風味和香氣的提高有促進作用。

3 醬醅中微生物酶系研究現狀

在豆醬及醬油發酵過程中，由于不同的微生物種類在發酵過程中產生的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、糖化酶等酶系種類各不相同，原料中的蛋白質、淀粉、纖維素等基本成分經過微生物發酵等各種生化過程，生成的氨基酸、肽類、糖類及次級代謝產物等生物小分子物質也各不相同，繼而形成了發酵豆醬及醬油各自的特征風味和特色酶系[21]。醬醅中微生物酶系根據功能特性主要分為纖維素分解酶系、蛋白質水解酶系、碳水化合物分解酶系及其他酶系四大類。

3.1 纖維素分解酶系

纖維素和半纖維素是植物細胞壁的主要成分，通常纖維素的含量高于半纖維素的含量。植物細胞壁中纖維素和半纖維素的存在不利于原料中營養成分的釋放，因此，需要微生物產生的各種酶類將纖維素和半纖維素進行分解。分解纖維素和半纖維素的微生物種類很多，主要有曲霉、根霉、木霉和青霉等，其中曲霉生長周期短，微生物酶系豐富，能夠高產木聚糖酶、纖維素酶等酶類[22]。木聚糖酶、纖維素酶構成纖維素分解酶系，能夠分解包裹在原料外的細胞壁，使原料中的有效成分充分暴露出來，有利于原料進行高質量的制曲和發酵。目前，國內外學者已開展了大量關于木聚糖酶和纖維素酶的研究。Tsang等[23]在曲霉中檢測出63種能夠水解纖維素和半纖維素的水解酶，它們經誘導將產生上百種纖維素酶。田杰[24]優化了木聚糖酶的發酵條件，發現在含水量50%、發酵溫度30 ℃、發酵時間48 h、接種量5%時，曲霉產木聚糖酶活力達到最大，為223.47 U/g。Gustavo等[25]發現木聚糖酶與細胞壁的水解密切相關，且它的數量和活性均比其他酶類高。

3.2 蛋白質水解酶系

蛋白質水解酶根據作用機理可以分為蛋白酶和肽酶兩大類。而蛋白酶根據pH又劃分為中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶三類。在醬醅制曲過程中，若原料的碳氮比小，曲中蛋白酶以中性和堿性蛋白酶為主，酸性蛋白酶活力較弱；反之，碳氮比大，酸性蛋白酶活力較強[26]。李萍萍等[27]發現，甜面醬中酸性蛋白酶的活力顯著高于中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這進一步說明了酸性蛋白酶降解原料蛋白的能力比中性蛋白酶和堿性蛋白酶強。然而，3種蛋白酶的作用機理相同，均是將位于非末端特定部位的蛋白質多肽鏈切斷成相對分子質量較小的肽鏈，使肽鏈中的氨基酸暴露出來，此時肽酶能夠將氨基酸逐個水解，使蛋白質水解完全，進而形成各類小分子風味物質。

在醬醅發酵過程中，一般要求曲有較高的蛋白酶活力，這樣可以促使蛋白質高效分解成氨基酸等物質。近年來，大多數學者采用混合菌株進行制曲發酵來提高蛋白酶活力。李志江等[28]發現采用黑曲霉和米曲霉共同制曲，豆醬的蛋白酶等酶類活性更高。Tang等[29]研究表明，采用米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3菌株共同培養蠶豆曲的蛋白酶分泌量比僅用米曲霉QM-6菌株培養蠶豆曲的蛋白酶分泌量更加豐富。Mitsuboshi等[30]研究發現采用青霉和毛霉對納豆進行發酵時，測得的蛋白酶活性更高。李保英等[31]采用黑曲霉和米曲霉分別混合和單獨制曲，發現復合菌株共同制曲能大大提高蛋白酶活力。這些研究說明復合菌株制曲發酵是提高蛋白酶活力的有效途徑，將為進一步生產優質的豆醬及醬油提供有力依據。

3.3 碳水化合物分解酶系

碳水化合物分解酶通過降解作用將復雜的多糖轉變為單糖、雙糖等還原性糖類，是有利于豆醬甜味物質分解釋放和機體調節糖代謝途徑的關鍵性酶[32]。碳水化合物分解酶主要分為糖化酶、葡萄糖苷酶、淀粉酶等酶類。它們是從淀粉分子非還原性末端以葡萄糖為單位進行水解。糖化酶能作用于α-1，4-糖苷鍵和α-1，6-糖苷鍵。而淀粉酶和葡萄糖苷酶雖不能作用于α-1，6-糖苷鍵，但能越過α-1，6-糖苷鍵繼續作用于α-1，4-糖苷鍵[33]。因此，糖化酶能將直鏈淀粉和支鏈淀粉徹底水解成葡萄糖，而葡萄糖苷酶和淀粉酶水解產物是葡萄糖、麥芽糖和帶有α-1，6-糖苷鍵的寡糖等。微生物酶的種類及水解能力與微生物的多樣性密切相關，王亞芬等[34]研究表明當環境溫度為55 ℃時，毛霉降解生成還原糖的速率更快，糖化酶活性達到最高。Kitamoto[35]的研究結果表明，米曲霉能產生更多的葡萄糖苷酶和淀粉酶，較易水解大量糖苷鍵。Park等[36]和Hernandez等[37]的研究結果表明，黑曲霉能分泌大量的淀粉酶，具有較強的水解能力。這些碳水化合物分解酶能將淀粉分解成單糖和雙糖，導致原淀粉溶液的濃度下降，各類酶水解能力越強，糖化反應越完全，醬醅的甜味也會更加突出。

3.4 其他酶系

果膠酶對存在于植物細胞間隙的果膠有水解、裂解的作用，最后能生成甲醇和半乳糖醛酸等。然而，Kaewkrod等[38]研究發現果膠酶不僅能分解果膠，而且能與蛋白酶協同分解蛋白質，進而提高醬油風味物質的釋放能力。酚氧化酶多存在于米曲霉的孢子中，它與醬醅的色澤呈密切相關性。這是由于酪氨酸在酚氧化酶的催化下發生酶促氧化反應，進而生成黑色素，成為豆醬及醬油色素的主要來源。脂肪酶能夠水解脂肪中的酯鍵，生成甘油和脂肪酸，在細菌、真菌、酵母菌等微生物中較常見[39]。谷氨酰胺酶是豆醬及醬油中促進鮮味表達的關鍵胞內酶，在谷氨酰胺酶的作用下，谷氨酰胺能轉化成游離的谷氨酸和氨，從而增加了醬醅的鮮味[40]。然而，在豆醬及醬油發酵過程中，通常會添加食鹽來達到提鮮及抑制霉菌生長的目的，而高鹽環境下亦會抑制谷氨酰胺酶的活性，導致酶活性降低，使豆醬及醬油的鮮味不足。針對這一現象，孫啟星等[41]發現可以通過添加耐鹽性的谷氨酰胺酶來達到脫酰胺的目的，從而提高醬醅中谷氨酸的含量，這為醬醅鮮味能夠有效表達提供了新思路。

4 結論與展望

微生物酶的資源在自然界中廣泛分布，它本身是一類具有催化作用的蛋白質，能夠使生物體發生一系列生物化學反應，進而賦予豆醬及醬油特有的風味特征。然而，目前我國學者關于微生物酶的研究，主要集中于微生物產生的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等酶類的作用機理、反應過程等，而采用基因工程、蛋白質工程等新技術對酶類的菌株進行篩選、代謝規律、功能因子等的研究相對較少，這一定程度上導致我國在釀造菌株培育、新型酶類的開發與應用等方面發展相對滯后。雖然近年來，微生物正在大規模地工業化生產，且微生物成為各類酶制劑的主要來源，但各類酶制劑的應用仍未能廣泛普及。食品酶制劑的應用主要集中在淀粉、乳制品行業，但在釀造行業中的應用與開發相對滯后。因此，我們要進一步拓寬微生物酶在釀造行業等其他食品領域的應用，采用新生物技術重點研究微生物菌株選育、酶種選擇及酶的新用途開發，使微生物酶在食品工業道路上可持續發展。

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