骨形態發生蛋白5對肝癌細胞生物學行為的影響及機制

馬東玥，臧艷，任俏慧，朱欣悅，王蓮子，呂偉，姚駿驍，周心怡，余莉，李濤

1 安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥 230022；2 病原生物學安徽省重點實驗室

根據2020 年的全球癌癥統計，肝癌是第六大常見的惡性腫瘤，居癌癥死亡第三位［1］。肝癌病理生理機制復雜，多種因素參與肝細胞的惡性轉化以及腫瘤進展，包括遺傳易感性、病毒因素、細胞微環境等［2］。探索腫瘤微環境中多種細胞因子對腫瘤發生發展的作用，可能對肝癌治療具有潛在意義［3］。骨形態發生蛋白（BMP）是屬于TGF-β家族的分泌型蛋白［4］，可參與調節細胞增殖、分化等多種細胞生物學行為［5-6］。已有研究表明，BMP5 可能參與腫瘤的發生發展。有關胰腺癌的研究發現BMP5 在癌組織中低表達，使用外源性BMP5 處理胰腺癌細胞能抑制細胞增殖，促進其遷移和侵襲［7］。而在皮膚組織的研究顯示，BMP5 可誘導骨髓來源細胞的角蛋白表達，從而促進慢性皮膚腫瘤的進展［8］。然而BMP5在肝癌中的表達及對肝癌的作用鮮見報道。2023 年1月—12月，本研究檢測BMP5在肝癌細胞中的表達，探究其在肝癌細胞系中對細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝細胞系L02 來自本實驗室保存，肝癌細胞系Hep3B、Huh7 購自廣州賽庫生物技術有限公司。RPMI 1640 培養基、DMEM 培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自南京維森特生物技術有限公司；總RNA 提取試劑TRIzol、Annexin-V/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific 公司；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 購自上海翌圣生物科技股份有限公司；BMP5、GAPDH 引物購自上海生工生物工程有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；GAPDH、PCNA抗體購自美國Affinity 公司；羊抗兔/羊抗鼠二抗購自美國Proteintech 公司；BMP5 抗體購自美國SANTA CRUZ 及Affinity 公司；SMAD3、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）抗體購自美國Abcam 公司；重組人骨形態發生蛋白5（rh-BMP5）購自美國R＆D 公司；CCK-8試劑盒購自廣州Biosharp 公司。實時熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；電泳儀、轉膜儀及化學發光凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；Infinite F50型自動酶標分析儀（瑞士TECAN公司）；流式細胞儀購自美國BD公司；正置及倒置光學顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 細胞中BMP5 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA。實時熒光定量PCR 儀上以cDNA 為模板完成實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應擴增檢測。BMP5 正向引物：5'-TGGCAGGACTGGATTATAGCA-3'，反向引物：5'-CAAGGCTTTGGTACGTGGTC-3'；GAPDH 作為內參基因，正向引物：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。檢測各模板Ct 值，以2-ΔΔCt法分析各細胞系中BMP5基因相對于內參基因的表達。

1.3 細胞培養及分組 細胞置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中，分別以含10%FBS 的RPMI1640培養基培養L02 細胞、DMEM 培養基培養Hep3B、Huh7 細胞。rh-BMP5 處理人肝癌細胞系Hep3B、Huh7，分為NC組及rh-BMP5 低劑量組、rh-BMP5 中劑量組、rh-BMP5高劑量組。NC組予以不含rh-BMP5的無血清培養基培養，rh-BMP5 低、中、高劑量組予以無血清培養基配制的1、10、100 ng/mL rh-BMP5 用于后續實驗。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將NC組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7 細胞培養于6孔板中，收集各組對數生長期細胞，分別用無血清培養基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5的無血清培養基重選為細胞懸液，每組設置3個復孔，每孔加入100 μL 細胞懸液，同時設僅加無血清培養基的空白對照。分別培養24、48 h 后每孔加入CCK-8 試劑10 μL于培養箱中繼續孵育2 h。酶標儀450 nm波長測定各孔光密度（OD）值，以各組OD 值計算細胞活力，代表細胞增殖能力。細胞活力=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，As 為加rh-BMP5 的處理孔，Ab 為空白孔，As為對照孔。

1.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。將NC 組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7 細胞培養于6 孔板中，收集各組細胞于BD 適配流式管中，1 000 r/min離心5 min半徑，棄上清，4 ℃預冷PBS輕柔洗滌細胞沉淀，重復1 次。然后配置1×Binding Buffer 洗滌細胞沉淀1 次，1 000 r/min 離心5 min（半徑7.6 cm），收集細胞沉淀，195 μL 1× Binding Buffer輕柔重懸細胞，加入5 μL Annexin-V-FITC 混勻染色，4 ℃避光10 min，200 μL 1× Binding Buffer洗滌細胞，1 000 r/min 離心5 min（半徑7.6 cm），收集細胞沉淀，190 μL 1× Binding Buffer 重選細胞，加入5 μL Propidium Iodide（PI）染色，4 ℃避光5 min，輕柔混勻后上機檢測。

1.6 細胞遷移率測算 采用細胞劃痕實驗。收集對數生長期的Hep3B、Huh7細胞培養于6孔板中，根據細胞的大小控制鋪板密度。置于細胞培養箱中過夜培養后于孔板底部作劃痕。加入無血清培養基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5 的無血清培養基，再置于細胞培養箱中培養24 h及48 h，200倍倒置顯微鏡下拍照，用ImageJ分析遷移面積并計算遷移率。

1.7 SMAD信號分子和PCNA蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。將NC 組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7細胞培養于6孔板中，收集各組對數生長期細胞，加入適量含PMSF 的RIPA 蛋白裂解液，充分吹打混勻，冰上靜置30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min（半徑8.5 cm），收集上清液測定蛋白濃度。然后經SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、封閉，一抗（SMAD3 1∶1 000、p-SMAD3 1∶1 000、PCNA 1∶2 000、GAPDH 1∶2 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜后二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL發光液顯影并存檔。ImageJ軟件對目標條帶進行灰度識別，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH 的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism9.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMP5 mRNA 在肝癌細胞系中的表達 正常肝細胞系L02、肝癌細胞系Hep3B 和Huh7 中BMP5 mRNA 相對表達量分別為1.000、4.929 ± 0.486、27.75 ± 1.975，與正常肝細胞系L02 相比，BMP5 mRNA 在肝癌細胞系Hep3B 和Huh7 中相對表達量升高（P均＜0.05）。

2.2 BMP5 對肝癌細胞增殖能力的影響 與NC 組相比，低劑量組在培養24、48 h時細胞增殖能力增加，但未見統計學差異；而中、高劑量組在24、48 h較NC組細胞增殖能力均顯著增加（P均＜0.05），見表1。

表1 各組不同時點細胞活力（%， ± s）

表1 各組不同時點細胞活力（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組96.01 ± 6.49 153.40 ± 8.97 185.70 ± 21.59 224.20 ± 15.00 Hep3B細胞活力24 h48 h 113.6 ± 9.98 176.4 ± 14.89 241.8 ± 12.08 266.0 ± 22.19 Huh7細胞活力24 h 98.41 ± 0.74 104.00 ± 0.77 113.6 ± 2.59 118.7 ± 2.23 48 h 100.9 ± 2.65 125.6 ± 1.29 128.1 ± 3.52 129.3 ± 4.82

2.3 BMP5對肝癌細胞凋亡的影響 在Hep3B細胞中，與NC 組相比，培養24 h 后，低、中、高劑量組細胞凋亡率下降（P均＜0.05）；培養48 h后，低、中劑量組與NC 組相比凋亡率下降，但差異無統計學意義，而高劑量組凋亡率低于NC 組（P＜0.05）。在Huh7細胞中，rh-BMP5 低劑量組凋亡率在24、48 h 較對照組均無統計學差異，而中、高劑量組與NC 組相比凋亡率顯著下降（P均＜0.05），見表2。

表2 各組不同時點細胞凋亡率（%， ± s）

表2 各組不同時點細胞凋亡率（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組10.03 ± 0.93 4.90 ± 1.12 3.23 ± 0.39 2.48 ± 0.21 Hep3B細胞凋亡率24 h48 h 10.82 ± 0.65 10.68 ± 0.61 7.98 ± 0.57 6.19 ± 0.68 Huh7細胞凋亡率24 h 9.10 ± 0.59 6.04 ± 0.94 3.37 ± 0.16 3.26 ± 0.17 48 h 11.04 ± 0.87 6.58 ± 1.24 5.49 ± 1.00 4.36 ± 0.75

2.4 BMP5 對肝癌細胞遷移能力的影響 在處理24 及48 h 后，與NC 組相比，rh-BMP5 低、中劑量組的Hep3B、Huh7 細胞遷移率增加，但無統計學差異；而高劑量組在24 h 及48 h 與NC組相比遷移率均顯著增加（P均＜0.05），見表3。

表3 各組不同時點細胞遷移率（%， ± s）

表3 各組不同時點細胞遷移率（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組Hep3B細胞遷移率24 h48 h24 h48 h 43 ± 4.0059.91 ± 1.0412.37 ± 3.5324.50 ± 5.21 50 ± 6.4863.57 ± 1.1615.43 ± 5.5027.48 ± 8.68 61 ± 5.5270.77 ± 1.3623.02 ± 5.1839.86 ± 6.16 68 ± 7.2774.92 ± 5.0734.81 ± 8.4351.60 ± 2.23 27.37.43.54.Huh7細胞遷移率

2.5 不同濃度BMP5對肝癌細胞SMAD通路蛋白表達的影響 選取0、1、10、100 ng/mL濃度的rh-BMP5處理肝癌細胞系Hep3B 及Huh7，Western blotting 結果顯示，與0 ng/mL濃度相比，rh-BMP5 100 ng/mL濃度處理細胞后PCNA蛋白表達上調，p-SMAD3蛋白表達升高，差異有統計學意義（P均＜0.05），見表4。

表4 不同濃度BMP5對肝癌細胞SMAD通路蛋白表達的影響（ ± s）

表4 不同濃度BMP5對肝癌細胞SMAD通路蛋白表達的影響（ ± s）

細胞系蛋白相對表達量/GAPDH NC組低劑量組中劑量組高劑量組Hep3B p-SMAD3 PCNA Huh7 0.054 ± 0.003 0.826 ± 0.113 0.067 ± 0.004 1.074 ± 0.077 0.114 ± 0.004 1.144 ± 0.050 0.475 ± 0.029 1.380 ± 0.059 p-SMAD3 PCNA 0.124 ± 0.007 0.695 ± 0.022 0.126 ± 0.004 0.882 ± 0.048 0.127 ± 0.002 0.920 ± 0.048 0.318 ± 0.007 1.282 ± 0.034

3 討論

肝癌是嚴重威脅人類健康的癌癥之一，預計到2025 年肝癌發病人數將超過 100 萬例［2］。2020年，肝癌在46個國家位列癌癥死亡原因的前三名，并且是癌癥導致過早死亡的第二大常見原因［9］。盡管目前肝癌在外科治療、化療、免疫治療等方面均取得一定進展［10-12］，但肝癌的臨床治療效果仍不能達到預期水平。因此，探索肝癌的發生發展機制，尋找新的有效治療靶點，成為肝癌不斷研究的重點。

骨形態發生蛋白是一種多功能的生長因子蛋白，屬于TGF-β 家族［13］，最初發現在骨形成中起作用，因其在多器官中的功能受到關注。BMP 通過跨膜受體由胞質內SMAD 介導參與多種細胞過程的調節［14-15］。當前研究表明BMP5 可能參與多種癌癥的發生［16］。除前述提及的胰腺癌、皮膚病變之外，在腎上腺皮質腺癌中，使用BMP5 重組蛋白處理腫瘤細胞可通過激活SMAD 信號通路抑制癌細胞增殖［17］。但目前BMP5 在肝癌細胞的表達及作用仍不明確，因此本研究首先在正常肝細胞系及肝癌細胞系中進行檢測，BMP5 mRNA 在Hep3B 及Huh7 肝癌細胞系中表達高于正常肝細胞系L02，提示BMP5可能參與肝癌的發生。

鑒于BMP5 是一種分泌型蛋白，BMP5 在胞外可通過與膜受體結合進行跨膜信號轉導，因此我們采用rh-BMP5 進一步研究BMP5 對肝癌細胞生物學特征的影響。我們選取兩種常用的人肝癌細胞系Hep3B 和Huh7 進行體外實驗，觀察不同濃度rh-BMP5 對肝癌細胞增殖、凋亡及遷移等生物學特性的影響。結果顯示中劑量組（10 ng/mL）及高劑量組（100 ng/mL）的rh-BMP5 對Hep3B 和Huh7 增殖均有促進作用，而在低劑量組（1 ng/mL）中，細胞活力在培養24 h 和48 h 與NC 組相比無統計學差異，提示BMP5 對腫瘤細胞增殖的作用可能與其濃度有關。與細胞增殖類似，在凋亡方面，高劑量rh-BMP5能顯著抑制肝癌細胞凋亡，而低劑量組與NC 組相比無統計學差異。劃痕實驗顯示，高劑量rh-BMP5對肝癌細胞遷移能力具有促進作用，并且與處理時間有關，在24 h時即可促進細胞遷移，且在48 h時更為明顯。本研究結果顯示BMP5 能夠促進肝癌細胞增殖及遷移，并抑制細胞凋亡，提示BMP5 可能對肝癌細胞惡性生物學行為有促進作用。

我們進一步研究BMP5 對下游信號通路的影響。在依賴SMAD 的經典BMP 信號通路中，BMP 配體與靶細胞表面的BMPⅠ型和Ⅱ型絲/蘇氨酸激酶受體結合發揮其細胞效應［14，18］。BMPⅡ型受體具有激酶活性，在BMP 信號誘導的受體復合物形成后可以磷酸化Ⅰ型受體，而Ⅰ型受體的激活會進一步磷酸化胞內的受體調控SMAD（R-SMAD），并募集SMAD4，易位進入細胞核［18-20］，與 DNA 結合，作為轉錄因子參與下游靶基因轉錄調節［21］。JIN 等［22］研究發現，BMP5 處理乳腺癌細胞系可增加磷酸化SMAD1/5/9 的表達。外源性BMP2 可誘導膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的小鼠和人類癌細胞系模型SMAD2 和/或SMAD3 磷酸化，入核并誘導下游靶基因表達［23］。說明不同BMPs 可能通過不同下游SMADs 分子發揮生物學效應。Western blotting 結果顯示，高劑量組rh-BMP5 處理肝癌細胞后p-SMAD3 升高，說明BMP5 可能通過SMAD3 活化行使其生物學效應。此外，對增殖相關蛋白PCNA 的檢測顯示，BMP5 處理可增加PCNA 的表達，這與前述BMP5 促進肝癌細胞增殖的結果一致。

值得注意的是，雖然BMP5 對Hep3B 和Huh7 細胞生物學特性的促進作用趨勢總體一致，但Hep3B和Huh7 對BMP5 的反應性存在差異。在細胞增殖方面，高劑量BMP5 對Hep3B 細胞活力的促進作用相較于Huh7 更加明顯，可增加Hep3B 細胞活力1 倍以上；而在SMAD3磷酸化方面，BMP5誘導Hep3B中SMAD3 的活化也較Huh7 更為顯著。我們推測這可能是由于Hep3B 和Huh7 細胞系在來源上具有異質性，與Hep3B 相比，Huh7 存在更高的基線BMP5 表達，因此對外源性BMP5的反應性低于Hep3B細胞。綜上所述，BMP5 在肝癌細胞系中表達升高，具有促進肝癌細胞增殖及遷移、抑制細胞凋亡的作用，并能增加SMAD3 磷酸化，提示BMP5 在肝癌中具有潛在的促癌作用，但其臨床價值及深入分子機制仍需進一步研究闡明。