血清miR-223、IL-6水平與復雜型熱性驚厥患兒腦損傷的關系

李婉晨，孫欣榮

1 西安醫學院研究生院臨床醫學系，西安 710068；2 商洛市中心醫院兒科；3 西安市兒童醫院呼吸科

熱性驚厥（FS）是一種以肢體顫抖或僵硬為主要臨床表現的神經系統疾病，也是最常見的兒童驚厥原因，患病率為3%～5%［1］。復雜型熱性驚厥（CFS）是小兒FS 最嚴重的類型，占20%～30%，驚厥發作頻率較單純型FS 增多，易導致腦損傷，給患兒生命健康造成嚴重后果［2］。CFS 患兒腦損傷機制復雜，但多項研究證實神經炎癥反應在其中發揮重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）能通過調控神經炎癥反應參與FS 過程［4］。miR-223 是一種炎癥反應相關的miRNA，已被報道可參與創傷性腦損傷、腦膜炎等神經炎癥反應過程［5-6］。有學者通過分析FS 患兒miRNA 表達譜發現，miR-223 在FS 患兒血清中水平降低［7］。白細胞介素-6（IL-6）是一種炎癥調節因子，能通過調節多種炎癥細胞和信號通路促進神經炎癥發生發展［8］。研究報道，IL-6 基因多態性與小兒FS 易感性有關［9］。然而關于血清miR-223、IL-6與CFS 患兒腦損傷的關系仍不明確。2021年1月—2023 年8 月，我們探討了血清miR-223、IL-6 水平與CFS 患兒腦損傷的關系，以期為降低CFS 患兒腦損傷提供更多理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021 年1 月—2023 年5 月我院收治的124 例CFS 患兒（CFS 組），CFS 組納入標準：①年齡≤12 歲；②符合《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識（2017實用版）》［10］CFS診斷標準；③首次發??；④經患兒監護人同意并簽署同意書；⑤資料完整。排除標準：①其他FS類型；②合并腦膜炎、腦血管畸形、顱骨骨折、中毒性腦病、癲癇等神經系統疾病，或神經系統疾病史；③遺傳代謝病、急性中毒等其他原因所致驚厥；④既往有驚厥發作史；⑤先天性免疫缺陷；⑥血液系統疾??；⑦惡性腫瘤患兒。CFS組男81 例、女43 例，年齡5 個月～7 歲，病程1～6 d；發熱原因：中毒性菌痢者13例、急性胃腸炎者16例、上呼吸道感染者84 例、其他11 例。發熱體溫＜38.5 ℃者31 例、38.5～40 ℃者79 例、＞40 ℃者15例。另選取46例入院體檢的健康兒童（對照組），納入標準：無肝腎功能異常，無原發性心臟病、心臟瓣膜性疾病，無血液系統疾病、自身免疫系統疾病及其他代謝性疾??；排除標準：神經系統發育異常、神經發育遲緩、顱腦外傷及腦水腫。對照組男30 例、女16例，年齡6個月～7歲。兩組年齡和性別具有可比性（P>0.05）。根據CFS患兒發病后2周內是否發生腦損傷將CFS患兒分為腦損傷組和無腦損傷組。驚厥性腦損傷定義：排除其他原因所致腦損傷，于驚厥發作后出現的精神神經癥候群（神經癥狀、癲癇等），并經腦電圖檢查發現明顯異常［11］。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 血清miR-223、IL-6 檢測 收集CFS 組入院時和對照組體檢時空腹靜脈血2 mL，以1500×g 離心15 min（半徑10 cm），取上層血清保存于兩支試劑管中，一管使用北京興怡雅創生物技術有限公司提供的酶聯免疫吸附法試劑盒（編號：YAD8699）檢測IL-6。另一管用TRIzol 法（上海聯碩生物科技有限公司，編號：TRIzol 15596026）提取血清總RNA，鑒定純度合格后（賽默飛世爾科技公司生產的ND-LITE-PR 紫外可見分光光度計），TaKaRa 法（上海北諾生物科技有限公司，編號：l111042）反轉錄為互補DNA。以互補DNA 為模板、U6 為內參，根據SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒（美國MCE，編號：HY-K0501A）說明書進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應，血清miR-223 水平以2-ΔΔCT法計算。北京睿博興科生物技術有限公司設計合成引物，miR-223正向引物5'-GGCAGCACCCCATAAACTGTT-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGTCGTGGAG-3'；U6正向引物5'-CGAATCCATTCAAATCCGGGATCCG-3'，反向引物5'-AAGGCATTCAATCGGACTTAC-3'。反應體積：互補DNA 2 μL、2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.8 μL、無菌超純水加至總體積20 μL；反應條件：95 ℃ 10 min 1 次，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s 40次。

1.3 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。計量資料若為正態分布以±s±s表示，兩組比較行t檢驗；若為偏態分布則以M（P25，P75）表示，兩組比較行U檢驗。計數資料例（%）表示，比較行χ2檢驗；CFS 患者血清miR-223與IL-6水平的相關性用Spearman 相關性分析；影響CFS患兒腦損傷的因素用多因素Logistic 回歸分析；血清miR-223、IL-6 水平對CFS 患兒腦損傷的預測價值用受試者工作特征（ROC）曲線分析，Delong 檢驗比較血清miR-223、IL-6 水平單獨與聯合預測CFS患兒腦損傷的曲線下面積（AUC）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFS 組與對照組血清miR-223、IL-6 水平比較 CFS組與對照組血清miR-223水平分別為0.81 ±0.12、1.32 ± 0.21，IL-6 水平分別為25.48（14.36，37.40）、4.52（3.46，5.68）ng/mL。與對照組比較，CFS組血清miR-223水平降低，IL-6水平升高（P均＜0.05）。

2.2 CFS患者血清miR-223與IL-6水平的相關性Spearman 相關性分析顯示，CFS 患兒血清miR-223與IL-6 水平呈負相關（r=-0.800，95%CI：-0.857～-0.723，P＜0.05）。

2.3 腦損傷組與無腦損傷組臨床資料比較 124例CFS患兒發生腦損傷39例，腦損傷發生率為31.45%（39/124）。腦損傷組病程長于無腦損傷組，全身抽搐、發熱體溫>40 ℃、驚厥發作次數≥2次、驚厥發作持續時間≥5 min 比例和IL-6 水平高于無腦損傷組，miR-223水平低于無腦損傷組（P均＜0.05），兩組其他資料比較差異無統計學意義（P均>0.05）。見表1。

表1 腦損傷組與無腦損傷組臨床資料比較

2.4 影響CFS 患兒腦損傷的多因素Logistic 回歸分析結果 以CFS患兒腦損傷（是/否=1/0）為因變量，以表1有統計學差異的因素（P＜0.05）：病程（原值錄入）、抽搐范圍（全身/局部=1/0）、發熱體溫（＜38.5 ℃/38.5～40 ℃/>40 ℃=1/2/3）、驚厥發作次數（≥2 次/＜2 次=1/0）、驚厥發作持續時間（≥5 min/＜5 min=1/0）、miR-223（原值錄入）、IL-6（原值錄入）為自變量，建立影響CFS 患兒腦損傷的多因素Logistic回歸模型。結果顯示，全身抽搐、驚厥發作次數≥2次、驚厥發作持續時間≥5 min、IL-6 升高為CFS 患兒腦損傷的獨立危險因素，miR-223 升高為獨立保護因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響CFS患兒腦損傷的多因素Logistic回歸分析結果

2.5 血清miR-223、IL-6 水平對CFS 患兒腦損傷的預測價值 繪制血清miR-223、IL-6水平單獨與聯合預測CFS患兒腦損傷的ROC曲線。血清miR-223、IL-6水平聯合預測CFS患兒腦損傷的AUC為0.899，大于血清miR-223、IL-6 水平單獨預測的0.803、0.780（Z分別為2.351、2.553，P均＜0.05）。見表3。

表3 血清miR-223、IL-6水平對CFS患兒腦損傷的預測價值

3 討論

FS是由發熱（腋溫≥38 ℃或肛溫≥38.5 ℃）引起的驚厥發作，主要由病毒感染所致，小兒由于神經系統發育不完善、神經興奮易擴散或泛化，在發熱后極易引起腦組織化學成分變化導致驚厥發作，盡管多數FS患兒驚厥發作時間短暫（1～3 min），病程具有自限性，預后較好，但CFS患兒驚厥發作時間較長且常反復發作，極易損傷神經系統功能導致腦損傷，甚至誘發癲癇［12-13］。發熱是CFS的病理基礎，但發熱體溫并不能較好地預測腦損傷發生，因此還需探索其他可靠指標，以促進腦損傷早期診斷，改善患兒預后。

神經炎癥反應參與CFS 的發生發展，各種原因所致發熱可激活和刺激神經系統中熱原途徑促炎細胞因子釋放，導致神經炎癥反應發生，神經炎癥反應不僅能破壞體溫調節中樞導致體溫進一步上升，還能誘導神經元凋亡或引起神經元異常放電等導致腦損傷發生［14］。miRNA 能通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯端中的互補序列結合來抑制靶基因的表達，從而調控神經炎癥反應［15］。miR-223 定位于人染色體Xq12，近年來研究報道其與神經炎癥反應有關。在缺血再灌注建立的急性腦梗死大鼠模型中，上調miR-223 能減少腦組織炎性細胞因子釋放，抑制神經系統炎癥反應［16］。在慢性不可預知性溫和應激建立的抑郁小鼠模型中，上調miR-223 能抑制NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）信號通路抑制海馬組織炎癥反應［17］。上述研究提示miR-223 具有抑制神經炎癥反應的作用。WU 等［18］實驗報道，上調miR-223 表達能抑制神經元凋亡，縮短大鼠驚厥持續時間。同時有報道指出，FS 患兒血清miR-223水平降低［7］。因此推測血清miR-223可能與CFS患兒腦損傷有關。本研究結果顯示，CFS 患兒血清miR-223 水平降低，miR-223 升高為CFS患兒腦損傷的獨立保護因素，提示血清miR-223水平升高能降低CFS患兒腦損傷風險，其機制可能與miR-223能抑制NLRP3/半胱天冬酶-1（Caspase-1）信號通路有關。NLRP3/Caspase-1 是神經炎癥反應重要信號通路，能促進促炎細胞因子轉錄并介導細胞焦亡［19］。最近WANG 等［20］實驗報道，上調miR-223 表達能抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路激活，減少海馬神經元炎癥損傷和凋亡，進而減輕大鼠驚厥發作，并提升學習記憶能力。

IL-6 是由多種細胞表達的一種可溶性蛋白，生理狀態下呈低表達，在各種病理刺激下可大量釋放，通過結合IL-6受體和糖蛋白130（gp130），啟動Janus激酶（JAK）磷酸化，以此激活JAK/信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT）參與炎癥反應過程［21］。研究報道，IL-6參與腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、癲癇等神經炎癥疾病過程［22-24］。實驗報道，IL-6 在FS 小鼠腦組織中高表達，下調IL-6能縮短驚厥持續時間［25］。臨床研究指出，CFS 患兒血清IL-6 水平較單純型FS升高［26］。然而關于血清IL-6水平與CFS患兒腦損傷的關系尚不明確。本研究結果顯示，CFS 患兒血清IL-6 水平升高，IL-6 升高為CFS 患兒腦損傷的獨立危險因素，提示血清IL-6 水平升高會增加CFS 患兒腦損傷風險，其機制可能是IL-6 能激活JAK/STAT信號通路，引發炎癥級聯反應，加重神經炎癥反應，導致CFS 患兒腦損傷風險增加［27］。此外，IL-6 作為一種致熱原性的細胞因子，其水平升高可進一步破壞體溫調節中樞，加劇神經功能損害而增加CFS 患兒腦損傷風險［14］。WANG 等［28］研究顯示，抑制FS小鼠海馬IL-6表達能改善腦損傷。

本研究相關性分析發現，CFS患兒血清miR-223與IL-6 水平呈負相關，說明miR-223 與IL-6 可能共同參與CFS 過程，考慮原因可能與miR-223 能抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路減少IL-6 表達有關［19］。二者具體關系還需進一步實驗證實。本研究結果顯示，全身抽搐、驚厥發作次數≥2 次、驚厥發作持續時間≥5 min 為CFS 患兒腦損傷的獨立危險因素，其可能原因：全身抽搐、驚厥發作次數越多、驚厥發作持續時間越長反映CFS 患兒病情更嚴重，因此腦損傷風險更高。本研究ROC 曲線顯示，血清miR-223、IL-6 水平最佳截斷值為0.82、24.85 ng/mL 時，預測CFS 患兒腦損傷的AUC分別為0.803、0.780，血清miR-223、IL-6 水平聯合預測的AUC為0.899，較血清miR-223、IL-6水平單獨預測顯著升高。提示血清miR-223、IL-6 水平可能成為CFS 患兒腦損傷的輔助預測指標，有助于指導臨床制定措施降低CFS 患兒腦損傷風險。

綜上所述，CFS患兒血清miR-223水平降低，IL-6水平升高，與腦損傷發生密切相關；血清miR-223、IL-6 水平聯合對CFS 患兒腦損傷的預測價值較高。但本研究存在選擇偏倚和樣本量小等不足，有待進一步擴大樣本量研究。