miR-27a靶向調控SFRP1對結直腸癌生物學行為的影響

司馬學琴,蘇延停,曾 智

流行病學研究[1]顯示,結直腸癌作為胃腸道腫瘤疾病,其發病率和病死率逐年上升。目前,結直腸癌治療常采用手術結合放化療,但療效有限[2-3]。尋找新的治療靶點,抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移成為近年研究熱點。微小RNA(miRNAs)是一組存在于真核生物中長度約為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA,可與相關靶基因的3′端非翻譯區結合,抑制其轉錄、翻譯過程,發揮調控作用[4-5]。miR-27a作為miRNA的成員之一,位于19號染色體,具有多種生物學功能,參與了腫瘤的發生發展。既往研究[6]顯示,miR-27a在乳腺癌中表達異常,與乳腺癌惡性程度和預后相關。研究[7]顯示,miR-27a在結腸癌中表達上調,能增強結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。分泌卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)作為Wnt信號轉導的負性調控者,在結直腸癌中表達下調[8]。miR-27a是否能通過靶向活化SFRP1從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等過程尚不明確。該研究旨在探討miR-27a在直腸癌中的表達,并分析其是否能夠通過靶向調控SFRP1對直腸癌細胞生物學行為產生影響。

1 材料與方法

1.1 方法

1.1.1臨床樣本 取咸寧市中心醫院2021年1月—12月行手術切除術的24例結直腸癌患者癌變組織和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處)于液氮中-70 ℃凍存備用?；颊咝g前均未做任何形式的放化療。所有患者均知情簽署知情同意書,本研究由咸寧市中心醫院倫理委員會審核批準(倫理批號:202011025)。

1.1.2主要材料 人結直腸癌細胞系HCT116購自中科院上海細胞庫。胎牛血清(貨號:12483020)和DMEM培養基(貨號:11965092)購自美國Gibco公司;RT Master Mix(貨號:FSQ-201)與SYBR Green Real-time PCR Master Mix(貨號:QPK-201)購自東洋紡(上海)公司;抗體SFRP1(貨號:ab126613)和Wnt4(貨號:ab277798)購自Abcam(上海)貿易有限公司;抗體β-catenin(貨號:AC106)、GAPDH(貨號:AF1186)、辣根酶標記的山羊抗兔IgG(貨號:A0208)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0012)、SDS-聚丙烯酰胺試劑盒(貨號:P0012AC)、0.25%胰蛋白酶(貨號:C0201)、TRIzol(貨號:R0016)和結晶紫染液(貨號:C0121-100ml)購自上海碧云天生物技術有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:G1701-100T)購自武漢塞維爾生物技術有限公司;Transwell小室(貨號:354480)購自北京優尼康生物科技有限公司;miR-27a、SFRP1、U6內參引物,miR-27a模擬物(miR-27a mimic)、miR-27a抑制劑(miR-27a inhibitor)和陰性對照(negtive control,NC),SFRP1野生型和突變型的熒光素酶報告載體均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司;LipofectaminTM2000(貨號:11668030)轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.1.3 主要儀器CO2全濕度培養箱(型號:HHCP-160S)購自上海沃爾福實業有限公司;高速離心機(型號:TDI-16)購自上海醫用分析儀器廠;實時熒光定量PCR儀(型號:CFX Connect)、垂直電泳槽(型號:1658033)、轉膜儀(型號:Trans-Blot Turbo)購自美國BioRad公司;倒置熒光顯微鏡(CKX41)購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染 在恒溫37 ℃及5%CO2的全濕度培養箱環境下,采用DMEM培養基(含10%胎牛血清)培養HCT116細胞。當細胞密度達到70%后,用0.25%胰蛋白酶消化,每孔1×105個細胞接種于6孔板中,根據LipofectamineTM2000轉染試劑說明書及操作步驟,將miR-27a mimic(miR-27a mimics組)、miR-27a inhibitor(miR-27a inhibitor組)和NC(NC組)分別轉染至HCT116細胞中,混勻,室溫靜置15 min,培養48 h,當培養基中HCT116細胞匯合度達到80%后收集各組細胞。

1.2.2MTT實驗檢測各組細胞增殖活性 取處于對數生長期的各組HCT116細胞,接種于48孔板中,每孔細胞設置為1×105個/ml,在恒溫37 ℃、5%CO2條件下培養。分別在培養24、48、72和96 h后,各孔添加20 μl MTT溶液,孵育4 h后取上清液,與50 μl二甲基亞砜混溶。測定各孔細胞光密度(optical density,OD)值(酶標儀設置波長490 nm),計算細胞增殖情況。

1.2.3Transwell實驗檢測各組細胞侵襲、遷移情況 取處于對數生長期的各組HCT116細胞,0.25%胰蛋白酶進行消化,將細胞(1×105個)添加于Transwell上室中,細胞侵襲實驗需要在Transwell中加入基質膠,而遷移實驗無需加入基質膠。下室填充無血清DMEM培養基,培養24 h。吸去無血清培養基后,刮去上表面的貼壁細胞,多聚甲醛固定細胞,結晶紫染色,20 min后鏡下取5個隨機視野,對侵入小室的細胞進行計數,評估細胞侵襲、遷移情況。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測miR-27a和SFRP1 mRNA表達水平 使用TRIzol提取結直腸癌組織、癌旁正常組織和各組HCT116細胞中的總RNA,然后采用RT Master Mix逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA,用SYBR Green Real-time PCR Master Mix進行擴增,設置3個復孔測定miR-27a、SFRP1 mRNA表達水平。以U6為內參,miR-27a、SFRP1引物序列如表1所示。qRT-PCR反應體系20 μl(10 μl Mix、1 μl正向引物、1 μl反向引物、1 μl cDNA和 7 μl H2O),反應條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30s;循環40次。測定結果采用2-ΔΔCT法計算各物質的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5Western blot檢測SFRP1、Wnt4、β-catenin蛋白表達 提取結直腸癌組織、癌旁正常組織和HCT116各處理組細胞中的蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度后,加入緩沖液進行沸水浴10 min。取20 μl樣品(蛋白量45 μg)上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳,設置參數分離蛋白,濕法轉膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h,再分別加入用TBST溶液稀釋的SFRP1(1∶10 00)、Wnt4((1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 00)抗體,4 ℃孵育過夜,加入辣根酶標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后,洗膜3次,化學發光液顯影,采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。所有測定重復3次。

1.2.6TargetScan軟件預測miR-27a與SFRP1的結合位點以及雙熒光素酶實驗報告實驗 TargetScan在線軟件預測miR-27a與SFRP1的3′UTR區域結合位點。構建突變型(SFRP1-MUT-3′UTR)質粒和野生型(SFRP1-WT-3′UTR)質粒。按照LipofectaminTM2000轉染試劑盒說明,將突變型質粒分別與miR-27a mimic或NC共轉染至HCT116細胞,將野生型質粒分別與miR-27a mimic或NC共轉染至HCT116細胞,48 h后根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-27a和SFRP1在結直腸癌組織中的表達qRT-PCR檢測結果如圖1A所示,與癌旁正常組織相比,miR-27a在結直腸癌組織中高表達(t=7.624,P<0.05);而SFRP1 mRNA在結直腸癌組織中低表達(t=4.574,P<0.05)。Western blot結果如圖1B所示,與癌旁正常組織相比,SFRP1在結直腸癌組織中低表達(t=3.013,P<0.05)。

圖1 結直腸癌組織中miR-27a和SFRP1表達的比較

2.2 結直腸癌細胞中miR-27a上調和下調對SFRP1 mRNA水平的影響qRT-PCR檢測結果顯示,與NC組相比,miR-27a mimic組中miR-27a表達增加(t=6.332,P<0.05),miR-27a inhibior組中miR-27a表達下降(t=4.021,P<0.05),表明miR-27a mimic和miR-27a inhibior轉染成功;與NC組相比,miR-27a上調后SFRP1 mRNA的表達水平降低(t=5.376,P<0.05),miR-27a下調后SFRP1 mRNA的表達水平提升(t=5.685、6.027,均P<0.05),提示miR-27a可能負向調控SFRP1。見圖2。

圖2 結直腸癌細胞中miR-27a上調和下調對SFRP1 mRNA水平的影響

2.3 miR-27a靶向作用SFRP1TargetScan軟件顯示miR-27a和SFRP1的3′UTR存在結合位點(如圖3A所示)。雙熒光素酶報告實驗顯示,與NC組(SFRP1野生型質粒和NC共轉染)比較,SFRP1野生型質粒和miR-27a mimic共轉染后,熒光素酶活性降低(t=4.921,P<0.05);而SFRP1突變型質粒和miR-27a mimic質粒共轉染后,與NC組(SFRP1突變型質粒和NC共轉染)比較,熒光素酶活性無差異(t=1.036,P>0.05),見圖3B。提示miR-27a可靶向調控SFRP1表達。

圖3 miR-27a對SFRP1的靶向調控作用

2.4 各組HCT116細胞增殖活性的比較MTT實驗結果如圖4所示,24 h后,各組細胞增殖活性有差異(F=63.207,P<0.01)。與NC組相比,miR-27a mimic組細胞增殖活性升高(t48 h=4.519,t72 h=5.582,t96 h=6.173,均P<0.05);與miR-27a mimic組相比,miR-27a inhibitor組細胞增殖活性降低(t48 h=8.836,t72 h=11.265,t96 h=9.357,均P<0.05)。

圖4 各組細胞增殖情況的比較

2.5 各組HCT116細胞侵襲、遷移能力的比較Transwell小室侵襲實驗結果如圖5所示,與NC組(116.00±12.83)相比,miR-27a mimic組侵襲能力(158±15.67)提升(t=8.217,P<0.01);與miR-27a mimic組相比,miR-27a inhibitor組侵襲能力(82±9.75)降低(t=13.728,P<0.01)。此外Transwell小室遷移實驗結果如圖6所示,與NC組(249±12.37)相比,miR-27a mimic組遷移能力(305±16.78)提升(t=9.519,P<0.01);與miR-27a mimic組相比,miR-27a inhibitor組遷移能力(176±10.84)降低(t=17.352,P<0.01)。表明上調miR-27a可促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移能力,下調miR-27a可抑制結直腸癌細胞的侵襲和遷移能力。

圖5 各組細胞侵襲情況的比較

圖6 各組細胞遷移情況的比較

2.6 miR-27a調控Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達Western blot結果如圖7所示,與NC組比較,miR-27a mimic組SFRP1蛋白表達水平降低,而Wnt4和β-catenin蛋白表達水平升高(tSFRP1=3.252,tWnt4=3.827,tβ-catenin=5.185,均P<0.05);與miR-27a mimic組比較,miR-27a inhibitor組SFRP1蛋白表達水平升高,而Wnt4和β-catenin蛋白表達水平升高降低(tSFRP1=5.952,tWnt4=4.374,tβ-catenin=5.473,均P<0.05)。提示miR-27a可下調SFRP1表達,增加Wnt/β-catenin信號通路活性。

圖7 Western blot檢測SFRP1和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的比較

3 討論

我國結直腸癌發病率逐年遞增,尤其是在中老年人群中,近年發病人數不斷增加,嚴重威脅患者的生命健康。研究[9]表明,miRNA在惡性腫瘤的發生發展過程中通過參與多種細胞因子的轉錄和表達發揮重要作用。miRNA也通過類似途徑誘導結直腸癌腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。因此,抑制相關miRNA的活性成為近年結直腸癌治療的新靶點,也為臨床靶向治療提供了新方向。

miR-27a在卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]中表達異常升高,具有一定的促癌作用。本研究結果顯示,結直腸癌患者癌變組織中miR-27a 表達水平高于癌旁正常組織,提示miR-27a可能作為促癌因子發揮作用。

研究[14]表明SFRP1是miR-27a下游的作用靶點之一,miR-27a可抑制SFRP1活性,促進腫瘤細胞的增殖和侵襲遷移等。本研究顯示結直腸癌組織中SFRP1 mRNA和蛋白表達水平均低于癌旁正常組,并在細胞水平評估了miR-27a inhibitor和miR-27a mimics的影響,結果顯示,給予miR-27a mimic轉染HCT116細胞后,SFRP1 mRNA表達下調;而HCT116細胞在轉染miR-27a inhibitor后,SFRP1 表達增加。此外,熒光素酶報告基因實驗進一步證明miR27-a能夠靶向調控SFRP1。Qiao et al[15]研究發現miR-27a通過靶向SFRP1蛋白,調節Wnt/β-catenin信號通路,促進口腔鱗狀癌細胞的上皮間質轉化。為了進一步研究Wnt/β-catenin信號通路是否參與miR-27a在結直腸癌中的作用,本研究采用Western blot檢測miR-27a上調和下調對HCT116細胞中Wnt4和β-catenin蛋白的影響,發現上調miR-27a后可靶向抑制SFRP1活性,激活了Wnt/β-catenin信號通路,促進腫瘤細胞的增殖和侵襲過程;下調miR-27a可靶向激活SFRP1,SFRP1上調可抑制Wnt4、β-catenin等信號分子蛋白的表達,相關的轉錄翻譯過程被中斷,腫瘤細胞增殖和侵襲過程被抑制,MTT和Transwell實驗也證明miR27a能夠促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學過程。

綜上所述,下調miR-27a能靶向激活SFRP1活性,抑制結直腸癌細胞的增殖及侵襲等生物學過程,其主要是通過上調SFRP1,阻斷下游的Wnt/β-catenin信號通路發揮抑癌作用。本研究為結直腸癌的臨床治療提供了新方向。后續將進一步結合動物實驗,深入研究SFRP1在結腸癌中的作用機制。