長時程亞低溫聯合復方腦肽節苷脂注射液對顱腦創傷大鼠的神經行為學影響

趙萬勇,徐書剛,王景景,李曉紅,孫洪濤

顱腦創傷(traumatic brain injury,TBI)是導致人類死亡和致殘的主要原因之一,給社會和家庭帶來了沉重的負擔[1-2]。亞低溫(mild hypothermia,MHT)通過減輕腦水腫,保護血腦屏障,促進內源性神經再生,減輕炎癥反應和抑制神經元細胞凋亡等作用機制,在臨床研究和動物實驗中均表現出一定的治療作用[3-4]。復方腦肽節苷脂注射液(compound porcine cerebroside and ganglioside injection,CPCGI)是一種神經營養藥物,參與神經元的生長、分化和再生,促進血液循環和新陳代謝[5],已廣泛用于腦缺血和阿爾茨海默病的治療中[6-7]。

最近發現長時程的MHT療法在TBI的治療中具有更積極的神經保護作用[8],同時有研究[9]表明CPCGI通過控制內源性細胞防御氧化應激機制發揮腦損傷后的保護效應,然而長時程MHT療法聯合CPCGI的治療研究相對較少。因此,該文旨在探討長時程MHT聯合復方腦肽節苷脂治療對TBI大鼠的神經行為學影響并研究其可能的作用機制,以期為TBI的臨床治療提供新的策略和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 復方腦肽節苷脂注射液(吉林步長制藥有限公司,貨號:210322),微管相關蛋白(doublecortin,DCX)抗體、神經元特異性核蛋白(neuronal nuclear,NeuN)抗體、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine proteinase-3,Caspase-3)抗體(美國Proteintech公司,貨號:2088476、20880708、2227948、2061561、2876892),5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(德國Sigma公司,貨號:SAB4701040、D9542),山羊抗兔二抗 IgG(美國Abcam公司,貨號:WK364),488熒光二抗、568熒光二抗(美國Invitrogen公司,貨號:A-11008、A-21124),BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司,貨號:23225),水合氯醛、多聚甲醛(天津索羅門生物科技有限公司,貨號:110432、163101)。

1.1.2主要儀器 亞低溫治療儀(中國珠海黑馬公司,型號:T1型),電子可控性皮質損傷裝置(美國Custom Design &Fabrication公司,型號:eCCI),Morris水迷宮設備(淮北正華生物儀器設備公司,型號:BW-MWM101),冰凍切片機、倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司,型號:HS-1205、MHY-28315),轉膜儀(美國BIO-RAD公司,型號:DBZY)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物與分組 36只健康成年雄性SD大鼠[許可證號:SCXK(京)2019-0010]由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,體質量為(220±10)g,室溫20～24 ℃,相對濕度55%～60%,光照時間7:00—19:00,大鼠在動物房適應性飼養 7 d 后開始實驗。隨機數字表法將大鼠隨機分為TBI模型組、僅給予MHT治療(MHT)組、僅給予CPCGI治療(CPCGI)組、同時給予MHT和CPCGI治療(MHT+CPCGI)組,每組9只。

1.2.2TBI模型的制備 根據既往造模方法[10]進行造模,所有大鼠造模前12 h禁食,按50 mg/100 g經腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉,然后將其俯臥位固定于立體定向頭架上,頭部備皮消毒完畢后于中線切開頭皮,剝離骨膜暴露右側頂骨。以前囟為原點,向后1.5～2.0 mm旁開1.2 mm為圓心,顱鉆鉆孔磨開5 mm直徑骨窗,暴露硬腦膜并保持其完整。各組分別通過電子可控性皮質損傷(electronic controllable cortical injurye,eCCI)裝置,按照深度1.6 mm,撞擊速度4.5 m/s,停留時間120 ms給予鉆孔部位打擊損傷。大鼠造模后連續5 d腹腔注射BrdU用于標記新生有絲分裂細胞。

1.2.3CPCGI腹腔注射和亞低溫治療 將 CPCGI 溶于 0.9% 的生理鹽水(normal saline,NS)中,TBI造模后TBI模型組大鼠腹腔注射等量NS(2 ml/kg)并給予常溫(37 ℃)治療48 h,MHT組大鼠腹腔注射等量NS并給予亞低溫(33.0±1.0)℃治療48 h,CPCGI組大鼠腹腔注射等量CPCGI[9]并給予常溫治療48 h,MHT+CPCGI組大鼠腹腔注射等量CPCGI并給予亞低溫治療48 h。

1.2.4行為學實驗

1.2.4.1大鼠改良神經功能缺損評分(modified neurological severity score,mNSS) 參照文獻[11]建立的mNSS評分量表,TBI 大鼠腹腔注射BrdU結束后3 d對各組大鼠進行感覺、運動、提尾、平衡木和反射評分。根據評分量表,缺少一項反射或者動物不能完成一項任務給1分。

1.2.4.2Morris水迷宮實驗 各組大鼠游泳訓練達標后1周進行水迷宮實驗,記錄每只大鼠入水尋找隱藏在水面下的平臺的平均時間(即逃避潛伏期);各組大鼠由距平臺最遠的象限入水點頭朝池壁放入水中,記錄90 s內穿越平臺的次數,并記錄統計其在目標象限(即平臺所在象限)的百分率。

1.2.4.3橫桿跑動實驗(beam walking test,BWT) 和斜坡爬壁實驗 TBI大鼠腹腔注射BrdU結束后3 d給予聲光刺激測試大鼠在有障礙物的杠桿跑道上行進的距離,行走距離的評分標準為:0分表示無法行走,1～4分表示距起點20、40、60、80 cm的距離,5分表示穿過整個跑道進入暗盒中,分別記錄各組大鼠的得分情況;同時記錄各組大鼠在木板2個不同的位置可以維持軀體5 s時木板和地面形成的最大角度,每組大鼠進行3次評分,最終取平均值。

1.2.5尼氏染色 大鼠斷頭取材后,取腦皮質損傷區組織用甲醛固定后進行石蠟包埋。石蠟包埋組織行冠狀切片后用二甲苯脫蠟并進行梯度乙醇水化,然后將切片用尼氏染色液染色5 min,染色后再經脫水和透明后進行封片鏡檢。取相應海馬CA3區作為觀察區域,在400倍視野下隨機選取3個視野,分別計數顯示神經元細胞數,最后算出3個視野的平均細胞數。

1.2.6免疫熒光染色檢測大鼠腦組織中DCX、BrdU和NeuN表達水平 本研究使用BrdU標記新生細胞反映神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的增殖,并對成熟神經元進行抗NeuN抗體標記。大鼠斷頭取材,4%甲醛溶液固定24 h。使用冰凍切片機按25 μm厚度進行切片,滴加一抗DCX(1∶100)、BrdU(1∶100)和NeuN(1∶200)室溫孵育1 h,滴加488熒光二抗(1∶200)和568熒光二抗(1∶200)室溫孵育30 min后檢測免疫反應。取相應海馬區作為觀察區域,在400倍視野下隨機選取3個視野,分別計數DCX和NeuN熒光陽性的細胞數,最后算出3個視野的平均DCX和NeuN陽性細胞數,同理計算NeuN/BrdU雙標記陽性細胞數。

1.2.7Western blot 檢測大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達 大鼠斷頭取腦,在冰浴中快速將損傷側腦組織加入細胞裂解液中,組織經勻漿破碎后,用 BCA 法進行蛋白定量,10% SDS-PAGE凝膠電泳,NC轉膜。雜交步驟如下:5%脫脂牛奶封閉NC膜1 h,1×TBST洗10 min×3次,然后室溫下與Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)和Caspase-3 (1∶600)雜交反應1 h,TBST 漂洗同前。再將NC膜與山羊抗兔二抗 IgG(1∶2 000)在室溫下雜交反應1 h,最后用TBST洗NC膜10 min×3次。NC膜滴加1∶1配制的顯影A液和B液,利用BIO-RAD 凝膠成像系統進行顯影。使用ScnImage軟件進行目的蛋白和內參的灰度值測定,得出目的蛋白相對灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分結果為了評估大鼠的感覺運動等功能的恢復情況,于TBI大鼠腹腔注射BrdU結束后3 d對大鼠進行神經功能缺損評分。TBI模型組、MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組mNSS評分分別為(9.76±1.63)、(6.33±1.26)、(7.64±1.65)和(5.03±1.32)。與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組神經功能缺損評分均降低(tMHT=4.99,tCPCGI=2.74,tMHT+CPCGI=6.77,均P<0.05),與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組評分均降低(t=2.14、3.71,均P<0.05)。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組逃避潛伏期時間不同程度縮短(t=10.32、5.66、14.00,均P<0.05),與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組逃避潛伏期時間更短(t=4.23、6.91,均P<0.05);與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組跨越平臺次數不同程度升高(t=5.99、3.60、7.94,均P<0.01),與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組跨越平臺次數更高(t=2.51、2.98,均P<0.05);與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組目標象限所占時間百分比不同程度升高(t=5.32、6.13、8.58,均P<0.05),與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組目標象限所占時間百分比更高(t=3.73、5.17,均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、跨越平臺次數和目標象限所占時間百分比的比較

2.3 各組大鼠BWT和斜坡爬壁實驗結果在BWT中,與TBI模型組大鼠相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組大鼠的BWT評分均有提高(t=7.38、4.20、8.57,均P<0.05),與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組的BWT評分均有提高(t=2.25、4.58,均P<0.05)。在斜坡爬壁實驗中,與TBI模型組大鼠相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組大鼠的爬坡角度均有所增加 (t=5.54、6.70、14.20,均P<0.05),而MHT+CPCGI組的爬坡角度更大(t=9.43、5.16,均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BWT評分和爬坡角度比較

2.4 各組大鼠海馬CA3區神經元細胞數表達結果尼氏染色結果顯示,在TBI模型組可見大鼠海馬CA3區神經元明顯缺失和損傷,與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組海馬CA3區神經元細胞數量增多(t=5.93、2.44、12.87,均P<0.05);與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組神經元細胞數量增多(t=4.75、10.21,均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA3區尼氏染色結果 ×200

2.5 各組大鼠DCX和NeuN陽性細胞數表達結果與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組DCX陽性細胞數量增多(t=9.15、3.61、11.15,均P<0.05);與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組DCX陽性細胞數量增加(t=4.27、6.83,均P<0.05)。見圖2。與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組NeuN陽性細胞數量增多(t=2.83、2.21、4.89,均P<0.05);與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組NeuN陽性細胞數量增加(t=2.35、2.85,均P<0.05),與MHT組相比,MHT+CPCGI組NeuN/BrdU雙標記陽性細胞數量增加(t=8.42,P<0.05)。見圖3。

圖2 各組大鼠DCX免疫熒光染色結果 ×200

圖3 各組大鼠NeuN和NeuN/BrdU共標免疫熒光染色結果

2.6 各組大鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3表達結果與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組Bcl-2蛋白表達量增加(t=5.78、3.91、6.47,均P<0.01);與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組Bcl-2表達量增加(t=2.23、4.78,均P<0.05);與TBI模型組相比,MHT組、CPCGI組和MHT+CPCGI組Bax 和Caspase-3蛋白表達量降低(tBax=3.20、2.39、7.45,tCaspase-3=4.68、4.31、9.66,均P<0.05);與MHT組和CPCGI組相比,MHT+CPCGI組Bax和Caspase-3表達量降低(tBax=2.14、5.15,tCaspase-3=3.14、6.63,均P<0.05)。Bcl-2具有抗細胞凋亡的作用,Bax具有促細胞凋亡的作用,Caspase-3是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶,以上結果提示MHT+CPCGI組能進一步上調Bcl-2表達,下調Bax和Caspase-3表達從而抑制細胞凋亡。見圖4。

圖4 各組大鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達的比較

3 討論

MHT療法已成為TBI的重要治療手段之一,因其誘導時機、持續時間以及復溫速度等沒有統一的執行標準且缺乏個體化的治療[12],目前治療效果依舊存在爭議。研究[13]表明,通過延長MHT治療時間至超過48 h,并根據顱內壓的情況個體化選擇復溫時間,能有效改善預后?；诖搜芯?本研究選取48 h的治療時間作為長時程的治療模式來開展研究,結果顯示,與TBI模型組比較,MHT組大鼠的神經功能缺損評分降低,進一步證明了長時程MHT對神經的保護作用。

長時程MHT治療能夠導致凝血功能障礙、低血容量、電解質異常和感染風險增加[8],長期持續低溫狀態產生的副作用可能掩蓋了一部分積極的治療效果。神經營養藥物目前廣泛應用于臨床,在一定程度上能夠促進腦細胞代謝以及神經修復。CPCGI主要組份包括多肽、神經節苷脂、次黃嘌呤等,其作為神經保護劑能夠通過血腦屏障刺激核因子-E2相關因子2信號通路,減輕氧化應激和抑制鈣蛋白酶過度激活等,對TBI具有腦保護作用[9]。本研究通過長時程MHT聯合CPCGI的治療以期彌補長時程MHT產生副作用的缺陷,結果表明兩者聯合治療顯示出更積極的治療作用。

TBI的神經功能缺損涉及多種病理機制,有效的治療應能夠抑制繼發性損傷并擴大內源性神經可塑性,抑制細胞凋亡的發生[14]。海馬區是神經發生的重要部位,與大腦學習記憶等功能密切相關,因此研究TBI誘導的海馬區神經發生對神經功能缺損修復的潛在影響十分必要。微管相關蛋白(doublecortin,DCX)作為在齒狀回由神經干細胞向神經元前體細胞分化的標志物,在神經再生過程中高度表達。本研究結果顯示,與MHT組和CPCGI組相比,在MHT+CPCGI組,DCX和NeuN陽性細胞數明顯升高,在尼氏染色中同樣發現MHT+CPCGI組海馬區神經元數量最多,表明長時程MHT聯合CPCGI能夠明顯促進神經元的生長、增殖和分化進而提高大鼠的行為表現能力。

由Bcl-2蛋白家族構成的內源性凋亡通路在TBI后細胞凋亡的調控中起到重要作用,研究[15]表明,細胞凋亡是一個復雜的級聯過程,多種凋亡通路在其中起著重要作用,通過調節Bcl-2/Bax/Caspase-3凋亡信號通路減少皮質神經元的變性和凋亡,這可能是其神經保護作用的重要機制之一。本研究結果顯示,TBI能夠下調Bcl-2表達,上調Bax表達,進而降低Bcl-2/Bax比值,而MHT和CPCGI能夠逆轉Bcl-2/Bax比值,進一步抑制Caspase-3活化阻礙細胞凋亡的發生;MHT+CPCGI組能夠進一步上調Bcl-2蛋白表達水平,下調Bax和Caspase-3蛋白表達水平,從而有效地抑制凋亡通路Caspase的級聯反應,阻礙程序性凋亡的發生。因此推測,聯合治療通過調節受損細胞的凋亡通路發揮神經保護作用,最終改善大鼠的神經功能缺失。

綜上所述,長時程MHT聯合CPCGI治療能夠促進神經再生和抑制細胞凋亡,有效改善TBI大鼠的神經行為學表現,為TBI臨床治療提供潛在的策略和依據。然而人類大腦的進化程度更高,動物缺乏和人類相同的解剖結構,且顱腦損傷機制較為單一,因此長時程的治療時間也并不完全等同于臨床治療的實際時間。在后續的實驗過程中,應根據治療時間梯度展開研究,明確MHT治療的時間因素對實驗結果的影響,從而更好地為臨床治療提供理論依據。鑒于目前研究的局限性,未來還需開展大規模的前瞻性臨床隊列研究,以期更好地指導臨床治療實踐。