基于生物信息學篩選與膠質母細胞瘤預后及免疫相關的鐵死亡基因

孫 皓,趙志娟,孟 蓮,劉春霞,3

2021年WHO根據臨床特點及分子病理學特征把膠質瘤分為成人型彌漫性膠質瘤和兒童型彌漫性膠質瘤,其中成人型彌漫性膠質瘤又分為:① 星形細胞瘤,IDH突變型;② 少突膠質細胞瘤,IDH突變和1p/19q共缺失型;③ 膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM),IDH野生型[1]。GBM是成人中最多見并且侵襲能力最強的惡性膠質瘤,治療效果較差,患者中位總生存期小于15個月[2]。因此,探究GBM的分子機制,尋找分子靶標具有重要意義。鐵死亡是新近報道的一種程序性細胞死亡模式,與其他死亡模式不同,其主要由于細胞內脂質活性氧生成量和細胞對其降解能力失衡所致,誘導腫瘤細胞鐵死亡有望成為一種新的腫瘤治療方法[3]。

目前GBM中鐵死亡的機制研究尚處于初期階段,本研究利用生物信息學結合實驗驗證,將GBM差異表達基因與鐵死亡基因進行比對,構建GBM中鐵死亡相關差異表達基因的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡,并從表達差異、預后影響以及免疫浸潤等角度對網絡中的樞紐基因進行分析,為研究GBM中鐵死亡的分子機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器正常星形膠質細胞HA1800及膠質細胞培養基(上海美灣生物科技有限公司,貨號:M1013),膠質母細胞瘤細胞系A172(武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:CL-0012),膠質母細胞瘤細胞系U251MG(上海中科院細胞庫,目錄號:TCHu58),DMEM培養基(美國GIBCO,貨號:C3113-0500),胎牛血清(上海逍鵬生物科技有限公司VivaCell,貨號:C04001-500),青-鏈霉素混合物、1×Phosphate Buffered Solution緩沖液、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P1400、P1020、T1320),TRIzol試劑、反轉錄試劑盒(美國ThermoFisher公司,貨號:15596026、K1622),實時熒光定量PCR的預混體系(江蘇康為世紀生物科技股份有限公司,貨號:CW2601H),二氧化碳培養箱、實時熒光定量PCR儀(美國ThermoFisher公司,型號:3140、4351106),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS,型號:DP74),PCR擴增儀(美國 Bio-Rad公司,型號:C1000)。

1.2 方法

1.2.1篩選GBM鐵死亡相關差異表達基因 選取Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中GSE108474數據集(包含221例GBM樣本和28例正常腦組織樣本),使用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)數據集進行差異基因篩選,并以P<0.05且|log FC|>1為篩選標準,獲得GBM差異表達基因。使用GraphPad Prism 9軟件繪制火山圖。從鐵死亡數據庫FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb)中下載鐵死亡相關基因(網站中鐵死亡相關調控基因數據來自PubMed數據庫中的784篇鐵死亡相關文獻)。通過韋恩圖網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將GBM差異表達基因與鐵死亡基因進行比對,獲取GBM中鐵死亡相關差異表達基因。

1.2.2差異基因的GO和KEGG分析 利用在線工具網站DAVID(https://david.ncifcrf.gov)對上述獲得的基因進行GO功能和KEGG通路富集分析,其中GO分析包括細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)三個部分。

1.2.3構建差異表達基因PPI網絡和篩選網絡中樞紐基因 使用在線分析網站String(https://cn.string-db.org)預測并創建GBM中鐵死亡相關差異表達基因的PPI網絡,并利用Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化分析,使用CytoHubba插件,按照“Degree”值選出PPI網絡中的前10名的樞紐基因。

1.2.4使用TIMER網站進行生存和免疫浸潤分析 使用在線分析網站TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)對PPI網絡中的樞紐基因進行生存預后分析,繪制Kaplan-Meier曲線。并利用TIMER網站分析影響GBM患者預后的樞紐基因與多種免疫細胞(如腫瘤中B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞)浸潤水平的相關性。

1.2.5使用GEPIA網站進行基因的表達量分析和相關性分析 基因分析網站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)中收集整理了來自TCGA和GTEx這兩大數據庫中大量的腫瘤樣本RNA-seq數據,本研究首先利用GEPIA網站來分析影響預后樞紐基因在正常腦組織和GBM中的表達水平,再使用網站中基因相關性分析工具驗證GBM中影響預后樞紐基因與鐵死亡調節因子是否具有相關性。

1.2.6使用HPA數據庫進行蛋白表達分析 利用HPA(https://www.proteinatlas.org)數據庫中收集整理的蛋白組學、轉錄組學以及生物信息學數據,比較影響GBM患者預后的樞紐基因在正常腦組織和高級別膠質瘤組織中的蛋白表達水平。

1.2.7使用TISIDB數據庫進行腫瘤免疫特征相關性分析 利用腫瘤免疫分析數據庫TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)分析PPI網絡中影響GBM患者預后的樞紐基因與趨化因子、趨化因子受體、免疫抑制劑和免疫刺激劑等分子的相關性。

1.2.8細胞培養 將HA1800細胞接種至膠質細胞培養基中,待生長至80%～90%時,按照1∶2的比例進行細胞傳代處理,待細胞狀態穩定后用于實驗。將膠質母細胞瘤細胞系A172和U251MG細胞接種至DMEM培養基中(包含10%血清和1%青-鏈霉素混合液),待生長至80%～90%時,按照1∶3的比例進行細胞傳代處理,待細胞狀態穩定后(第3代以后)用于實驗。

1.2.9實時熒光定量PCR比較細胞中影響患者預后樞紐基因的mRNA表達水平 使用TRIzol法提取細胞的總RNA,并在定量后使用反轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄成cDNA。PCR實驗的20 μl反應體系為正反向引物各0.5 μl,2 μl樣本cDNA、10 μl 實時熒光定量PCR的預混體系以及7 μl無酶水。GAPDH為內參,每組3個副孔,實驗重復3次,結果數據以2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。引物序列:GAPDH正向5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,反向5′-TTGATTTTGGAGGGA-TCTCG-3′;CD44正向5′-ATAATAAAGGAGCAGCACTTCAGGA-3′,反向5′-ATAATTG-TGTCTTGGTCTCTGGTAGC-3′;MDM2正向5′-TGCCAAGCTTCTCTGTGAA-3′,反向5′-CGATGATTCCTGCTGATTGA-3′;STAT3正向5′-CCTTTGGAACGAAGGGTACA-3′,反向5′-CGGACTGGATCTGGGTCTTA-3′。結果使用GraphPad Prism 8.0進行統計分析和作圖。

1.3 統計學處理差異基因篩選使用GEO2R進行統計分析。實時熒光定量PCR結果兩組間表達量差異的比較使用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBM中鐵死亡相關差異表達基因的篩選結果從GSE108474數據集中獲得5 331個差異基因(見圖1A)。從鐵死亡數據庫FerrDb網站下載鐵死亡相關基因484個,按照基因在鐵死亡過程中發揮的不同作用分為促進鐵死亡的“Driver”基因264個,抑制鐵死亡的“Suppressor”基因238個,以及標記鐵死亡發生的“Marker”基因9個。將差異表達基因與鐵死亡相關基因取交集后,篩選出114個與鐵死亡相關的差異基因(見圖1B),其中包含59個促進鐵死亡的“Driver”基因,57個抑制鐵死亡的“Suppressor”基因以及2個標記鐵死亡發生的“Marker”基因(見圖1C)。

圖1 GBM差異表達基因及鐵死亡相關基因

2.2 差異基因GO和KEGG富集分析結果在DAVID數據庫中對獲得的114個基因進行GO和KEGG分析(見圖2)。GO功能注釋分析結果表明,BP功能富集包括負調控神經元死亡、正調控基因表達、正調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄等。CC功能富集包括胞漿、細胞質、核等。MF功能富集包括蛋白結合、可識別蛋白結合、DNA結合等。KEGG分析結果顯示,篩選出的GBM鐵死亡相關差異表達基因參與了鐵死亡和自噬-動物等通路。

圖2 114個鐵死亡相關差異表達基因的GO和KEGG分析結果

2.3 PPI網絡分析結果通過String網站構建了114個鐵死亡相關差異表達基因的PPI網絡,經Cytoscape軟件可視化處理之后,得到由90個基因構成的互作網絡(見圖3A)。使用Cytohubba插件以Degree值為標準,篩選出連接度較高的前10個樞紐基因(見圖3B),分別為雄激素受體(androgen receptor,AR)、雙微體2(murine double minute 2,MDM2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白1基因(cAMP responsive element binding protein 1 gene,CREB1)、糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B,GSK3B)、信號轉導因子和轉錄激活因子3

圖3 114個鐵死亡相關差異表達基因構成PPI網絡及10個樞紐基因

(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亞基α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha gene,PIK3CA)、細胞黏附分子44(cluster of differentiation 44,CD44)、SRC酪氨酸激酶(src tyrosine kinase,SRC)和MYCN 原癌基因(MYCN proto-oncogene,MYCN)。

2.4 10個樞紐基因與GBM患者預后相關性分析利用TIMER基因分析網站對10個樞紐基因進行了生存分析,Kaplan-Meier曲線顯示,CD44(Log-rankP=0.003)、MDM2(Log-rankP=0.012)和STAT3(Log-rankP=0.003)的表達量與GBM患者的生存預后相關(圖4),基因高表達的GBM患者的累積生存率低。

圖4 GBM中10個樞紐基因的預后分析結果

2.5CD44、MDM2和STAT3表達量在GBM與正常腦組織間的比較運用GEPIA數據庫對CD44、MDM2和STAT3這3個基因進行表達量分析驗證,將GBM與正常腦組織進行對比,結果顯示3個基因在GBM中的表達均高于正常腦組織(均P<0.05)(見圖5)。

圖5 CD44、MDM2和STAT3在GBM與正常腦組織中表達量的比較

2.6 GBM和HA1800細胞中CD44、MDM2和STAT3的mRNA表達比較結果使用實時熒光定量PCR分別檢測CD44、MDM2和STAT3在正常星形膠質細胞(HA1800)和GBM細胞(A172和U251MG)中的mRNA表達情況。結果顯示,CD44、MDM2、STAT3在A172和U251MG細胞中的mRNA表達高于HA1800(t=17.970、9.462、8.080、8.721、15.790、12.880,均P<0.05)。見圖6。上述結果表明,CD44、MDM2和STAT3在GBM細胞中的mRNA表達高于正常星形膠質細胞。

圖6 CD44、MDM2和STAT3在HA1800、A172和U251MG細胞中表達量的比較

2.7 高級別膠質瘤和正常腦組織中CD44、MDM2和STAT3的蛋白表達比較結果為了進一步研究CD44、MDM2和STAT3在GBM中的蛋白表達水平,在HPA數據庫分別對3個基因進行檢索(見圖7)。結果顯示,CD44、MDM2和STAT3在高級別膠質瘤中蛋白陽性表達程度高于正常腦組織。

圖7 HPA數據庫中CD44、MDM2和STAT3在高級別膠質瘤和正常腦組織中蛋白表達的情況 ×200

2.8 GBM中CD44、MDM2和STAT3與鐵死亡的相關性為驗證CD44、MDM2和STAT3在GBM中是否影響鐵死亡,利用GEPIA數據庫分別在GBM中分析這3個基因與鐵死亡調節因子的相關性。結果顯示,CD44的表達與鐵死亡負調控因子鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、血紅素結合蛋白1(heme binding protein 1,HEBP1)和細胞凋亡誘導因子線粒體相關2(apoptosis inducing factor mitochondria associated 2,AIFM2)呈正相關;STAT3的表達與鐵死亡負調控因子溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、HEBP1和AIFM2呈正相關;MDM2的表達與鐵死亡正調控因子核受體共激活因子 4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)和?；o酶 A 合成酶長鏈家族成員 4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)呈負相關。見圖8。以上結果表明,在GBM中CD44、MDM2和STAT3均與鐵死亡呈負相關。

圖8 GBM中CD44、MDM2和STAT3與鐵死亡調控因子的相關性分析

2.9CD44、MDM2和STAT3基因表達水平與GBM中免疫細胞浸潤水平的相關性利用TIMER網站對3個基因進行免疫浸潤分析,以此來預測各基因與GBM中免疫成分浸潤的相關性。結果顯示,腫瘤中CD44基因表達升高時,CD4+T細胞、嗜中性粒細胞及樹突狀細胞也會增多,而腫瘤純度、B細胞及CD8+T細胞的浸潤水平將會降低(均P<0.05);MDM2基因高表達時,CD8+T細胞和樹突狀細胞的浸潤水平升高,腫瘤純度和巨噬細胞的浸潤將減少(均P<0.05);當STAT3高表達時,CD4+T細胞、嗜中性粒細胞及樹突狀細胞的浸潤會增多,而

腫瘤純度及CD8+T細胞的浸潤將減少(均P<0.05)。見圖9。

圖9 TIMER數據庫分析基因表達與免疫浸潤的相關性分析

2.10CD44、MDM2和STAT3基因表達與免疫特征的相關性通過TISIDB數據庫分析GBM中CD44、MDM2和STAT3的表達水平與免疫細胞趨化因子或受體之間的相關性。結果顯示如圖10 所示,多種趨化因子和趨化因子受體與GBM中CD44、MDM2和STAT3的表達相關。CD44的表達與趨化因子配體2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)、CXC基序趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)3和CCL20等趨化因子呈正相關(r=0.643、0.659、0.569,均P<0.01),并與CC基序趨化因子受體1(C-C motif chemokine receptor,CCR)1、CCR5和CCR2等趨化因子受體呈正相關(r=0.502、0.519、0.445,均P<0.01);MDM2的表達與趨化因子配體(C-C motif chemokine ligand,CCL)7、CXCL10和CCL26等趨化因子呈正相關(r=0.305、0.242、0.257,均P<0.01),并與CCR2、CXC基序趨化因子受體(C-X-C motif chemokine receptor 3,CXCR)3及CXCR6等趨化因子受體呈正相關(r=0.250、0.206、0.212,均P<0.01);STAT3的表達與趨化因子配體14(C-C motif chemokine ligand 14,CCL14)和趨化因子配體19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)呈負相關(r=-0.155、-0.208,均P<0.05),與CC基序趨化因子受體10(C-C motif chemokine receptor 10,CCR10)、CC基序趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor,CCR1)1及CCR5等趨化因子受體呈正相關(r=0.322、0.359、0.333,均P<0.01)。

圖10 TISIDB數據庫分析基因表達與免疫分子的相關性

此外,CD44、MDM2和STAT3與GBM中各種免

疫抑制劑和免疫刺激劑的相關性分析結果顯示,CD44與含V區域T細胞激活抑制因子1、腺苷A2a受體及CD160分子(CD160 molecule,CD160)等免疫抑制劑呈現負相關(r=-0.338、-0.281、-0.325,均P<0.01),與免疫刺激劑TNF超家族成員14、CXCR4及白細胞介素-6等呈正相關(r=0.526、0.444、0.509,均P<0.01);MDM2與免疫抑制劑白介素10受體亞基β和半乳糖凝集素9等呈正相關(r=0.339、0.205,均P<0.01),與VTCN1(r=-0.188,P<0.05)呈負相關,與CD28分子和TNF 超家族成員13等免疫刺激劑呈正相關(r=0.344、0.284,均P<0.01);STAT3的表達與免疫抑制劑CD160、淋巴細胞活化基因3及VTCN1等呈負相關(r=-0.397、-0.19、-0.282,均P<0.05),與CD276分子、白細胞介素 6 受體和PVR細胞粘附分子等免疫刺激劑呈正相關(r=0.448、0.431、0.430,均P<0.01)。以上這些結果說明CD44、MDM2和STAT3在GBM免疫微環境中發揮調節作用。

3 討論

由于GBM侵襲能力強且易復發,目前臨床上GBM的治療效果較差,隨著對GBM研究的不斷深入,陸續發現了一些新的治療方法,如納米技術治療、脈沖消融療法等[4]。近幾年研究[5]發現某些基因或物質可以通過激活鐵死亡抑制GBM的進展。

本研究在5 331個GBM差異表達基因中確定了114個鐵死亡相關基因。KEGG分析顯示,114個基因除了在鐵死亡通路上富集之外,還在自噬-動物通路上富集。目前鐵死亡與自噬這兩種死亡模式之間的相關性研究越來越多,提出鐵死亡是一種自噬依賴性的細胞死亡過程[3]。本研究篩選出的鐵死亡相關差異表達基因可能是GBM中連接自噬與鐵死亡的關鍵基因。

本研究從114個基因構成的PPI網絡中篩選出10個樞紐基因,并發現其中CD44、MDM2和STAT3的高表達的GBM患者生存率更低。研究[6]顯示,STAT3的表達可以誘導GBM干細胞的分化并促進成瘤;在GBM中下調MDM2的表達后,腫瘤進展受到抑制[7];研究顯示[8]下調CD44的表達后,GBM細胞的增殖和遷移能力減弱。上述結果說明,CD44、MDM2和STAT3的表達促進了GBM的進展。

另有研究[9]顯示,下調STAT3的表達可以促進胃癌細胞鐵死亡,延緩胃癌進展;抑制MDM2的表達可以增強結直腸癌細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性,進而抑制腫瘤發展[10];抑制CD44的表達也可以促進結直腸癌細胞的鐵死亡[11]。雖然目前在GBM中缺乏CD44、MDM2和STAT3與鐵死亡的相關報道,但本研究通過生物信息學方法,發現CD44、MDM2和STAT3的表達抑制了GBM細胞的鐵死亡,這為接下來的具體機制研究提供新思路。

腫瘤細胞的發展及轉移與腫瘤微環境密切相關,其中免疫細胞的浸潤是腫瘤微環境變化的重要影響因素。本研究發現CD44、MDM2和STAT3在GBM中與多種免疫細胞的浸潤呈現出不同程度的相關性,其中CD44、STAT3的表達與CD4+T細胞、噬中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關,MDM2的表達與CD8+T細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關。研究[12]顯示,GBM中CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤水平的升高改善了患者預后,而中性粒細胞-淋巴細胞與GBM患者的不良預后相關[13]。上述結果提示,CD44、MDM2和STAT3可能是連接鐵死亡和腫瘤免疫療法的關鍵分子。

趨化因子及趨化因子受體是介導免疫細胞浸潤至腫瘤組織內的關鍵分子,本研究發現CD44、MDM2和STAT3的表達與多種趨化因子及受體的表達相關。這些趨化因子及受體的表達影響著微環境的改變,例如CCL2-CCR2信號通路在肝細胞癌中可以招募單核巨噬細胞和髓源性抑制細胞進入腫瘤微環境,并抑制腫瘤相關抗原特異性CD8+T細胞的活化[14];CXCL3具有促進腫瘤中血管生成的作用,而CXCL10具有抑制血管生成的作用[15]。此外,本研究還發現CD44、MDM2和STAT3可以影響某些免疫抑制劑和免疫刺激劑的表達。上述結果提示,CD44、MDM2和STAT3可能在腫瘤免疫微環境中發揮調節作用。

本研究將生物信息學與細胞實驗結合,在GBM中篩選出CD44、MDM2和STAT3這3個與鐵死亡相關的、影響患者預后的異常高表達基因。CD44、MDM2和STAT3的表達也會影響腫瘤微環境中趨化因子和趨化因子受體的表達,并影響免疫細胞的浸潤。綜上所述,調節CD44、MDM2和STAT3的表達有望成為誘導腫瘤細胞鐵死亡和免疫療法的新方法。