MUC5AC、MUC5B在慢性鼻-鼻竇炎患者中的表達及與細菌生物膜形成的關系分析

顧建明 梅文雅

慢性鼻-鼻竇炎是常見的上呼吸道疾病，其產生與細菌、病毒、真菌性感染、過敏、鼻部解剖結構缺陷等因素相關[1，2]。黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）作為一種黏液分子，主要存在于上呼吸道中黏膜表層和深層黏液中。研究表明，在慢性鼻-鼻竇炎的發展中MUC5AC具有調節作用[3]。而黏蛋白5B（mucin，MUC5B）為一種分泌性黏液糖蛋白，主要存在于呼吸道上皮細胞和黏液層中，具有保護和防御作用[4]。細菌生物膜是一種由微生物組成的復雜結構常見于多種不同環境中[5]?，F階段對于以上因素在慢性鼻-鼻竇炎中的相關性研究相對較少，本次研究探究MUC5AC、MUC5B 在慢性鼻-鼻竇炎中的表達及與細菌生物膜形成的相關性分析?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2020 年12 月至2023年4 月在德清縣人民醫院行鼻內窺鏡手術的患者50 例為觀察組，納入標準：符合西醫慢性鼻-鼻竇炎診斷標準[6]；年齡＞18 周歲；既往無鼻部手術；鼻竇CT顯示至少一個解剖部位渾濁或阻塞；無其他慢性疾病病史。排除標準：臨床資料缺失；妊娠及哺乳期的婦女；伴隨其他免疫缺陷及惡性腫瘤疾病。觀察組中男性27 例、女性23 例；平均年齡（42.56±2.23）歲。另選取50 例我院病理保存的健康標本作為對照組。對照組中男性31 例、女性19 例；平均年齡（41.89±2.30）歲；兩組患者在年齡、性別方面比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 取患者中鼻甲、鉤突鼻竇面標本，使用生理鹽水漂洗后剔除表面分泌物，取3 mm×3 mm 黏膜組織后將其固定在2.5%戊二醛溶液中，低溫保存備用。

1.2.2 免疫熒光檢測MUC5AC、MUC5B 使用磷酸鹽緩沖液洗滌鼻黏膜組織，梯度乙醇脫水，二甲苯溶液透明，石蠟包埋，4 ℃冷卻后制作成4 μm切片，40 ℃烘烤，脫蠟后經二甲苯溶液浸泡40 min，后采用90%無水乙醇干預2 min、80%無水乙醇干預2 min、70%干預2 min，清洗后將切片抗原修復，冷卻30 min 后將其清洗，加入內源性過氧化氫酶阻斷劑，靜置10 min 后再清洗，常溫封閉1 h 后用TBST 清洗3 次，每次5 min，滴加一抗MUC5AC（1∶1000）、MUC5B（1∶1000），4 ℃孵育過夜，清洗后加二抗，37 ℃孵育1 h，清洗后室溫避光顯色，孵育15 min，在熒光顯微鏡下將MUC5AC、MUC5B 蛋白定位在細胞膜和細胞漿上，呈紅色熒光染色。每組標本隨機抽取10張切片，在高倍（×200）視野下用熒光顯微鏡圖像處理軟件并計算陽性細胞面積，取其均值。

1.2.3 免疫印跡檢測MUC5AC、MUC5B蛋白 將鼻黏膜組織在冰上裂解30 min后提取蛋白，測定蛋白濃度后煮樣，設置80 V、30 min，110 V、120 min 電泳，轉膜后50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，TBST稀釋一抗MUC5AC（1∶1000）、MUC5B（1∶1000），4 ℃過夜孵育，洗膜3 次，每次10 min，完成后加二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，洗膜3 次，每次10 min，完成后進行ECL發光系統顯像，用Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.4 細菌生物膜陽性評分 將10 mm 黏膜標本置于DMEM 高糖培養基中，沖洗后進行細胞計數，調整濃度，離心收集，激光掃描共聚焦顯微鏡下判斷陽性細菌生物膜，10 μm 環境下觀察細胞形態，綠色熒光為活菌（紅色熒光為死亡細胞和細菌），同時被不規則片狀胞外多糖類物質圍繞，陽性評分依據Lund-Kennedy 評分標準進行評分，評分范圍為0～8 分，得分越高則表示病情越嚴重[7]。

1.2.5 細菌生物膜形態 所有標本均行掃描電鏡下觀察細菌生物膜形態，采用雙蒸水洗滌后，用乙醇梯度脫水處理，干燥后進行噴金，完成后在電鏡顯微鏡下進行觀察，其中伴隨水通道、三維立體結構、圓形、橢圓形小體等形態學特征則判定為具有細菌生物膜形成。

1.3 統計學方法 采用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；慢性鼻-鼻竇炎中的MUC5AC、MUC5B 與細菌生物膜陽性評分相關性采用Pearson法分析。設P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組鼻黏膜組織中MUC5AC、MUC5B 陽性細胞表達見表1和圖4

表1 兩組鼻黏膜組織中MUC5AC、MUC5B陽性細胞表達/%

由表1 和圖4 可見，觀察組患者鼻黏膜組織中的MUC5AC、MUC5B 陽性細胞表達高于對照組，差異均有統計學意義（t分別=54.27、61.18，P均＜0.05）。

2.2 兩組患者鼻黏膜組織中MUC5AC、MUC5B 蛋白表達見表2和圖1

圖1 兩組患者鼻黏膜組織MUC5AC、MUC5B蛋白表達示意圖

圖4 兩組鼻黏膜組織MUC5AC、MUC5B陽性細胞表達示意圖

表2 兩組患者鼻黏膜組織中MUC5AC、MUC5B蛋白表達

由表2 和圖1 可見，觀察組鼻黏膜組織中的MUC5AC、MUC5B 蛋白表達高于對照組，差異均有統計學意義（t分別=43.51、70.90，P均＜0.05）。

2.3 兩組細菌生物膜陽性評分比較 觀察組患者細菌生物膜陽性評分為（6.89±2.36）分，高于對照組（3.58±1.12）分，差異有統計學意義（t=8.96，P＜0.05）。

2.4 兩組細菌生物膜熒光染色結果見圖5

圖5 細菌生物膜熒光染色示意圖

由圖5 可見，激光掃描共聚焦顯微鏡下顯示，與對照組相比，觀察組被不規則片狀胞外多糖類物質圍繞，同時綠色熒光活躍。

2.5 兩組電鏡下細菌生物膜形態比較見圖6

圖6 兩組電鏡下細菌生物膜形態比較示意圖（×1000倍）

由圖6可見，掃描電鏡下顯示，觀察組鼻黏膜組織表面纖毛均伴黏附聚集、倒伏、紊亂及喪失等現象，另有部分組織伴纖毛腫脹；對照組鼻黏膜表面纖毛無明顯紊亂現象。

2.6 慢性鼻-鼻竇炎患者中MUC5AC、MUC5B 與細菌生物膜陽性評分的相關性分析 MUC5AC、MUC5B與細菌生物膜陽性評分均呈正相關（r分別=0.37、0.30，P均＜0.05）。

3 討論

慢性鼻-鼻竇炎由于病因、病情及細菌耐藥等問題常導致臨床治療難度較大。目前，對于慢性鼻-鼻竇炎的治療有抗生素治療、鼻腔沖洗及手術干預等方式。提高慢性鼻-鼻竇炎的檢測效率對于疾病的預防和治療至關重要。

黏蛋白作為重要的物理屏障能通過分泌黏液阻止細菌等感染因子附著。MUC5AC、MUC5B 作為上呼吸道黏膜中重要的黏蛋白基因，在人體鼻腔黏膜中均有一定程度的表達[8]。MUC5B 能夠參與鼻-鼻竇炎黏液的調節與合成，若黏液的層數過厚便會對鼻部以及整個呼吸道的排出功能造成限制，同時增強炎癥反應并加重疾病進程。MUC5B 的表達強度升高，不僅能夠促進黏液的分泌，同時還會抑制鼻竇的清除能力。且有相關研究表示，MUC5B表達水平的變化與慢性鼻-鼻竇炎病癥的嚴重程度具有重要相關性[9]。分析MUC5B 在慢性鼻-鼻竇炎中高表達的原因可能是由于慢性炎癥反應所導致的黏液分泌異常增加所致。MUC5AC也是促進炎癥黏液形成的關鍵因素之一，其高表達也可加快慢性鼻-鼻竇炎的發生發展[10]。在慢性鼻-鼻竇炎疾病進程中，大量的MUC5AC會導致杯狀細胞及腺體細胞異常增生，在鼻竇內不斷積聚并形成黏稠的分泌物。同時，由于疾病期的排出困難，進而也在一定程度上加劇炎癥反應不斷形成，最終加重疾病反應[11]。本次研究結果顯示，與健康人群相比，慢性鼻-鼻竇炎患者鼻黏膜組織中MUC5AC、MUC5B陽性細胞及蛋白表達均較高（P均＜0.05），提示在慢性鼻-鼻竇炎中，MUC5AC、MUC5B 及細菌生物膜形成均有不同程度升高現象。這可能是因為鼻-鼻竇炎患者中MUC5AC 和MUC5B 的過度表達導致黏液層的增厚和黏稠度增加，從而為細菌生物膜提供了適宜的環境。與Lachowicz-Scroggins等[12]研究結論一致。

通常情況下，慢性鼻-鼻竇炎患者上呼吸道黏膜中MUC5AC表達量要比健康人群高約2倍。相關研究也表示，MUC5AC、MUC5B 過度表達不僅可導致上皮細胞功能障礙、黏液分泌過度，同時也為細菌生物膜形成提供便利條件。細菌生物膜是細菌形成的主要形式，是在不利環境中所產生的胞外多聚糖被膜。經研究發現，細菌生物膜既能由單一菌種構成，也可由多種細菌混合形成。臨床中，多種難治型、頑固型感染均與細菌生物膜的形成相關[13]。研究表明，許多病原微生物可以形成生物膜，且能在一定程度上保護微生物免受抗生素、免疫系統以及其他防御機制的攻擊[14]。在慢性鼻-鼻竇炎疾病中由于外源菌群的不斷入侵，常導致鼻黏膜正常菌群遭到破壞，進而刺激異常菌群黏附性生長，大量生成黏液，最終形成細菌保護膜。國外研究發現，在慢性鼻-鼻竇炎患者中，MUC5AC 和MUC5B 的表達水平明顯增加，且患者的鼻腔和鼻竇中常見細菌和真菌的生物膜形成，這表明這兩種黏蛋白可能在慢性鼻-鼻竇炎的發病機制中起重要作用，且這些生物膜可以促進細菌的存活和繁殖，并與慢性鼻-鼻竇炎的病情惡化有關[15]。本次研究結果顯示，與健康人群相比，慢性鼻-鼻竇炎患者細菌生物膜陽性評分較高（P＜0.05），且在掃描電鏡下慢性鼻-鼻竇炎患者的黏膜表面纖毛有倒懸、缺失、混亂及黏附聚集等現象，且部分纖毛腫脹、損傷程度較重。進一步相關性分析發現，MUC5AC、MUC5B 均與細菌生物膜形成呈正相關（P均＜0.05），表明MUC5AC和MUC5B 的高表達與細菌生物膜形成有關。但對于細菌生物膜形成與MUC5AC、MUC5B的具體作用機制仍需后續進一步探究。

綜上所述，慢性鼻-鼻竇炎中MUC5AC、MUC5B、細菌生物膜三者均存在一定的相關性，但本次研究仍存在一定不足之處，對于三者的具體機制分析仍需進一步探究，日后會繼續完善進而為臨床相關疾病的診療提供有效策略。