魚用降肝脂益生菌的篩選及鑒定

劉洪瑞，王 濤，孫家塍，張曉月，孫金生，左志晗

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

近年來，由于高密度水產養殖的迅速發展，片面追求高生長速度而過度投餌或大量使用高能量高蛋白餌料，加劇了養殖魚類如草魚、鯽魚、鯉魚等脂肪肝病的發生.為了防治這一疾病，急需找到安全有效的解決辦法，目前通常是采用調節飲食的方式改善肝臟脂代謝異常.益生菌因其安全有效的特點廣泛應用于水產養殖中，益生菌可以增強水產動物抗病能力，促進生長發育，改善水產養殖環境，提高養殖的產量和質量[1]，但采用益生菌調節水產養殖動物的脂代謝、防治脂肪肝方面的研究及應用目前尚不足.現已有少量關于乳酸菌降低動物肝臟脂肪沉積、改善肝臟脂質代謝的研究報道.如丁淑娟[2]通過測定體外清除膽固醇能力、產膽鹽水解酶活性以及胃腸液耐受能力對34株供試菌進行篩選，最終得到了2 株降脂乳酸菌，它們可顯著降低高脂血癥大鼠的體質量、肝臟質量、血脂以及糞便脂質含量.Hou 等[3]研究發現，乳桿菌Lactobacillus delbrueckii 具有良好的腸道存活和定植能力，在豬日糧中添加該菌可以降低豬血清中的膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯.田佳鑫[4]用干酪乳桿菌（L.casei）、植物乳桿菌（L.plantaraum）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）包被高脂飼料并將其飼喂給烏鱧，能夠緩解由高脂飼料導致的烏鱧脂肪肝.

益生菌因其高效、成本低、環境友好等特點被水產養殖行業廣泛應用，但非魚源性益生菌很難在水產養殖中高效發揮作用，因此理想的益生菌應該來自于魚類腸道[5].B?ckhed[6]第一次提出了“腸道菌群可作為一種環境因子來調節機體脂肪的儲存”的觀點.本研究以從半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）腸道中分離出來的13 株益生菌為實驗菌株，通過對其體外產膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）能力和體外降膽固醇能力的測定與比較，初步篩選出具有降脂作用的益生菌，進一步通過高脂斑馬魚的飼喂實驗，驗證其在水產動物體內的降脂作用效果.研究旨在為緩解魚類肝臟脂肪堆積篩選有效的益生菌菌株，進而為解決水產養殖過程中魚類脂肪肝的問題提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本研究所用的13 株菌均為實驗室前期從半滑舌鰨腸道中分離獲得，菌株編號分別為SC-01、SC-02、SC-03、SC-04、YZ-01、YZ-02、YZ-03、ND-1、U2、U3、SH-1、M4、YA6.

1.2 培養基及溶液的配制

BSH 篩選培養基：MRS 液體培養基中添加2%瓊脂、0.3%牛膽鹽、0.2%巰基乙酸鈉、0.37 g/L 氯化鈣.MRSTHIO-OX-CHOL 培養基：MRS 液體培養基中添加0.3%牛膽鹽、0.2%巰基乙酸鈉、0.1 mg/mL 膽固醇溶液.

膽固醇溶液：取膽固醇粉末0.5 g，用無水乙醇加熱溶解并定容至50 mL，獲得10.0 mg/mL 的膽固醇溶液，用0.45 μm 的微孔濾膜除菌，按1%的量加入到無菌MRS 液體培養基中，獲得0.1 mg/mL 的膽固醇溶液.鄰苯二甲醛工作液：稱取鄰苯二甲醛50 mg，用無水乙醇定容到50 mL，獲得1 mg/mL 的鄰苯二甲醛工作液，冷藏備用.混合酸∶冰乙酸與濃硫酸按照體積比為1 ∶1 的比例混勻.

1.3 高產膽鹽水解酶菌株的篩選

將滅菌的BSH 篩選培養基倒入無菌平板中，待培養基凝固后將直徑4 mm 的無菌濾紙片均勻放置在培養基上.將活化好的待測菌液10 μL 緩慢加在無菌濾紙片上，待菌液完全吸收后，37 ℃厭氧培養72 h，觀察濾紙片周圍是否出現白色沉淀物，有白色沉淀即可初步判定該菌株產生了BSH.

1.4 用鄰苯二甲醛法分析菌株體外降膽固醇的能力

繪制標準曲線：取5 支試管按照1—5 編號，按順序分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL 的膽固醇溶液，再按照順序分別加入冰醋酸0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL，每支試管再分別加入鄰苯二甲醛試劑，振蕩混勻.靜置10 min 后分別加入混合酸4.0 mL，混合均勻，在室溫下靜置10 min.將反應液置入96 孔板中，以膽固醇的質量濃度為橫坐標，OD550值為縱坐標繪制標準曲線.

樣品OD 值的測定：將菌株的菌懸液按照3%的接種量添加到10 mL 的MRS-THIO-OX-CHOL 培養基中，37°C 培養24 h.將剛接種菌的培養基在9 000 r/min條件下離心10 min，取上清液0.25 mL，加入鄰苯二甲醛工作液0.1 mL，充分振蕩后靜置10 min.加入混合酸溶液2.0 mL，室溫下靜置10 min，將反應液置入96 孔板中，測定其OD550.分別于6、12 和24 h 時取樣，按照上述鄰苯二甲醛法測定發酵液OD 值.根據膽固醇標準曲線的擬合方程確定發酵液中膽固醇的含量，膽固醇脫除率的計算公式為

式中：A 為菌株發酵后上清液中的膽固醇含量；B 為菌株發酵前上清液中的膽固醇含量.

1.5 菌株對斑馬魚的降脂作用

1.5.1 斑馬魚高脂飼料的制備

100 g 基礎飼料中包含：酪蛋白40 g、明膠10 g、糊精35 g、豆油6 g、賴氨酸0.33 g、VC 磷酸酯0.1 g、多維0.2 g、多礦0.2 g、磷酸二氫鈣2 g、氯化膽堿0.2 g、海藻酸鈉2 g、微晶纖維素3.97 g.粗蛋白總量為42.19 g，粗脂肪總量為6.09 g，每克飼料能量為18.55 kJ.

100 g 高脂飼料中包含：酪蛋白40 g、明膠10 g、糊精25g、豬油8g、豆油8g、賴氨酸0.33g、VC 磷酸酯0.1 g、多維0.2 g、多礦0.2 g、磷酸二氫鈣2 g、氯化膽堿0.2 g、海藻酸鈉2 g、微晶纖維素3.97 g.粗蛋白總量為42.19 g，粗脂肪總量為15.77 g，每克飼料能量為20.85 kJ.

1.5.2 斑馬魚養殖及分組

將斑馬魚分成15 組（每組設置3 個平行），每組150 條，分別設置空白組（control）、高脂組（HF）和實驗組.實驗組飼喂高脂加菌飼料（進行13 株候選菌的飼喂及浸浴，濃度為3×105cfu/mL），空白組飼喂基礎飼料且不浸浴益生菌，高脂組飼喂高脂飼料且不浸浴益生菌.從早上九點和晚上九點進行飼喂，周期為30 d.由于養殖系統的水會自動持續更新流出，所以實驗組每隔2 h 向水中補充1 次益生菌.

浸浴菌泥的制備：將13 株菌分別活化至1×105cuf/mL，取10 mL 活化菌液于15 mL 離心管中，5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，棄去上清，放置于4 ℃冰箱中備用，時間不超過48 h.

飼喂飼料的制備：將13 株菌分別活化添加到飼料中，使飼料中的菌含量達到1×107cfu/g，靜置使飼料表面干燥松散后噴入10%的海藻酸鈉溶液，充分攪拌，使海藻酸鈉包裹在飼料表面，防止飼料在水中快速溶解.配制好的飼料置于4 ℃冰箱備用，放置時間不能超過48 h，最好現配現用.

斑馬魚飼喂養殖30 d 后，對各組斑馬魚肝臟樣品進行采集，過程如下：用無菌解剖刀，在無菌狀態下取出整個肝臟，裝入2.0 mL 無酶凍存管中，放置于冰上.將取下的肝組織放入加入了4%多聚甲醛的無酶15 mL離心管中固定，將分裝好的樣品立即放入-80 ℃低溫保存，使用多聚甲醛固定的肝組織常溫保存，委托武漢塞維爾公司制做油紅O 染色石蠟包埋冷凍切片.

1.6 菌種鑒定

DNA 模板的制備：將待測菌株在固體培養基上多次劃線純化后，接種于相應的液體培養基中，置于搖床上180 r/min 培養24 h.在超凈工作臺中取培養后的1 mL 菌液于滅菌離心管中，8 000 r/min 離心3 min；在超凈工作臺中倒去上清，加入0.1 mL 無菌水，振蕩搖勻后，100 ℃水浴10 min；于12 000 r/min 離心10 min，上清液即為DNA 模板，-20 ℃保存.

用細菌鑒定通用引物進行PCR 擴增待鑒定菌株的16S rDNA 片段，引物27F 的序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 的序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.

選擇50 μL 反應體系，包含25 μL 的2×Taq Mix、19 μL 的ddH2O、2 μL 的27F、2 μL 的1492R、2 μL 的DNA.PCR 反應程序：以提取的DNA 為模板，按照PCR 反應體系將試劑依次添加至200 μL 的PCR 管中，渦旋儀振蕩混勻.PCR 反應條件：預變性94 ℃，4 min；變性94 ℃，30s；退火55 ℃，1 min；延伸72 ℃，90 s；延伸72 ℃，10 min.變性、退火、延伸設置為35個循環.

配制1%的瓊脂糖電泳凝膠進行PCR 產物檢測.于100 mL 錐形瓶中加入600 μL 的50×TAE、30 mL 蒸餾水和0.3 g 瓊脂糖，微波爐加熱完全溶解，降至室溫后，加入1 μL 的EB 混勻，將膠小心倒入事先插好梳子的制膠板中，避免起泡，室溫靜置，待其凝固，拔出梳子，將膠移入電泳槽緩沖液內.第一個膠孔加5 μL的Marker，后面分別加5 μL 的PCR 產物，連接電源，設置電壓95 V，時間30～40 min.電泳結束后，將膠取出置于紫外凝膠成像儀下觀察.

序列測定比對：將擴增成功的PCR 產物委托北京金唯智公司進行雙向測序，引物為27F 和1492R.測得序列在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行blast序列比對分析，確定菌株所在菌屬，并用MEGA 7 構建菌種進化樹.

2 結果與分析

2.1 體外具有降脂作用菌株的篩選

2.1.1 菌株產膽鹽水解酶的能力

膽鹽水解酶可以水解膽鹽，在益生菌降膽固醇機制中發揮重要作用[7].將菌株點種在含膽鹽及無水氯化鈣的培養基上，根據產生白色沉淀圈的大小可以初步判斷益生菌產BSH 能力，結果如圖1 所示.由圖1可以看出，13 株菌中，菌株ND-1 和U3 產BSH 能力最強，沉淀圈大小為1.3 cm；其次是菌株SC-03，沉淀圈大小為1.1 cm，YZ-01 沉淀圈大小為0.9 cm.

圖1 13 個菌株的產膽鹽水解酶能力Fig.1 Production capacity of BSH of the 13 strains

2.1.2 菌株降解膽固醇的能力

對13 株菌降解膽固醇的能力進行測定，各菌株在不同時間的膽固醇去除率如圖2 所示.由圖2 可以看出，菌株YA6 在6 h 的降脂效果最顯著，其膽固醇去除率為91.43%；其次為菌株ND-1，24 h 的膽固醇去除率為89.76%；菌株M4 在6 h 的膽固醇去除率為80.77%，菌株U3 在24 h 的膽固醇去除率為76.67%.

圖2 菌株體外膽固醇去除率Fig.2 In vitro cholesterol removal rate of the 13 strains

2.2 菌株體內的降脂作用

2.2.1 菌株對斑馬魚體質量的影響

為了探究13 株菌的體內降脂能力，建立高脂飲食斑馬魚模型，分析13 株菌對斑馬魚脂代謝水平的影響，結果如圖3 所示.由圖3 可以看出，用不同菌株干預30 d 后，與高脂組相比，添加了菌株U2、SC-04、YZ-02、ND-1 的實驗組中斑馬魚的體質量均顯著降低（P <0.000 1）；其次是菌株U3 的降體質量效果也較顯著.U2 組的體質量降低率最高，為48.18%；SC-04 組、ND-1 組和YZ-02 組的體質量降低率分別為32.97%、31.05%和21.63%.以上結果初步說明這4 株菌對斑馬魚機體的脂代謝存在影響.

圖3 斑馬魚體質量Fig.3 Body mass of zebrafish

2.2.2 菌株對斑馬魚肝臟甘油三酯含量的影響

肝臟是脂質穩態調控的重要組織器官，基于益生菌對正常飲食和高脂飲食斑馬魚體質量的影響，對斑馬魚肝臟中甘油三酯的濃度進行評估，結果如圖4 所示.由圖4 可以看出，與高脂組相比，添加了菌株SC-01、YZ-02、U3 和SH-1 的實驗組中斑馬魚肝臟的甘油三酯濃度顯著降低.YZ-02 組降低效果最明顯，甘油三酯同高脂組相比降低了81.25%；SH-1 組、U3 組、SC-01 組、ND-1 組分別降低了53.68%、49.33%、47.56%、41.88%（P<0.000 1）.

圖4 斑馬魚肝臟甘油三酯含量Fig.4 Liver triglyceride content of zebrafish

2.2.3 斑馬魚肝臟油紅O 染色切片

為了進一步檢測13 株菌改善斑馬魚肝臟脂滴沉積作用的效果，取斑馬魚肝臟組織進行油紅O 染色、石蠟固定和冰凍切片，鏡下觀察結果如圖5 所示.

圖5 斑馬魚肝臟油紅O 染色切片Fig.5 Oil red O-stained sections of zebrafish liver

由圖5 可以看出，添加菌株YZ-01、ND-1、U3 的3個實驗組中，肝臟脂滴數量及大小明顯低于高脂組的數值，說明菌株YZ-01、ND-1、U3 可以有效緩解脂肪在肝臟中的沉積.

2.3 菌株鑒定

針對降脂效果明顯的菌株U3 和ND-1，使用試劑盒提取基因組DNA 片段，以其為模板擴增16S rDNA基因序列，將擴增產物滴加于1%的瓊脂糖凝膠樣品孔中進行電泳檢測，獲得了大約1 500 bp、較為均一的片段.將PCR 擴增產物進行送測，所得測序結構在NCBI 數據庫進行同源性序列比對，根據比對結果可知，菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus strain 5681，MT463591）的相似度為98%，菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum strain Y15，JX134628）的相似度為100%.

對菌株U3 和ND-1 進行系統發育學分析，以16S rDNA 基因序列為遺傳標記構建系統發育進化樹，結果如圖6 所示.由圖6 可以看出，菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌聚為一支，置信度為98%；菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌聚為一支，置信度為100%.

圖6 菌株進化樹Fig.6 Strain evolutionary tree

3 討論與結論

魚類脂肪肝疾病是水產養殖中最常見的營養性疾病，肝臟脂肪沉積是誘導脂肪肝發病的主要原因[8].本研究對前期從半滑舌鰨中分離獲得的水生動物腸道菌株進行篩選，初步獲得了安全有效的具有降脂作用的益生菌菌株.首先考察候選菌株的體外產膽鹽水解酶的能力，膽鹽水解酶屬于N 端親水水解酶超家族，在N 端半胱氨酸殘基催化核心部位具有αββα 結構[9]，能夠降解膽汁酸，對膽固醇的消化吸收及體內的膽固醇消耗具有一定的作用，已被認定是潛在的肥胖治療靶點[10].因此，本研究以菌株高產膽鹽水解酶作為體外篩選具有降脂作用菌株的首要指標對菌株進行測試，結果顯示菌株ND-1 和U3 產膽鹽水解酶的能力最強，證明這2 株菌可能通過產生膽鹽水解酶這個靶點降低魚體的膽固醇沉積.Michael 等[11]研究發現，植物乳桿菌Lab4 和CUL66 具有產膽鹽水解酶的能力，將其飼喂給小鼠后小鼠的糞便中膽汁酸的含量增加，由此推測2 株菌通過在宿主腸道中產生的膽鹽水解酶介導了膽汁酸的凈化，從而增加膽汁酸從頭合成，最終使膽汁酸含量增加.劉煜珺[8]研究發現，將具有產膽鹽水解酶能力的植物乳桿菌Y44 飼喂給高脂膳食小鼠能夠顯著降低小鼠血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白，并可以緩解小鼠肝臟脂肪空泡的產生.Ma 等[12]研究發現，高產膽鹽水解酶的乳酸菌可以通過加強宿主消化系統結合態膽汁酸的分解，抑制膽固醇轉運蛋白的表達，降低宿主飲食中膽固醇等脂類物質的吸收，與本實驗結果較為相似.

目前，有多項研究證實了益生菌對非酒精性脂肪肝（NAFLD）具有積極作用[13].如曹少鋒等[14]研究發現，在高脂飲食誘導的NAFLD 模型中，與對照組（給予生理鹽水灌胃）相比，實驗組小鼠（給予鼠李糖乳桿菌DM9054 聯合植物乳桿菌86066 灌胃）的體質量減輕，血清TG、TC、LDL-C 水平降低，肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤的現象顯著減少.水產養殖領域中對于益生菌緩解魚類脂肪肝有少量研究報道，如張震[15]研究發現，將經典益生菌（鼠李糖乳桿菌LGG 和干酪乳桿菌BL23）添加進飼料，益生菌可以通過維護腸道菌群結構的穩定來緩解高脂飲食誘導的魚類脂肪肝.本研究從半滑舌鰨腸道中分離得到的13 株益生菌中，菌株YZ-02、U2、SC-04 和ND-1 可以減輕斑馬魚的體質量，菌株SC-01、YZ-02、U3 和SH-1 可以降低斑馬魚肝臟中的甘油三酯含量，菌株YZ-01、ND-1 和U3 可有效緩解斑馬魚中脂滴的沉積.綜合來看，菌株U3 和ND-1 對斑馬魚肝臟脂肪肝的降脂效果最好，16S rDNA 測序比對以及構建系統發育樹結果顯示，菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌聚為一支，菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌聚為一支.上述研究表明，采用益生菌緩解動物體內尤其是肝臟中脂肪的積累具有明顯效果.