再生障礙性貧血診斷標志物研究進展

胡子然 陳濤 李哲媛 張曉琳 林欣 蔡凌翼 于小凡 賈曉宇 李蓯洲 王金環

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種以造血細胞譜系減少,主要以全血細胞減少為特征的骨髓造血衰竭疾病(bone marrow failure,BMF),主要分為先天性和獲得性兩大類,先天性AA發病率低,其中絕大多數患者屬于原發性獲得性AA[1]。本病的病因及發病機制未明,其致病因素主要包括化學或物理損傷(包括藥毒性和輻射)、遺傳缺陷以及免疫介導異常[2]。細胞毒性T淋巴細胞分化異常、功能亢進所致造血干細胞和祖細胞顯著減少是AA的主要發病機制[3]。AA在我國的年發病率約為0.74/10萬,高于世界平均水平2～3倍,可發生于各年齡段,但好發于青壯年(15～25歲)以及老年群體(65～69歲),且無明顯性別差異[4]。一部分AA患者會并發高危的血細胞減少癥,約15%的患者會發展為骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)或急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML);重型AA患者(severe aplastic anemia,SAA)如果缺乏有效的治療,2年存活率只有30%左右,嚴重影響AA患者的生存質量與生存率[5-8]。因此,AA對患者帶來的不良后果與預后導致臨床迫切需要一種簡便、易耐受、高效的檢測方法,但目前AA的診斷仍僅局限于排除性診斷,精確的診斷標準和診斷標志物成為影響該病患者治療與預后的關鍵因素之一。一些新發現的蛋白質或miRNA分子為AA的診斷及分期提供了更加科學高效的支持。特別是運用一些靈敏且準確的蛋白質生物標志物作為檢測指標,可以更好地進行AA的診斷、治療方案的選取以及預后的判定。本研究將對AA的診斷標志物進行綜述,以期為診斷及治療提供新的思路。

1 外周血生物標志物

1.1 抗COX-2自身抗體(Anti-COX-2 autoantibody) Kelkka等[2]發現了一種與健康對照組差異倍數>20的免疫性再生障礙性貧血(immune aplastic anemia,IAA)限制性自身抗體蛋白Anti-COX-2 autoantibody(aCOX-2 ab)。隨后他們在一個包括405例IAA患者、815例健康對照的試驗中發現,以ROC曲線轉折點為陽性閾值的情況下,37%的成年IAA患者aCOX-2 ab陽性表達,同時陽性患者血小板計數水平更低,aCOX-2 ab陽性與診斷時的血小板計數之間也存在統計學相關性(OR=1.34)。aCOX-2 ab在HLA-DRB1*15∶01陽性患者中表現出了高特異性與高敏感度[2]。這意味著二者可能共同確定了一種類型的IAA,盡管相關機制尚未明了。同時已有研究表明HLA-DRB1*15∶01陽性的AA患者對環孢素A的治療更為敏感,療效更加顯著,環孢素A也因為其相對低廉的治療成本及較少的不良反應在國內應用最為廣泛[9-10]。免疫抑制療法(immunosuppressive therapy,IST)或者艾曲泊帕等生長因子受體激動劑的治療效果并未在aCOX-2 ab陽性與陰性患者之間顯示出差異性,但由于aCOX-2 ab陽性患者的樣本量僅13例,且中位年齡較小,因此還需繼續驗證[2]。相比較于骨髓活檢以及骨髓穿刺,解離增強鑭系元素滎光免疫檢測(DELFIA)檢測所需的血清樣本采集更加簡便且更易耐受。aCOX-2 ab聯合HLA-DRB1*15∶01是較為理想的AA診斷指標組合,對AA的篩查具有良好的臨床應用價值,同時該標志物的高敏感度與特異性也為解決鑒別AA與其他BMF的長久困難提供新的方向。

1.2 循環Dickkopf-1(DKK1)蛋白 Giudice等[11]使用SOMAscan技術篩選了28例AA患者治療前后的血清蛋白,以及7例接受標準IST治療和TPO受體激動劑治療的SAA患者的血漿蛋白,總共發現了有希望成為AA診斷或者預后指標的19種血清蛋白和28種血漿蛋白。為了確認該結果的普遍性,他們采集了65例SAA患者在接受治療前、IST 6個月、IST1年的血清樣本進行Luminex檢測,基于AA的發病相關性選擇其中以Dickkopf-1(DKK1)為代表的4種蛋白進行驗證。根據患者預后情況分為完全緩解組、部分緩解組以及無緩解組,ANOVA分析顯示:完全緩解組血清DKK1蛋白水平在治療前、IST 6個月以及1年后顯著高于其他2組。通過非配對T檢驗發現,DKK1蛋白在完全緩解組與無緩解組之間的特異性比其他3種蛋白更為顯著。將1年的隨訪數據生成Logistic回歸和廣義線性模型以預測IST預后情況,把患者治療前和IST 6個月的數據應用于該函數得到:以DKK1蛋白水平為代表的數學模型對治療前的患者反應性的預測敏感度為48%、特異度達到82%,而在治療6個月時的預測敏感度可達76%、特異度為83%,與實際結果對比準確率為79%[11]。血小板是循環DKK1蛋白產生的主要來源[12]。Giudice等[11]發現AA患者血清循環DKK1蛋白水平低于正常對照組1.5倍的現象也在一定程度解釋了AA患者血小板計數下降的問題。DKK1蛋白在血液系統疾病中的相關研究較少,此次發現可能也預示了其在AA等免疫介導異常所致的血液病中的診療潛力。血清DKK1對于提高AA的診斷檢出率有一定幫助,其在預測IST療效表現出了高敏感度和特異度,為AA預后的預測提供了新方向。雖然缺少DKK1蛋白預測模型在其他AA治療方式中的研究比對,但綜合已有研究也可發現,DKK1蛋白對臨床治療方案的選取仍具有一定的參考價值。

1.3 Component 1q(1Q) C1q是補體經典途徑C1的一個亞基,它可調節各種免疫細胞,不僅參與啟動機體抵御病原體的第一道防線,而且在固有免疫和特異性免疫過程中發揮主要的樞紐作用[13]。Ding等[14]發現,134種蛋白質在NSAA患者和正常對照之間存在差異表達,而C1q差異表達更為顯著。他們之后通過酶聯免疫吸附測定測定40例治療前NSAA患者、40例緩解期NSAA患者、20例SAA患者、20例特發性血小板減少性紫癜患者和20例自身免疫性溶血性貧血患者以及20例健康個體血清樣本C1q濃度證實:NSAA組血清C1q水平在治療前明顯低于正常對照組以及緩解期NSAA組。此外,NSAA組血清C1q水平低于SAA組,但是SAA組、正常對照組和緩解期NSAA組血清C1q水平差異無統計學意義。為更好了解C1q的臨床臨床意義,將血清C1q水平與NSAA臨床指標包括血細胞計數和免疫指標進行相關性分析,血清C1q濃度與粒細胞計數、血紅蛋白含量、血小板計數和網織紅細胞比率呈正相關。此外,血清C1q濃度與mDC/pDC比值呈正相關與CD4/CD8比值呈負相關。這些結果表明,補體途徑在AA的免疫發病機制中起到重要作用。C1q在SAA與NSAA的差異表達,為疾病嚴重程度的判定提供了一個新的可靠生物標志物。雖然運用酶聯免疫吸附測定進行血清C1q檢測是簡便高效的,但是C1q水平變化是否具有臨床診療價值,仍然需要大量的相關研究來驗證。

1.4 細胞毒T淋巴細胞抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4) 調節性T淋巴細胞(Treg)是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群,Treg的免疫調節功能主要通過抑制T細胞增值,以及細胞因子和自身抗體的產生來表現。同時,它可調節樹突狀細胞(DC細胞)、單核巨噬細胞以及NK細胞的功能。既往研究顯示,AA患者的Treg細胞含量低于正常人,且功能缺損,分泌細胞因子的非Treg增加[15]。在SAA患者群中,Treg數量普遍低于NSAA患者,但在IST后數量可有恢復,這提示Treg具有用于疾病的診斷、嚴重程度的分析以及預后監測的潛力。目前已知SAA發病機制是髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell,mDC)被某些未知抗原激活,使其抗原呈遞異常,產生大量Ⅰ型淋巴細胞因子,激活CD8+T細胞,從而導致骨髓造血衰竭。而DC的主要調節靶點是Treg細胞,且此過程主要依賴于抗原刺激[16]。Liu等[17]實驗結果顯示Treg細胞表面上的CTLA-4表達與mDCs表面上的HLA-DQ表達呈負相關。該結果表明,SAA患者外周血中Treg數目和CTLA-4表達減少,并且mDC的異?；罨赡苁怯捎趍DC上的MHCⅡ類分子抗原呈遞異常引起的,從而啟動了一系列的免疫細胞活化,Treg對mDCs的調節作用通過CTLA-4與HLA-DQ共同實現。結合AA臨床免疫細胞分析,SAA患者外周血Treg細胞表面CTLA-4表達與NK細胞數、CD4+T/CD8+T比值呈正相關,與CD8+T細胞數呈負相關;mDC表面HLA-DQ表達與外周血Treg細胞數、NK細胞數、CD4+T/CD8+T比值呈負相關。目前已有學者將CTLA-4單克隆抗體作為SAA等自身免疫性疾病治療靶點進行研究,而該抗體已用于腫瘤臨床治療中且取得了良好的療效[18]。以上結果證實CTLA-4水平與SAA相關臨床指標的顯著相關性,為IST療效提升及疾病復發監測的研究提供了思路;同時,mDC上的MHCⅡ類分子HLA-DQ調節機制可能揭示了Treg細胞的作用靶點。

2 基于分子水平的診斷指標

2.1 miRNA分子 miRNA是一組內生的非編碼小分子RNA,一般含有18～25個核苷酸。Xiao等[19]提出miRNA對于調節免疫具有重要作用。miRNA也可存在于細胞外如微泡、外來體和微粒中。這些循環miRNA可以在血清、血漿、尿液和唾液中被檢測和定量[20]。循環miRNA可反映機體的生理和病理狀況,并且具有高度穩定性,這使其具有充當各種疾病的生物標志物的能力[21]。Hosokawa等[22]在AA患者血漿中發現3種比例失調的miRNA且與正常人群相比差異倍數>1.5倍,其中miR-150-5p、miR 146-5p比例上調,miR-1比例下調,同時在患者接受IST后,三者比例向正常水平回歸。但是miR-150-5p僅在治療有效的患者間顯著降低,而無論IST對患者是否有效,miR-1水平均會上升。并且他們發現,在AA與MDS患者之間存在5種差異明顯的miRNA(miR-150-5p、miR-146-5p、miR-1、miR-22-3p和miR-424-5p),這些miRNA分子具有繼續研究以鑒別AA與MDS的價值。Hosokawa等[22]提出了一種新的檢查方式以提高AA診斷陽性率并且監測AA對IST的反應,也為未來揭示疾病發展中相關循環miRNA的潛在作用機制,以及其與IST關聯性提供思路。該研究也反映了體液檢查在鑒別AA和MDS中的應用與研究價值,體液檢查由于具備患者易耐受的特點,因此也更好在臨床中推廣。

2.2 RNA拷貝數 Wilms tumor 1(WT1)是一種腫瘤抑制基因,可識別間皮細胞增生、惡性間皮瘤、卵巢囊腺癌、性腺母細胞瘤、腎母細胞瘤及結締組織增生性小圓細胞腫瘤,在血液惡性腫瘤和其他腫瘤患者的未成熟胚細胞中過表達[23-25]。Ishiyama等[26]發現,WT1基因在獲得性AA患者外周血中表達增加,隨后用定量PCR(聚合酶鏈反應)試劑盒對63例AA患者和5例MDS患者的WT1拷貝數(/μgRNA)進行連續測量,首次測量時,41%未接受治療的AA患者WT1陽性表達,而59%的正在接受治療的患者體內WT1基因呈陽性,之后2～105個月的隨訪發現,大多數AA患者的WT1拷貝數逐漸增加,但只有3例AA患者WT1拷貝數的最大變化率>20.0(WT1拷貝數的最大值與首次測量的WT1拷貝數的比值),并且這3例患者分別在第2、46和105個月時并發骨髓增生異常綜合征。MDS患者的WT拷貝數690～5 700(中位數2 000)一直保持較高水平,而在大多數拷貝數>50WT1陽性AA患者中,WT1基因主要在粒細胞富集而非單核細胞中。這提示AA患者體內WT1拷貝數持續增加可能是由于粒細胞中WT1基因表達增加。實驗表明,在緩解期AA患者中,WT1拷貝數變化率>20.0的患者可能會有發生MDS的風險,需要審慎監測[27]。雖然該實驗中發展為MDS/AML的AA患者的WT1拷貝數變化率高達20.0,但由于AA患者的觀察期(中位數46個月)可能不足以進行病情演變,一些WT1拷貝數中等偏高的患者在較長的觀察期后可能存在病情變化的潛在風險。目前AA和低增生MDS之間很難鑒別[27]。如果在早期檢查骨髓,則診斷為AA;如果出現某些克隆的情況下進行檢查,診斷將是MDS[28]。而WT1拷貝數變化率發現為AA與MDS相關發病機制的分子水平研究提供了新的方向。通過PCR監測AA患者體內的WT1數變化率有可能成為預測AA轉歸的生物標志物。

3 基于骨髓的檢驗診斷

在既往研究中,B10細胞對炎癥、自身免疫疾病和癌癥的免疫調節作用引起了廣泛關注[29-31]。Gu等[32]收集24例SAA患者、14例NSAA患者和20例正常人的骨髓后用淋巴細胞培養基分離出單核細胞進行體外培養并刺激細胞,隨后通過流式細胞術分離出細胞,免疫熒光雙標記測定IL-10與CD19的比值并以此來反映B10細胞及B10祖細胞在B細胞中的比例。有實驗結果表明,與健康對照組相比AA患者骨髓中B10細胞和B10祖細胞在CD19+B細胞中的比例降低,而SAA組骨髓B10細胞和B10祖細胞在CD19+B細胞顯著低于NSAA組,同時B10細胞比例與反映骨髓增生嚴重程度的臨床血液指標如周血中性粒細胞、網織紅細胞和血小板計數之間呈正相關,B10細胞水平越低,也意味著疾病越嚴重[1]。盡管B10細胞用于AA診斷的高效性與特異性還需在大樣本實驗中進一步探索,但是其與AA嚴重程度的相關性揭示了B10細胞的負性免疫調節在AA發病機制中的重要作用。郝立君等[33]報道了B10細胞影響免疫性血小板減少癥的發展和免疫調節,但是其在AA中的潛在作用機制以及作用靶點尚不清楚。聶甜等[34]的研究證實,再生膠囊可能通過促進AA大鼠外周血IL-10和TGF-β1水平的提高達到促進AA大鼠恢復骨髓造血的功能。B10細胞水平的干預是否有助于AA的治療,值得后期的進一步研究。

綜上所述,AA是臨床較為常見的骨髓造血功能衰竭性疾病。在AA的診斷方法中,血常規檢查應用最為普遍,也是先行診斷采取的方式,患者血紅蛋白、血小板及白細胞的數目明顯低于正常指數則提示AA,但該診斷方式不夠精確,容易出現漏診以及誤診[35]。骨髓相關檢查權威且可靠,它能最直觀地反映患者的骨髓造血情況,提高AA診斷的陽性率,至今仍然是一項重要的診斷方法。將傳統的診斷方法與前沿生物技術聯合能較大提高AA的診斷效率以及準確性。對于占絕大多數AA比例的IAA患者群體,aCOX-2 ab表現出了高度的敏感度及差異性,具有成為臨床診斷標志物的潛力,且運用現存的診斷技術檢驗該項指標是簡便且高效的,對于臨床應用及推廣具有很高的價值。隨著表觀遺傳學在各種疾病的診斷以及預后中不斷推廣,miRNA的差異表達等表觀學的改變也越來越受到重視,其在AA的診斷、鑒別及治療中的監測取得了良好的效果。但目前為止,患者依然未發現針對全部或者部分AA群體百分之百準確且特異的診斷標志物,聯合多種指標進行診斷疾病或許是未來精準檢測AA以及鑒別AA與其他BMF疾病的重要方式。針對AA發病機制的研究,以及探索各個指標在AA發病過程中的潛在免疫功能,仍然是未來研究的一大熱點。