細胞衰老與特發性肺纖維化相關機制的研究進展*

談華棟,劉明遠,伍 旭,詹 峰 綜述,倪吉祥 審校

(三峽大學第一臨床醫學院/宜昌市中心人民醫院西陵院區呼吸與危重癥醫學科,湖北 宜昌 443003)

特發性肺纖維化(IPF)是一種隨著年齡增長逐漸加重,主要表現為活動性呼吸困難,進行性加重,且不可逆的疾病。隨著對IPF臨床表現的認識不斷提高,高分辨率CT(HRCT)的廣泛使用及其他潛在因素導致IPF的患病率在過去20年中不斷上升,特別是在65歲以上的人群中[1],顯然IPF的發病率與衰老存在某種聯系。且IPF目前無法完全治愈,除了肺移植外,抗纖維化治療也只能部分阻止纖維化的進程[2]。衰老是一個以多種復雜因素相互作用為特征的過程,例如生理異常、危險因素的負面影響積累、異常細胞群和組織,從而導致整個生物體的進行性功能損害,也是IPF最重要的危險因素,其病理生理學特征包括端粒損耗、DNA損傷、蛋白質發育異常、線粒體功能障礙、氧化應激、自噬失調和內質網(ER)應激等[3]。在細胞水平上,衰老和IPF的病理學存在大量重疊,表現為細胞衰老標志物的表達增加。衰老的特征是細胞生長停滯和復制潛力降低,通過損害肺泡祖細胞的再生和促進促纖維化細胞環境,使肺易發生纖維化。在IPF中,肺泡2型上皮細胞表現出衰老標志物優先定位于成纖維細胞病灶的異常上皮細胞表達,特別是高水平的衰老蛋白轉錄產物[4]。本文主要對IPF細胞衰老相關發病機制及治療進展進行綜述。

1 端粒功能障礙

端粒是線性染色體末端的基因組部分。脊椎動物的端粒DNA是由TTAGGG重復序列和一組蛋白質組成的,這些蛋白質調節其生物功能,保護它們不被識別為DNA損傷,并且防止觸發DNA損傷反應(DDR)。在沒有端粒酶的情況下,標準的DNA聚合酶不能完全復制線性DNA模板,而且由于核酸裂解過程,DNA復制導致染色體端粒逐漸縮短。當端粒達到臨界長度時,其無法結合足夠的端粒封頂蛋白,并被感知為暴露的DNA末端,這就激活了DDR途徑[5]。然而,這種短端粒保留了足夠數量的端粒結合蛋白,以抑制DNA修復和避免融合,從而引發持續的DNA損傷信號,導致DNA損傷所誘導的永久性增殖停滯。進而啟動并維持細胞衰老,這是有機體衰老和多種年齡相關疾病的關鍵因素[6]。有研究表明,端粒功能障礙是可以概括IPF特征的,且已有研究在IPF中確定了幾個端粒相關基因的基因突變[7]。此外,在小鼠肺泡2型上皮細胞中,端粒的損傷促進了纖維化和衰老上皮細胞的積累[8]。一項meta分析認為,更長的端粒和降低間質性肺疾病(ILD)風險的關系從可能的證據升級為強有力的證據,即端粒長度的延長與IPF風險呈負相關[9]。同樣一篇關于端粒長度與健康相關結局的孟德爾隨機化研究分析指出,白細胞端粒長度延長與IPF風險降存在關聯。線粒體功能障礙和線粒體活性氧(mtROS)的產生會導致DNA損傷和無效修復,其中至少部分原因是由于端粒維持功能障礙[10]。持續的DNA損傷被激活而導致衰老的一系列反應,其中包括共濟失調-毛細血管擴張突變/核因子-κB(NF-κB)必需修飾劑(ATM/NEMO)、p53、纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號傳導。NF-κB也是通過p21等分子引起這種反應的重要介質,這些分子可能促進細胞衰老[11]。此外,NF-κB在IPF肺中的表達增加,其在肺泡上皮細胞中的特異性表達對于衰老是必需的[12]。最近的研究發現,PI3K/AKT失調與下游NF-κB活化之間存在機制關聯,導致促纖維化基因表達,其可能存在于成纖維細胞和上皮細胞中[13]。

2 細胞衰老表型

IPF的特點是存在抗凋亡和抗衰老的成纖維細胞,產生過度堅硬的細胞外基質(ECM)。ECM影響了細胞功能和組織穩態,異常的ECM與肺纖維化的發生密切相關。而衰老會逐漸改變ECM成分,并與衰老細胞的積累有關。衰老細胞通過表達與衰老相關分泌表型(SASP)相關的因子來促進與年齡相關的組織功能障礙,例如轉化生長因子-β(TGF-β)、基質金屬蛋白酶(MMP)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[14]。SASP具有強大的自分泌和旁分泌作用,并通過一些生物過程來調節組織微環境,如細胞增殖、遷移、炎癥、纖維化、ECM降解、新生血管形成、組織修復和再生、衰老清除和上皮-間質轉化(EMT)。另外,無論是NF-κB還是上述端粒功能障礙中提到的其他途徑,SASP特征都是炎癥蛋白的分泌。最近有研究表明,許多煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)代謝酶,包括煙酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT)、Sirtuins、ADP-核糖PARPs和 CD38,在ECM重塑和纖維化中起關鍵作用[15]。另外,NAD穩態也影響著IPF中衰老細胞的發育和功能,一方面,低NAD誘導的DNA損傷和線粒體功能障礙的積累可以促進衰老的發展;另一方面,細胞衰老的發展及其分泌表型似乎對代謝要求很高,衰老過程中發生的低NAD狀態可能會抑制細胞衰老的發展[16]。例如研究發現在IPF的衰老成纖維細胞中,線粒體的功能障礙降低了NAD+/NADH比值,而NAD+代謝控制著促炎SASP的產生[17]。另外有研究發現,衰老細胞分泌的TGF-β會導致鄰近的細胞衰老,因為TGF-β上調了細胞周期抑制劑p21、p27和p15,進而通過SMAD信號通路以旁分泌方式誘導鄰近細胞衰老,這可能對器官衰老很重要,尤其是在緩慢自我更新的組織(如肺)中,因為肺泡2型上皮細胞衰老可能會擴散到同一器官內的其他細胞[18]。老化的肺泡2型上皮細胞通過表達血小板源性生長因子(PDGF)、TNF、內皮素-1、結締組織生長因子(CTGF)、趨化因子CXC配體12(CXCL12)和PAI-1等SASP,來誘導成纖維細胞和肌成纖維細胞大量增殖和活化。其中一個顯著成分是PAI-1,其在肺泡2型上皮細胞中高度表達。PAI-1的過度表達促進ECM的積累,并作為細胞衰老的強誘導劑,特別是在肺泡2型上皮細胞中。TGF-β1通過多種信號通路增加PAI-1的表達[19],如TGF-β1誘導肺泡2型上皮細胞衰老,其衰老作用是由PAI-1介導的,TGF-β1通過激活素受體樣激酶5和Smad3磷酸化誘導肺泡巨噬細胞產生PAI-1[20]。此外,CTGF通過介導活性氧(ROS)積累誘導成纖維細胞衰老,導致p53的激活和p16INK4a的誘導。盡管SASP的分泌受與p53和Rb途徑相關的細胞周期停滯的調節,但抑制p53或Rb途徑不足以阻止SASP誘導的作用。雖然SASP的分泌可能發生在衰老成纖維細胞和肺泡上皮細胞中,但只有肺泡上皮細胞分泌的SASP似乎對纖維化的進展很重要。靶向細胞衰老可能是一種有前途的治療途徑,因為動物模型中的幾項研究表明,在給予senolytics(一種特異性靶向衰老細胞的藥物)后纖維化會減弱[21]。有研究報道,重組胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)的鼻內遞送可保護老年小鼠免于體重減輕,并在博來霉素肺損傷后顯示出抗纖維化作用。IGFBP2轉基因小鼠揭示了2型肺泡上皮細胞中的衰老和SASP因子減少,并且其改善了博來霉素誘導的肺纖維化[22]。與過敏性肺炎和(或)慢性阻塞性肺疾病患者相比,從IPF和(或)肺動脈高壓患者的纖維化肺區域分離的肺泡上皮2型細胞中IGFBP2表達受到顯著抑制。

3 線粒體穩態

線粒體穩態與細胞衰老的調節密切相關,其作為重要的細胞器,在細胞能量產生和代謝穩態中起著關鍵作用。在IPF的發病機制中,線粒體功能障礙主要涉及線粒體ROS水平失衡、線粒體DNA的改變、線粒體介導的自噬減少和電子傳遞鏈失衡。有研究表明,線粒體功能障礙所參與的IPF組織細胞的凋亡與衰老,被認為是衰老時易發生纖維化的重要標志。線粒體生成的ROS增加可誘導肺纖維化,ROS可以激活TGF-β,TGF-β也可以反過來激活ROS,如此形成惡性循環[23]。氧化酶4(NOX4)被認為是線粒體功能障礙的中介[24]。NOX4酶與線粒體相互作用,影響線粒體功能及線粒體ROS和SIRT的產生,共同促進上皮損傷和肺纖維化[25]。由于線粒體膜上的磷脂對反應性物質的敏感性,長期暴露于ROS可導致線粒體氧化損傷,并可進一步誘導更多的ROS產生。NOX4還通過控制Smad2/3和調節PDGF誘導成纖維細胞遷移來調節α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原蛋白的含量[26]。此外,線粒體功能障礙的積累還導致了NADH氧化為NAD的減少,并降低NAD/NADH比值,進而激活AMPK和p53,導致衰老表型[27]。在香煙煙霧誘導的肺纖維化小鼠模型中,香煙煙霧通過增加線粒體ROS和減少自噬和線粒體自噬來誘導2型肺泡上皮細胞衰老[28]。最近還有研究表明,線粒體質量維持機制(如線粒體生物發生和線粒體自噬)的破壞也可能使2型肺泡上皮細胞易衰老。由于表面活性劑產生的高代謝需求,2型肺泡上皮細胞特別容易受到線粒體功能障礙的影響。在IPF患者的2型肺泡上皮細胞中觀察到異常增大和腫脹的線粒體[29]。

參與衰老和線粒體功能的特定蛋白質在IPF中失調。例如,磷酸酯酶與張力蛋白同系物(PTEN)誘導的激酶-1(PINK1)通常促進線粒體自噬并穩定線粒體膜完整性。一些研究強調了PINK1在纖維化中的重要性,因為PINK1缺陷小鼠更容易發生纖維化[30]。PINK1還提供了ER應激和線粒體功能障礙之間的機制聯系。ER應激通過激活轉錄因子3(ATF3)下調PINK3,并通過ATF4導致線粒體未折疊蛋白反應(UPR)的類似程序發生[31]。與PINK1缺乏相關的線粒體功能障礙則通過釋放線粒體DNA(mtDNA)導致纖維化,mtDNA激活Toll樣受體(TLR)并刺激TGF-β[32]。

與衰老相關的端粒功能障礙還可通過p53介導的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)共激活因子-1α(PGC-1α)和PGC-1β的下調抑制了線粒體生物發生途徑,導致線粒體質量進一步受損及mtROS產生增加[33]。端粒相關DNA損傷可誘導雷帕霉素(mTOR)的機制靶標,并通過增加mtROS產生促進上皮衰老。因此,mTOR在幾種慢性肺部疾病中上調,包括IPF[34]。因此,IPF中線粒體功能障礙具有重要地位,同時也有待進一步研究。

4 自 噬

在纖維化模型中觀察到的自噬受損,可能代表IPF的致病性特征。自噬為一種細胞穩態程序,其通過隔離在雙膜結合的自噬體中和隨后的溶酶體依賴性降解來控制長壽命蛋白質和功能失調的細胞器(即線粒體)的周轉。誘導自噬是抗衰老途徑的標志,在細胞應激期間充當促生存機制,包括ER應激、缺氧和氧化應激。越來越多的研究表明,mTOR介導的通路可能在促進IPF方面發揮不可或缺的作用。mTOR是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,具有mTORC1和mTORC2 2種復合物形式。mTORC1主要在不利環境中調節細胞生長和自噬,從而改變成纖維細胞的增殖和活力;mTORC2主要作用于細胞骨架蛋白構建和細胞存活[35]。TGF-β可通過激活自噬抑制劑mTOR復合物1(mTORC1)抑制自噬,而mTORC1在衰老細胞和IPF細胞中的持續激活,導致了自噬減少[36]。有新的研究發現,tetrandrine恢復了TGF-β1誘導的受損自噬通量,并伴SQSTM1和MAP1LC3-Ⅱ相互作用增強,同時tetrandrine通過增加NRF2和SQSTM1啟動子的結合來誘導自噬。此外,tetrandrine通過減少Rheb的激活來抑制TGF-β1誘導的mTOR磷酸化[37]。因此,在未來,tetrandrine可能會給IPF提供一種新的治療方式。自噬受損在IPF發病機制中的功能意義尚不清楚,但可能與線粒體質量控制受損、脂質和膠原蛋白周轉受損及病原體清除受損等因素有關。有研究發現,表面活性蛋白C突變導致自噬晚期阻滯和p62在2型肺泡上皮細胞中的積累[38]。p62的積累可能與纖維化相關的異常下游信號傳導有關,包括NF-κB調節和NRF2調節。有研究評估了泛素特異性蛋白酶13(USP13)在年齡相關性肺纖維化中的作用,并證明了USP13缺陷的老年小鼠表現出自噬活性受損,并且對博來霉素誘導的纖維化增加了脆弱性。在機制上,USP13與Beclin1相互作用并去泛素化,Beclin1過表達消除了USP13破壞的影響。此外,Beclin1抑制導致了博來霉素損傷后自噬不足和更嚴重的肺纖維化,并且與老年USP13缺陷小鼠的表型一致。另外,在甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)基因內含子中編碼的microRNA-33家族是甾醇和脂肪酸代謝的主要調節因子,microRNA-33控制巨噬細胞免疫代謝反應并增強線粒體生物發生、脂肪酸氧化和膽固醇外排。巨噬細胞中microRNA-33的缺失可改善線粒體內穩態并增加自噬,同時減少博來霉素損傷后的炎癥反應。并且通過施用抗microRNA-33肽核酸(PNA-33)對巨噬細胞中microRNA-33的藥理學抑制可減輕不同體內和離體小鼠肺纖維化模型的纖維化[39],此發現也為IPF提供了潛在的新治療方法。

5 ER應激

在IPF中,ER應激和UPR已被確定為纖維化的上游介質,且ER應激和UPR的標志物在IPF肺的2型肺泡上皮細胞中升高[40]。2型肺泡上皮細胞對蛋白質穩態特別敏感,因為其會產生大量表面活性劑蛋白質。ER應激的標志物出現在IPF患者的無癥狀親屬和IPF肺的組織學正常區域,表明ER應激在疾病的發展中很重要[41]。在纖維化肺中觀察到ER應激期間ER蛋白折疊伴侶(例如FK506結合蛋白13)的表達增加,并且與較差的肺功能相關[42]。ER相關降解(ERAD)可防止ER中錯誤折疊蛋白的積累,但該過程的生理調節仍不明確。但有研究發現,一種抗病毒RNA干擾途徑,稱為ER相關RNA沉默(ERAS),其與ERAD一起作用以保持ER穩態和功能。在ER應激的誘導下,ERAS由精氨酸蛋白RDE-1/AGO2介導,在哺乳動物中促進ER相關RNA周轉[43]。

ER應激中的UPR信號通路首先在酵母中發現,其中ER應激僅由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/內切核糖核酸酶肌醇需要的酶1(IRE1)控制。這與脊椎動物形成鮮明對比,脊椎動物主要由3個信號調節UPR:IRE1、ATF-6β和蛋白激酶R樣ER激酶(PERK)。這些途徑將ER中蛋白質折疊狀態的信息傳遞到細胞質和細胞核,以恢復蛋白質折疊能力。ER伴侶結合免疫球蛋白(BiP)(也稱為GRP-78)與IRE1α結合導致其失活[44]。在ER作用下,BiP優先與錯誤折疊的蛋白質結合,隨后從PERK和IRE1中釋放出來,從而啟動這些蛋白質的二聚化。近期一項研究在肺泡上皮2型細胞中特異性地誘導敲除ER伴侶GRP78,其丟失導致了ER應激/未折疊的蛋白質反應、細胞凋亡、衰老和肺泡上皮2型細胞的祖細胞能力受損,以及年齡相關的肺纖維化[45]。GRP78敲除小鼠發展成具有IPF幾個特征的肺纖維化,包括老年小鼠的敏感性增加。GRP78敲除和IPF肺的纖維化在ER應激抑制劑TUDCA的離體培養中得到改善。此外,GRP78在老年小鼠和IPF患者的AT2細胞中減少,表明GRP78減少是將衰老與IPF聯系起來的潛在機制[45]。

6 小 結

隨著新技術的進步,人們對細胞衰老與IPF之間有了更透徹地了解,病因的確定可以建議治療方案,包括試圖抵消端?？s短或抵消tDDR活化、使用特異性靶向細胞衰老藥物、抑制相關炎癥反應、調節線粒體及ER的功能穩定等。但是或許有其他因素參與其中還未被發現,所以對于IPF疾病的發生發展仍需更深入的研究。