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miR-93-5p/FOXJ2軸介導胃癌細胞的生物學功能

2024-04-27 15:43沈蕾鈕淵杰宋巍陳二林
交通醫學 2024年1期
關鍵詞:報告基因熒光素酶細胞系

沈蕾 鈕淵杰 宋巍 陳二林

[摘 ? 要] ? 目的:評估miR-93-5p對胃癌細胞的調節和功能。方法:采用qPCR檢測miR-93-5p在胃癌組織、胃癌細胞系中表達,MTT、克隆形成、Transwell實驗檢測miR-93-5p對胃癌細胞增殖、侵襲的影響,雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-93-5p與FOXJ2的靶向關系。結果:miR-93-5p在胃癌細胞系和胃癌組織中表達升高,抑制miR-93-5p表達后胃癌細胞增殖和侵襲能力受抑。雙熒光素酶報告基因檢測顯示,miR-93-5p mimic顯著降低MKN28和MKN45細胞Wt-FOXJ2相對熒光素酶活性,FOXJ2為胃癌細胞中miR-93-5p的直接靶基因。結論:miR-93-5p靶向FOXJ2促進胃癌細胞的增殖和侵襲,miR-93-5p/FOXJ2軸可能是判斷胃癌預后的生物標志物和治療靶點。

[關鍵詞] ?胃癌;miR-93-5p;腫瘤標志物;增殖和侵襲;生物學功能

[中圖分類號] ? R735.2 [文獻標志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.001

miR-93-5p/FOXJ2 axis mediates biological function of gastric cancer cells

SHEN Lei1, NIU Yuanjie2, SONG Wei2, CHEN Erlin3

(1Department of Laboratory Medicine; 3Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Jiangsu 226001;

2Medical College of Nantong University)

[Abstract] ? Objective: To evaluate the regulation and function of miR-93-5p on gastric cancer cells. Methods: qPCR was used to detect the expression of miR-93-5p in gastric cancer tissue and gastric cancer cell lines. MTT, clone formation and Transwell were used to test the effect of miR-93-5p on proliferation and invasion of gastric cancer cells. Double luciferase reporter gene experiment was performed to test the targeting relationship between miR-93-5p and FOXJ2. Results:The expression of miR-93-5p was upregulated in gastric cancer cell lines and tissues, and the proliferation and invasion ability of gastric cancer cells was inhibited after inhibiting miR-93-5p expression. Double luciferase reporter gene detection showed that miR-93-5p mimic obviously decreased the relative luciferase activity of Wt-FOXJ2 in MKN28 and MKN45 cells, and FOXJ2 was the direct target gene of miR-93-5p. Conclusion: miR-93-5p targets FOXJ2 to promote the proliferation and invasion of gastric cancer cells, and miR-93-5p/FOXJ2 axis may be a biomarker and therapeutic target for the prognosis of gastric cancer.

[Key words] ? gastric cancer; miR-93-5p; tumor markers; proliferation and invasion; biological function

胃癌是常見的惡性腫瘤,是全球癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。盡管人們對胃癌的認識不斷提高,但是其發生和發展的分子機制仍較模糊,鑒定胃癌相關生物標志物具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)對細胞增殖、遷移和侵襲具有顯著調節作用,對不同腫瘤發揮致癌或抑癌作用。miRNA屬于高度保守的非編碼小RNA,主要通過與mRNA 3′UTR的直接作用抑制基因表達[2]。miRNA既可以作為致癌基因,也可作為抑制劑,通過靶向多種轉錄本參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程,與腫瘤的發生發展有關[3]。有研究發現,在胃癌組織中miR-93-5p表達減少,并與HCP5/WNT5A負相關性[4]。然而,miR-93-5p影響胃癌發展的機制尚不清楚,本研究旨在評估miR-93-5p對胃癌細胞系的調節和功能。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 組織標本和細胞培養 ? 隨機選取2021—2022年南通大學附屬醫院接受胃癌根治術患者35例,獲取手術切除的癌組織及其配對癌旁組織標本。人胃癌細胞系MKN28、BGC-823、SGC-7901和MKN45以及正常細胞系GES-1購自中國科學院細胞庫(上海)。BGC-823和SGC-7901細胞培養于含10%胎牛血清(FBS,Gibco)的RPMI-1640(Gibco,Carlsbad,CA,USA)培養基中,MKN28和MKN45細胞培養于含10%FBS的DMEM(Gibco)培養基中,置于37 °C、5%CO2培養箱中培養。本研究獲得南通大學附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2 ? 蛋白質印跡分析 ? 采用裂解液從胃癌組織和細胞中分離總蛋白質,測定蛋白質濃度?;贐io-Rad 蛋白質測定系統(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)鑒定蛋白質濃度。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,然后將其轉移至PVDF膜(Millipore)。按照制造商的說明書,用適當的抗體對膜蛋白進行免疫印跡,使蛋白質條帶可視化和量化。FOXJ2一抗(Santa Cruz)稀釋比例為1 ∶ 1 000。N-cadherin一抗(Proteintech)稀釋比例1 ∶ 5 000。Vimentinn一抗(Proteintech)稀釋比例1 ∶ 3 000。β-actin一抗(Proteintech)稀釋比例1 ∶ 10 000。二抗為兔來源(Proteintech),稀釋比例1 ∶ 10 000。采用ECL顯影。

1.3 ? 實時定量PCR ? 采用TRIZOL試劑(Invitrogen)提取腫瘤組織和細胞中總RNA。使用cDNA Synthesis Kit(Takara, Tokyo,Japan)合成cDNA。miRNA和mRNA的qPCR按照制造商(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)說明書使用特定引物進行。miRNA和mRNA的qPCR的內參分別為U6或β-actin mRNA。引物序列:miR-93-5p:5′-GCCGCCAAAGTGCTGTTC-3′(Forward),5′-CAGAGCAGG-GTCCGAGGTA-3′(Reverse);U6:5′-CTCGCTTCGG-GCAGCACA-3′(Forward),5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′(Reverse)。

1.4 ? 熒光素酶報告基因實驗 ? 細胞以1×105個/孔的密度接種于24孔板中,轉染前繼續培養24 h。熒光素酶報告基因實驗體系為0.5 μg pGL3-FOXJ2-3′UTR或pGL3-FOXJ2-3'UTR Mut質粒、0.05 ng pRL-TK對照載體(Promega,USA)和100 nmol/L miRNA,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)進行轉染。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega,USA)檢測熒光素酶活性,通過海腎熒光素酶活性評估標準化。

1.5 ? 細胞增殖和克隆形成實驗 ? 將3×103個細胞/孔接種在24孔板中,在完全培養基中培養。隨后細胞用20 μL MTT(5 mg/mL)處理并培養4 h。棄去培養基后,將甲臜晶體重新懸浮在二甲基亞砜(DMSO)中,立即使用酶標儀在490 nm處檢測吸光度。將1×103個細胞/孔接種在6孔培養板中,在完全培養基中培養。培養1天后,用甲醇固定,0.1%結晶紫染色,統計細胞集落個數。對至少50個細胞組成的集落個數進行評分。

1.6 ? Transwell實驗 ? 通過transwell室(BD Biosciences)測定細胞遷移和侵襲能力。轉染后24 h收集轉染細胞,將3×105個轉染細胞或對照細胞培養于上室的無血清培養基中,將含10%FBS培養基500 μL添加到下室。培養2天后,用棉簽從transwell膜表面擦棄未遷移和未侵入的細胞,甲醇固定殘留在基質上的細胞,0.1%結晶紫染色,計算細胞個數。

1.7 ? 統計學處理 ? 應用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示,兩組間比較采用t檢驗;單向方差分析用于評估不同組中變異的顯著性。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 ? 結 ? ? ?果

2.1 ? miR-93-5p在胃癌中過表達 ? qPCR分析顯示,與正常細胞系相比,4個胃癌細胞系BGC-823、SGC-7901、MKN28和MKN45中miR-93-5p表達水平均明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。加入miR-93-5p inhibitor后,MKN28和MKN45細胞中miR-93-5p表達顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1B)。胃癌組織中miR-93-5p表達水平高于配對癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1C)。

2.2 ? miR-93-5p inhibitor抑制胃癌細胞增殖和侵襲 ? 為了進一步探索miR-93-5p在胃癌發展中的作用,使用miR-93-5p inhibitor轉染MKN28和MKN45細胞,在體外進行MTT實驗、克隆形成實驗和Transwell實驗。MTT實驗表明,miR-93-5p inhibitor抑制MKN28(第5天NC:5.6±0.4;miR-93-5 p inhibitor:2.7±0.2)和MKN45(NC:5.9±0.4;miR-93-5p inhibitor:2.8±0.3)細胞增殖(圖2A)??寺⌒纬蓪嶒灡砻?,miR-93-5p inhibitor抑制MKN28(NC:219±22.7;miR-93-5p inhibitor:86±9.3)和MKN45(NC:192±21.5;miR-93-5p inhibitor:89±7.2)細胞的克隆形成能力(圖2B)。Transwell實驗表明,miR-93-5p inhibitor抑制MKN28(NC:205±5.8;miR-93-5p inhibitor:41±5.6)和MKN45(NC:218±5.6;miR-93-5p inhibitor:89±2.51)細胞的侵襲能力(圖2C)。

2.3 ? FOXJ2是miR-93-5p在胃癌細胞中的直接靶點 ? 為了確認FOXJ2是否為miR-93-5p的靶點,推測miR-93-5p結合位點位于FOXJ2 mRNA的3′UTR中,將FOXJ2野生型(Wt-FOXJ2)或突變型(Mut-FOXJ2)3′UTR片段克隆到雙熒光素酶報告基因載體中,隨后共轉染miR-93-5p mimic或miR-NC(陰性對照)進行雙熒光素酶報告基因檢測。結果顯示,在MKN28和MKN45細胞中,miR-93-5p mimic均顯著降低Wt-FOXJ2相對熒光素酶活性,差異有統計學意義(P<0.05),但Mut-FOXJ2熒光素酶活性與陰性對照組相比無顯著變化(圖3),表明FOXJ2與miR-93-5p之間存在靶向調控作用。

2.4 ? FOXJ2部分逆轉miR-93-5p介導的胃癌進展 ? 為了驗證miR-93-5p是否通過靶向FOXJ2在胃癌進展中發揮生物學作用,用miR-93-5p inhibitor和FOXJ2干擾質粒共同轉染MKN28和MKN45細胞??寺⌒纬蓪嶒烇@示,miR-93-5p inhibitor對MKN28(NC:201±19.8;miR-93-5p inhibitor:73±8.3;miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2:152±11.8)和MKN45(NC:208±14.3;miR-93-5p inhibitor:89±6.2;miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2:169±12.5)細胞增殖的抑制可以被si-FOXJ2逆轉(圖4A)。Transwell實驗表明,miR-93-5p inhibitor對MKN28(NC:229±4.8;miR-93-5p inhibitor:47±5.3;miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2:187±5.2)和MKN45(NC:256±6.7;miR-93-5p inhibitor:52±3.1;miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2:192±4.2)細胞侵襲的抑制可以被si-FOXJ2逆轉(圖4B)。將miR-93-5p inhibitor轉染到MKN28和MKN4細胞中,Western blot分析顯示,miR-93-5p inhibitor顯著促進FOXJ2表達蛋白質水平。此外,miR-93-5p inhibitor能抑制N-cadherin和Vimentin的表達,但這種抑制可被si-FOXJ2逆轉(圖4C)。

3 ? 討 ? ? ?論

由于缺乏早期有效診斷胃癌的生物標志物,多數患者確診時已處于晚期,導致預后不良[5]。EMT是上皮細胞向間充質狀態轉化的過程,與癌癥的侵襲和轉移密切相關[6-8]。既往研究表明,miR-93-5p與胃癌進展密切相關,miR-93-5p過表達會導致胃癌患者發生遠處轉移和不良預后[7]。本研究發現miR-93-5p在胃癌組織中上調,miR-93-5p增加胃癌細胞增殖和集落形成能力。抑制miR-93-5p表達后可通過抑制N-cadherin和Vimentin的表達,從而抑制胃癌細胞EMT的信號通路。E-cadherin和Vimentin是EMT標記物,而EMT誘導物(Snail、Twist1和Prrx1)與癌癥相關[9]。同時,據報道miR-93-5p也可以抑制MKL-1的表達,從而抑制乳腺癌細胞EMT[10]。提示失調的miR-93-5p作為致癌miRNA參與胃癌的進展。

據文獻報道,miR-93-5p可通過Hippo信號通路失活促進胃癌的發展[11]。除胃癌外,miR-93-5p還可調控非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的增殖和遷移。miR-93-5p表達上調與NSCLC預后不良相關[12]。此外,FOXJ2在胃癌細胞系中表達水平較低。本研究通過生物信息學工具預測miR-93-5p與FOXJ2之間的靶向關系,并通過雙熒光素酶報告基因測定進行了驗證。因此,miR-93-5p通過靶向FOXJ2促進腫瘤發生,應被視為新的治療靶點。本研究發現,miR-93-5p通過下調FOXJ2表達激活EMT信號通路,從而促進胃癌細胞的增殖和侵襲。

據報道,與分化、凋亡、增殖、代謝、遷移和侵襲相關的基因受Forkhead box(FOX)轉錄因子家族的調節[13]。Forkhead box j2(FOXJ2)屬于Forkhead box轉錄因子家族[14],存在于多種哺乳動物和其他脊椎動物[15-16],是一個新的Forkhead轉錄激活因子,能識別2種不同類型DNA序列,根據C-羧基末端的不同,分為FHX.L和FHX.S 2個亞型[15]。FOXJ2在胚胎發育早期開始表達,廣泛分布在成年組織中[17]。研究表明,FOXJ2參與調節細胞周期進程,參與腫瘤發生[18],調節細胞遷移和細胞周期[19-20]。WANG等[19]研究表明,FOXJ2通過調節E-Cadherin和波形蛋白降低腫瘤細胞的遷移能力,從而抑制乳腺癌轉移。一些觀察表明,升高的FOXJ2可抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲,并與E-Cadherin呈正相關[21]。此外,FOXJ2可能通過Notch信號通路促進非小細胞肺癌中EMT的發生[22]。我們發現miR-93-5p通過抑制FOXJ2促進胃癌細胞的增殖和侵襲,表明miR-93-5p與FOXJ2軸之間存在很強的相關性,對細胞增殖和腫瘤發生具有顯著影響。

綜上所述,miR-93-5p靶向FOXJ2促進胃癌細胞的增殖和侵襲,miR-93-5p/FOXJ2軸可能是判斷胃癌預后的生物標志物和治療靶點。

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[收稿日期] 2024-01-04

(本文編輯 ? 王曉蘊)

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