免疫層析技術在獸醫檢測領域的應用

朱向東，朱雅寧，劉 偉，趙 靜，趙玉錳

（天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402）

免疫層析技術是上世紀70 年代出現的一種血清學檢測技術，以抗原-抗體特異性的免疫學反應和層析技術為技術基礎，利用毛細管床的虹吸作用和示蹤顆粒顯色反應，大約5～15 min 可直觀地觀察到檢測結果，具有操作簡便、檢測快速、成本低廉等優點，適合臨床快速檢測應用。

免疫層析技術包括雙抗夾心法和競爭法兩種。雙抗夾心法是在信號發生區發生抗原夾心免疫反應，當檢測線和質控線均顯色時判定為陽性結果，若檢測線不顯色而質控線顯色時判定為陰性結果。競爭法則正好相反，當檢測線和質控線均顯色時判定為陰性，而只有質控線顯色時判定為陽性。根據標記物不同，目前主要包括膠體金、熒光免疫層析、納米酶和液相芯片等四種免疫層析試紙條檢測技術。

1 膠體金免疫層析試紙條檢測技術

1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入免疫化學后，膠體金免疫層析技術快速發展并在獸醫檢測領域得到了廣泛的應用。2004 年姜建宏用原核表達制備偽狂犬病病毒gE 蛋白抗原和全病毒抗原研制了區分野毒感染和疫苗免疫的鑒別膠體金免疫層析法。2007 年王慧杰等建立了檢測豬圓環病毒Cap蛋白抗體的膠體金檢測方法，具有較強的靈敏性和穩定性。2008 年蔣韜等建立了O 型口蹄疫病毒免疫層析試紙條檢測方法，其靈敏性高于反向間接血凝試驗。2014 年張鑫宇等建立了非洲豬瘟病毒p54 抗體的膠體金檢測試紙條，敏感性可達到200 ng/mL，適合非洲豬瘟病毒感染早期檢測使用。2020 年王海麗等建立了羊布魯氏菌的膠體金檢測方法，具有特異、敏感、穩定、操作簡單快捷等特點，適合于羊布魯氏菌病抗體的現場檢測。2021 年李昕等利用雙抗體夾心法將口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗體作為標記膠體金，分別制備出檢測O、A、Asia 1 血清型的3種層析試紙卡，對O、A、Asia 1 型病毒的最低檢出量分別為0.567、0.693、0.219μg/mL，從而建立了口蹄疫病毒抗原血清型的快速分型和定量的檢測方法。2023 年余春明等建立了犬瘟熱、犬細小病毒膠體金二聯檢測卡，該方法特異性強，靈敏度好，可用于臨床快速診斷。

2 熒光免疫層析試紙條檢測技術

2.1 熒光微球免疫層析試紙條檢測技術 熒光微球進行標記時是通過共價結合的方式，提高了免疫探針的穩定性，與傳統的膠體金免疫層析試紙條相比，具有獨特的優勢。2014 年楊亞杰等建立了定量檢測牛乳中酪蛋白熒光微球免疫層析法，可快速、方便、高效的檢測牛乳制品中的過敏原（酪蛋白）。2016 年裴星瑤等建立了快速檢測雞飼料中喹乙醇含量的熒光微球免疫層析法，大大提高了靈敏度。2022 年邵穎等建立了血清4 型禽腺病毒POCT 熒光微球免疫層析檢測方法，該方法可以在15 min內檢測出結果，與臨床診斷結果相符，可以用于基層獸醫臨床檢測。2022 年楊艷利用禽白血病病毒P27 蛋白多克隆抗體制備了熒光微球免疫層析檢測技術，為禽白血病的種群凈化和禽白血病的檢測提供了簡便的方法。2023 年王英超等研制了一種快速檢測牛布魯氏菌抗體的熒光快速檢測試紙卡，該方法與熒光偏振方法的符合率為100%，可以適用于臨床樣品的快速檢測。

2.2 量子點免疫層析試紙條檢測技術 量子點與傳統的有機染料相比，具有明顯優勢，已成為一種非常有潛力的熒光探針標記物。2020 年，孔玉方等以量子點熒光微球作為示蹤物，共價偶聯布魯氏菌外膜蛋白OMP22，并將布魯氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22 的單克隆抗體噴涂于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質控線，組裝制備了檢測速度快、靈敏度高、特異性強且成本低的量子點熒光微球免疫層析試紙條，可用于布魯氏菌病的現場篩查。2022 年史伯昌等建立了量子點熒光微球布魯菌病快速診斷方法，對臨床血樣的總敏感性為97%，特異性為90%，可以用于基層布魯氏菌病的凈化檢測。2023 年徐志遠等根據非洲豬瘟病毒VP72 蛋白的氨基酸序列建立了非洲豬瘟病毒熒光量子點檢測試紙條，與商品化的非洲豬瘟熒光定量PCR 檢測試劑盒陽性符合率為82.1%（23/28），陰性符合率為93.8%（75/80），可以用于非洲豬瘟病毒的現場快速診斷。

2.3 上轉換發光免疫層析試紙條檢測技術 2018年洪霞等以上轉換發光材料（UCP）為新型標記物，采用競爭免疫反應建立了快速檢測黃曲霉毒素B1的上轉換發光免疫層析檢測卡方法，并對試紙條性能進行評價。2019 年黃震等制備了上轉換納米材料（Upconversion Nanoparticles,UCNPs）,并將其應用于免疫層析平臺，從而建立了一種檢測牛奶中大腸桿菌O157:H7 方法的上轉換免疫層析方法，該方法靈敏度較高，抗基質干擾能力強，不僅能用于大腸桿菌O157:H7 的檢測，也可被推廣應用于其它食源性致病菌檢測。2022 年張運蓮建立了牛奶中抗生素殘留（卡那霉素、四環素和氨芐青霉素）的上轉換熒光納米傳感檢測方法，為牛奶中抗生素的痕量檢測提供了新思路。

2.4 時間分辨熒光免疫層析試紙條檢測技術 時間分辨熒光免疫層析技術是用稀土元素（Eu、Tb、Sm等）作為標記物，其檢測靈敏度比膠體金試紙條等高出2～3 個數量級。2020 年王華俊等采用單克隆抗體技術和熒光微球免疫層析技術，制備PRV gE 抗原的時間分辨熒光微球免疫層析試紙卡，該試紙卡可在15 min 內定量檢測樣品中PRV gE 抗原，與PRV gE 與gD 二重實時熒光PCR 的總符合率為89.55%，可以用于PRV 抗原的定性檢測，具有良好的臨床應用價值。同年，朱玲等建立了可定量檢測豬血清或乳汁中PEDV IgG 或IgA 抗體的時間分辨熒光免疫層析試紙條，具有靈敏、特異、準確、操作簡便、檢測快速的特點，符合臨床快速檢測的要求，可用于臨床上PEDV IgG 和IgA 的快速檢測。2021 年王華俊等建立了豬流行性腹瀉病毒時間分辨熒光免疫層析檢測方法，最佳檢測時間15 min，可以用于PEDV 的現場檢測。2022 年孔繁霞等研制了基于時間分辨熒光微球的黃曲霉毒素B1 定量檢測卡，具有靈敏度高、重復性好的優點。

3 納米酶免疫層析試紙條檢測技術

納米酶免疫層析試紙條檢測技術是以納米酶為標記物的又一新型檢測方法。該方法有效解決了傳統膠體金免疫層析試紙條檢測技術靈敏度低的問題。2016 年何暉等建立了一種快速篩查志賀氏菌的熒光納米免疫層析方法，具有良好的特異性和靈敏性，適用于現場快速檢測。2020 年劉鍵等研制了納米酶免疫層析試紙條，該試紙條對諾如病毒的最低檢出濃度為10 ng/mL,比普通膠體金試紙條靈敏度高10 倍；與輪狀病毒、腺病毒、幽門螺桿菌均無交叉反應，具有簡便、快速、可現場應用的優點,在諾如病毒快速檢測中具有實際應用價值。

4 液相芯片

液相芯片（Liquid chip，LP）又稱熒光微球免疫學檢測技術（Fluorescent-microbead immunoassay，FMIA），是一種結合熒光微球作為抗原復合物結合抗體的蛋白質檢測方法。該方法可以在同一樣品中對多種分子同時進行定性或定量分析，不僅可以進行高通量檢測，而且大大提高了樣品利用率。2018年曾夢利用原核表達載體pMAL-c5x 對豬偽狂犬病毒gE 和gB 蛋白進行了可溶性表達，以制備的重組蛋白為抗原與微球偶聯，分別建立 gE、gB IgG抗體單一FMIA 檢測方法，并在此基礎上建立了gE、gB 的雙重FMIA 檢測方法，該方法優于同時建立的ELISA 方法，可以用于PRV 野毒感染和疫苗免疫豬IgG 的快速鑒別診斷及檢測。2021 年曹丙蕾等建立了豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎二重液相芯片檢測方法，可用于豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒的鑒別診斷，與熒光RT-PCR 檢測方法的符合率為100%。2022 年王群等建立了牛病毒性腹瀉病毒抗體液相芯片高效檢測方法，靈敏度高于ELISA 方法，為牛病毒性腹瀉病毒的口岸快速檢測提供了一種新的方法。2023 年鄔旭龍等建立了同時檢測7 種豬繁殖障礙性疫病的方法，該方法能夠同時檢測豬偽狂犬病病毒、豬日本乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環病毒2 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒和非洲豬瘟病毒等7 種豬繁殖障礙性疫病，最低檢測限度為103 copies/μL，為豬病多種病原快速鑒別診斷提供了技術儲備。

5 展 望

膠體金免疫層析檢測技術在獸醫快檢領域已經得到了廣泛的應用，對動物疫病的快速診斷和早期診斷發揮了積極的作用。近年來，熒光微球免疫層析技術也已經在獸醫領域進行了不斷的研究和推廣應用?？梢?，以后的免疫層析技術肯定朝著半定量、定量和高通量檢測方向發展。此外，免疫層析檢測技術結合互聯網手段在動物疫病的監測和數據分析方面的發展和應用將為獸醫領域的健康發展保駕護航。