梨樹腐爛病病原菌種群結構分析

唐麗 李春艷 孟紫微 李亞鵬 張王斌

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.018

摘? 要：【目的】分析新疆生產建設兵團第一師阿拉爾市庫爾勒香梨園梨樹腐爛病病原菌的種群分類，通過6對保守基因序列，研究庫爾勒香梨腐爛病病原菌序列之間相關性及差異性。

【方法】在庫爾勒香梨園內采集具有典型癥狀的腐爛病病樣，經科赫氏法則驗證獲取腐爛病病原菌純培養。采用CTAB法提取腐爛病病原菌基因組DNA，通過PCR擴增ITS、β-tubulin、EF-1α、ACT、LSU、RBP2基因并測序，利用分子系統學分析不同基因片段的系統發育關系。

【結果】在阿拉爾周邊混交園內庫爾勒香梨腐爛病菌種為Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali）。種內差異與地理位置有關，國內與國外梨腐爛病分離株差異較明顯。EF-1α、ACT、LSU、RBP2在進化過程中更能夠體現種間差異，系統發育樹分支多，存在種間差異。

【結論】

新疆生產建設兵團第一師阿拉爾市庫爾勒香梨腐爛病病原菌種群分布和種間差異性，庫爾勒香梨園的腐爛病病原菌主要為Valsa mali var.pyri、Valsa sordida。

新疆南疆綠洲特色果園種植模式，以楊樹等為主防護林最為常見，存在著林果樹木腐爛病交叉侵染的可能。

關鍵詞：基因序列；Valsa mali var.pyri；Valsa sordida；分子鑒定

中圖分類號：S436.611.1+1??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0681-09

收稿日期（Received）：

2023-07-10

基金項目：

國家自然科學基金項目（31660034）

作者簡介：

唐麗（1993-），女，四川德陽人，碩士研究生，研究方向為植物病理學，（E-mail）susuzaizai@163.com

通訊作者：

張王斌（1974-），男，陜西澄城人，教授，碩士生導師，研究方向為植物病理學，（E-mail）zwbzky@163.com

0? 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨是新疆阿克蘇地區綠洲農業果樹的主栽樹種之一［1-2］。近年來，新疆阿克蘇地區果園梨樹腐爛病發生嚴重，林果樹木減產，甚至造成死樹或毀園［3-4］。庫爾勒香梨的種植以楊樹、胡楊、沙棗為防護林樹種，不同寄主來源腐爛病菌存在交互侵染現象［5］，因此，研究庫爾勒香梨園梨木對腐爛病種間差異性尤為重要。

【前人研究進展】我國依據形態學特征將梨樹腐爛病的病原菌鑒定為梨黑腐皮殼菌（Valsa ambiens）［6］。郭開發［7］針對新疆楊樹腐爛病、蘋果腐爛病、核桃腐爛病等主要經濟果樹的腐爛病病原菌的ITS、β-tublin進行研究分析鑒定，殼囊孢屬真菌寄主專一性弱，易發生寄主“跳躍”現象［8］。因此，僅靠寄主、形態學特征或單基因系統發育研究進行病原菌鑒定并不可靠，多基因聯合分析可彌補單基因的片面性，對種間差異所得結果更加準確，多對基因在分離株體內的作用是不同的，基因之間的穩定性也不同，同種分離株之間ITS、BT2種基因相對穩定，突變較少?！颈狙芯壳腥朦c】EF-1α、ACT、LSU、RBP2四種基因與ITS、BT分支基本相同，但在樹距上仍然存在種內差異，病原菌的鑒定采用多基因分析［9-11］。真核生物核糖體基因轉錄間隔區ITS［12］（Internal Transcribed Spacer）、β-微管蛋白（β-tublin）、延伸因子1-α（Elongation Factor-1α）、肌動蛋白（Actin）、核糖體大亞基（Ribosomal Large Subunit）、RNA聚合酶第二亞基（the second lar-gest RNA polymerase subunit 2）具有較好的種間變異性和種內穩定性，可以作為用于殼囊孢屬快速分子鑒定和DNA條形碼的候選基因［13-15］。

【擬解決的關鍵問題】采集新疆生產建設兵團第一師阿拉爾市香梨園腐爛病帶病組織，經過科赫氏法則獲取庫爾勒香梨園內腐爛病病原菌進行純培養，通過PCR擴增ITS、LUS核糖體基因和act、rpb2、tef1-a、tub編碼蛋白基因，運用分子系統學分析不同基因片段的系統發育關系，研究種內、不同地理來源梨樹腐爛病的差異性，以及同一果園內不同寄主上的腐爛病浸染其他果樹狀況。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

供試標本：從新疆生產建設兵團第一師阿拉爾市周邊庫爾勒香梨園采集發病枝條、樹皮等采集具有明顯病征的帶病組織，記錄標本編號、寄主種類、采集地點等信息帶回實驗室備用。

表1

1.2? 方 法

1.2.1? 病原菌分離與純化

將標本采用組織分離法［16］從病健交界處切取5×5（mm）的病樣組織，依次用75%酒精浸泡1 min、0.1%升汞浸泡1 min、無菌水沖洗3次后將3～5塊組織塊均勻放置于PDA平板中，置于25℃恒溫培養箱培養。培養2～3 d后，在無菌操作臺下，用接種針在菌落邊緣挑取3～5 mm的菌絲塊純培養。將純化后的菌株回接于寄主的離體枝條上，4 d后進行2次分離純化，每個分離株3次重復，另一份置于PDA斜面4℃冰箱保存。

1.2.2? 菌絲的獲得和收集

PDA培養基25℃培養3 d菌株，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，每一供試菌株取3個菌餅，分別放入裝有150 mL PD培養基的錐形瓶中，置于25℃，180 r/min搖床內進行培養，待菌絲長滿液面取出菌絲，用無菌濾紙干燥處理后，分裝于2 mL離心管中，置于-80℃超低溫中保存。

1.2.3? DNA的提取

提取基因組DNA采用改良CTAB法［17-18］。

（1）將2.0 mL 離心管中冷凍干燥后的腐爛病菌的菌絲體，用滅過菌的研磨棒快速研磨成粉末狀。

（2）向離心管中加入600 μL 的抽提緩沖液（50 m M EDTA，100 m M Tris-HCL（pH 8.0），3% SDS），渦旋混勻。

（3）將離心管放入 65℃的水浴中 1～1.5 h，每隔10 min 輕輕顛倒離心管1次，使得研磨后的粉狀菌絲顆粒和抽提緩沖液充分混勻。

（4）向離心管中加入 650 μL 的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，渦旋混勻。并于 4℃，12 000r/min離心 15 min。

（5）取上清液（450 μL）轉移至另外一個新的 1.5 mL 離心管中，向其中加入等體積的氯仿并混合均勻，于 4℃，12 000 r/min離心 10 min。

（6）吸取上清液（350 μL）轉移至另一新的 1.5 mL 離心管中，向其中加入10 μL 的 3 M Na Ac和 200 μL 的異丙醇，小心的反轉離心管將液體混合均勻，室溫靜置 5 min，即可看到絮狀的 DNA 沉淀從溶液中析出。

（7）離心管于4℃，12 000 r/min 離心5 min，小心的將上清液倒出，并將將離心管倒置于干凈吸水紙上，使管內液體流凈。用500 μL 冷凍保存的 70%乙醇清洗沉淀兩次，無水乙醇沖洗1次，置于室溫條件下干燥。

（8）待無水乙醇揮發干凈后，向離心管中加入 100 μL TE（pH 8.0），4℃放置過夜使DNA 完全溶解。

（9）DNA 完全溶解后，向其中加入 1 μL 10 mg/mL RNase，37℃水浴 2 h，使RNA完全降解。處理完的DNA溶液經質量檢測后（紫外吸光光度計法或瓊脂糖凝膠電泳法），于-20℃保存備用。

1.2.4? PCR的擴增及測序

所提取菌株DNA，由上海生工科技股份有限公司進行PCR擴增及測序。PCR擴增引物序列參考文獻［19］。表2

1.2.5? 不同基因序列比對及系統發育樹構建

將各個菌株的不同基因序列提交至NCBI中Blast程序中與Genbank中已知序列進行比對。在MEGA X中進行進化分析［20］，通過最大似然法和Tamura-Nei模型推斷［21］，獲得對數似然最高（-1 179.51） 數。將Neighbor-Join和BioNJ算法應用于使用Tamura-Nei模型估計的成對距離矩陣，選擇具有優越對數似然值的拓撲，自動獲得啟發式搜索的初始樹。

2? 結果與分析

2.1? 序列比對與系統發育樹的構建

研究表明，田間分離株共22株，分別來自5個不同地理位置果園，以庫爾勒香梨樹為寄主的分離株有13株、楊樹3株、蘋果2株；巴梨、碭山梨、紅棗、核桃各1株。分離株基因與GenBank中基因的同源性為95.45%～100%，同一寄主來源的腐爛病之間存在細微的差異。不同地點的相同基因也存在差異，但是總體差異性較小。表3

2.2? 6種不同基因序列

2.2.1? rDNA-ITS 序列

研究表明，試驗中庫爾勒香梨腐爛病分離株與阿拉爾市周邊地區薔薇科果樹（蘋果）腐爛病分離株聚為一支，沒有明顯差異。與來源我國新疆、陜西梨腐爛病菌株（V.ambiens）同源性最高100%，與來源韓國梨腐爛病分離菌株同根，但分為2支，存在較大種內差異，親緣關系較遠；與來源我國新疆阿拉爾市周邊地區的楊樹、紅棗腐爛病分離株同根但節點較遠，有明顯的屬內差異。圖1

2.2.2? β-tubulin 序列

研究表明，庫爾勒香梨腐爛病分離株與阿拉爾市周邊梨園中薔薇科腐爛病分離株聚為一支（蘋果、巴梨），與V.ambiens同源性為 100%。與來源陜西、北京梨腐爛病菌株同聚為一支，無差異。與病原菌為Valsa sordida 的楊樹、紅棗、核桃腐爛病同根，但親緣關系較遠，分為兩支，種內差異較大。圖2

2.2.3? EF-1α 序列分析

研究表明，庫爾勒香梨腐爛病分離株與阿拉爾市周邊薔薇科腐爛?。ㄌO果、巴梨）聚為一支，從同源性 99.67%可以判斷其為V.ambiens。與來源北京、陜西、新疆的梨腐爛病對比并無明顯差異。與楊樹、紅棗、核桃腐爛病分離株分聚為兩支，且有同根性，但親緣關系較遠，無同源關系。圖3

2.2.4? ACT序列分析

研究表明，阿拉爾市周邊混交園庫爾勒香梨腐爛病分離株與其他薔薇科（蘋果、碭山梨、巴梨）腐爛病分離株聚為一支，與 V.ambiens同源性達到100%。存在種內出現許多分支，但樹距較短，具有同源性但也存在差異。與 楊樹、紅棗腐爛病分離株V.sordida為同根，但是分聚兩支，存在同根性但無同源性。圖4

2.2.5? LSU序列分析

研究表明，阿拉爾市周邊地區梨樹腐爛病分離株聚為兩支，JS-KL-4、JY-KL-3聚為一支，其余的與薔薇科（蘋果）腐爛病分離株聚為一支，但樹距較短，親緣關系較近，置信值為74，存在較大種內差異。與V.ambiens同源性99.16%，與來源新疆梨腐爛病分離株為同一種。與來源寄主楊樹、核桃樹腐爛病同根，但分聚不同支，樹距較長，親緣關系較遠，不具有同源性。圖5

2.2.6? RBP2序列分析

研究表明，阿拉爾市周邊混交園庫爾勒香梨腐爛病分離株與薔薇科（蘋果、巴梨）腐爛病分離株聚為一支，同為V.ambiens，且不同分離株之間仍然存在種內差異，出現了新的節點與不同的樹距。與來源我國北京的梨腐爛病分離株無明顯差異，同源性為98.58%，但與來源美國梨腐爛病分離株差異較大，同根但樹距較遠無同源性。與來源寄主楊樹、紅棗、核桃腐爛病分離株同根，但樹距較遠，親緣關系較遠，沒有同源性。圖6

3? 討 論

3.1? 地理因素影響

我國不同地區梨樹腐爛病分離株種內差異較?。?2-24］，但與來源美國、韓國等國家梨腐爛病分離株存在較大差異，是由于不同地理位置、不同品種、不同氣候等造成的［25］。同時不同菌株之間也存在遺傳分化，且這種分化無地理分布的差異，不同寄主和地理分布的同種腐爛病菌也會出現種內遺傳分化，以及新物種的演化，這種分化使該類病原真菌更適應新的外界條件［26］。

3.2? 混植園交互浸染

郭仲眾［27］、周玉霞［28］等通過室內離體枝條接種發現梨樹、蘋果、核桃、楊樹上的腐爛病存在交互浸染。李春艷等［29］、茍巧［30］等將不同寄主來源腐爛病病菌接種田間蘋果和棗樹枝條發現蘋果、香梨、紅棗、胡楊、楊樹等腐爛病菌存在交互侵染現象。同種殼囊孢屬病原真菌可以侵染多種寄主植物。研究薔薇科寄主植物腐爛病分離株明顯聚集為一支，庫爾勒香梨腐爛病的發生交互浸染與樹木混種有很大關系。庫爾勒香梨腐爛病分離株之間國內差異較小且不明顯，國內外差異明顯。腐爛病菌作為弱寄生病原真菌，多寄主選擇更利于真菌的傳播和侵染。庫爾勒香梨種植模式為典型的綠洲農業，多為混種模式，園內品種繁雜、又以楊樹、胡楊、杜梨為防護林，大大增加了庫爾勒香梨園內腐爛病的傳播幾率。

4? 結 論

寄主為庫爾勒香梨的腐爛病分離株，與薔薇科腐爛?。ùX山梨、巴梨、蘋果）基因同源性高達98%，與寄主為楊樹、紅棗的腐爛病分離株同根，但親緣關系較遠，進化時間較久親緣關系較遠。在阿拉爾市周邊混交園內庫爾勒香梨腐爛病菌種為Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali共同稱謂）。種內差異與地理位置有關，國內與國外梨腐爛病分離株差異較明顯。ITS、β-tubulin在進化過程中最為穩定，系統發育樹分支簡單，種內差異極小。EF-1α、ACT、LSU、RBP2在進化過程中更能夠體現種間差異，系統發育樹分支多，存在種間差異。

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Population structure analysis of pathogen of pear valsa canker

in Aral area of Xinjiang

LI TANG1，LI Chunyan2，MENG Ziwei1，LI Yapeng1，ZHANG Wangbin1

（1.The National Local Joint Engineering Laboratory of High Efficiency and Superior-Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Tress in Southern Xinjiang/ Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps in Comprehensive Agricultural Pest Management in Southern Xinjiang/ Scientific Observing and Experimental Station of Crops Pests in Aral，Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Tarim University，Aral Xinjiang 843300，China; 2.Xinjiang Applied Vocational and Technical College，Kuitun Xinjiang 833200，China）

Abstract：【Objective】 The purpose of this study is to investigate the population classification and difference by 6 pairs of gene sequences of the pathogens from Aral City，Ist Oivision，Xinjiang Production and Constraction Corps.

【Methods】 Typical disease samples were collected for purified pathogens by Koch postulates.The total DNA of pathogens was extracted following a standard cetyl-trimethyl ammonium bromide（CTAB） method，subsequently，the ITS，β-tubulin，EF-1α，ACT，LSU，and RBP2 genes were conducted by PCR amplification and DNA sequencing.

【Results】?? Pathogenic species of korla pear rot in mixed gardens around Alar Valsa mali var.pyri（V.ambiens、Valsa mali ）.Species differences are related ro geographical tocation.There are significant differences in pear rot disease isolates between domestic and foreign and foreign countries.EF-1α、ACT、LSU、RBP2 is more able to reflect interspecific differences， and phylogenetic tree has multiple branches，resulting in interspecific differences.

【Conclusion】? The results showed that Valsa mali var.pyri and Valsa sordida were the main diseases in Korla pear.It was clear that the difference existed between the species and population distribution of canker disease pathogen in Korl pear.The main shelterbelt such as poplar is the most common windbreak in Southern Xinjiang，maybe there is a cross infection of fruit trees and wood trees.

Key words：gene sequence；Valsa mali var.pyri；Valsa sordida；molecular identification

Fund project：National Natural Science Foundation of China（31660034）

Correspondence author：ZHANG Wangbin（1974-），male，from Chengcheng， Shanxi，professor，reaserch filed： plant pathology，（E-mail）zwbzky@163.com