陸地棉TRM基因家族的鑒定及纖維品質相關優異單倍型分析

王凱迪 高晨旭 裴文鋒 楊書賢 張文慶 宋吉坤 馬建江 王莉 于霽雯 陳全家

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.001

摘? 要：【目的】鑒定陸地棉TRM基因家族序列及理化性質，分析與棉纖維品質相關的優異單倍型基因差異。

【方法】利用生物信息學分析陸地棉TRM基因家族進化關系、理化性質和聚類表達；利用基因單倍型效應分析篩選調控纖維品質性狀（纖維長度、比強度、馬克隆值）的候選基因。

【結果】陸地棉TRM基因家族編碼的氨基酸為376～1 093，等電點為4.64～9.56。亞細胞定位預測發現多達60個陸地棉TRM基因家族定位于細胞核中。TRM基因家族含有較多的光響應、激素響應、脅迫響應和生長發育相關的元件。60個TRM基因家族在纖維發育時期優勢表達，調控棉花纖維發育。每個基因的單倍型個數為1～8，并篩選到纖維長度、強度以及馬克隆值相關的優異單倍型TRM基因分別有14、18和15個，其中有11個基因同時具有長度、強度、馬克隆值3種改良纖維品質的優異單倍型。GH_D09G0775的Hap_4單倍型和GH_D03G1434的Hap_3單倍型在增加纖維長度、強度的同時降低了馬克隆值。

【結論】在陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中鑒定出75個TRM基因家族成員分布在24條染色體上，系統進化將其分為Cluster Ⅰ～Ⅲ 3個亞族。

關鍵詞：陸地棉；基因家族；基因表達；纖維品質；單倍型

中圖分類號：S562??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0521-16

收稿日期（Received）：

2023-07-11

基金項目：

河南省農業良種聯合攻關項目（2022010301）；新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2021D01B113）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1610162022013）

作者簡介：

王凱迪（1998-），男，陜西延安人，碩士研究生，研究方向為棉花分子育種，（E-mail）424416709@qq.com

通訊作者：

于霽雯（1978-），女，河南安陽人，研究員，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為棉花分子育種，（E-mail）yujw666@hotmail.com

陳全家（1972-），男，新疆烏魯木齊人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為棉花遺傳育種，（E-mail）chqjia@126.com

0? 引 言

【研究意義】棉纖維是紡織工業的主要原料［1］。棉纖維品質的優劣關系到棉紡織品的質量，因此改良棉纖維品質是棉花育種的主要目標。常見的異源四倍體棉種陸地棉由A和D兩個二倍體亞組組成［2］，其基因組已經公布［3-4］。GRAND（http：//grand.cricaas.com.cn/home）數據庫公布的棉屬表達數據為開展基因家族的全基因組鑒定與生物信息學分析提供了基礎信息［5］?！厩叭搜芯窟M展】TRM（TON1 Recruiting Motif）基因家族對于植物生長發育起著重要作用，其基因家族分析在多種植物中已完成［6］。在擬南芥中鑒定到34個TRM蛋白，所有TRM中擁有6個短保守基序，其中一個是與TON1相互作用的基序。TRM1能夠與微管蛋白結合，并通過與TON1的相互作用將其招募到微管蛋白［7］。TRM5是TRM 基因家族的一個重要成員，AtTRM5對擬南芥的生長發育起著重要作用，AtTRM5突變體具有明顯的發育缺陷表型如葉片生長變慢、花發育遲緩、根變短等［8］。TRM4與擬南芥種子粘液質的分泌相關［9］。TRM7與TRM8突變體損害有絲分裂前期的早前期帶（preprophase band，PPB）的形成，但不影響間期微管［10］。Tang 等［11］的研究將擬南芥中AtTRM6突變后會導致胚胎致死和種子敗育?！颈狙芯壳腥朦c】生物信息學方法在全基因組分析中發揮著重要作用，棉花的多個重要基因家族已經通過生物信息學的全基因組分析取得了相應成果［12-13］。作物種質資源中蘊藏著豐富遺傳優異等位基因，可以鑒別與表型性狀相關的候選基因核苷酸變異，還可以評估新的單倍型等［14］。TRM基因在植物的生長發育中起著重要作用，而陸地棉TRM基因家族鑒定及纖維品質相關優異單倍型分析仍未見報道。需研究鑒定陸地棉TRM基因家族的序列及分析纖維品質相關優異單倍型?！緮M解決的關鍵問題】采集已公布的陸地棉基因組數據，系統分析棉花TRM基因家族成員的進化關系、基因結構變異﹑共線性關系和基因表達模式以及單體型，為研究TRM基因在陸地棉中的相關功能提供數據支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

陸地棉TRM基因家族下載陸地棉（http：//www.cottonfgd.org/）［15］的基因組序列與注釋數據。根據擬南芥TRM家族蛋白序列，依據BLASTP［16］（E值設為1e-5）及TRM家族的隱馬爾科夫模型文件PF14383、PF14309，HMMER程序［17］陸地棉TRM基因家族同源蛋白序列進行比對。通過在線工具NCBICD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和Search Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）進行驗證，過濾掉保守結構域不完整的序列，得到TRM家族成員序列。借助TBtools［18］（Protein Paramter Calc）計算棉花TRM家族成員的分子量和等電點。利用亞細胞定位工具 WoLF PSORT（https：/l/wolfpsort.hgc.jp/）預測陸地棉TRM基因家族的亞細胞定位。

1.2? 方 法

1.2.1? 陸地棉TRM基因家族的進化與基因結構與保守結構域

利用MEGA11［19］內置的Clustal W［20］對陸地棉TRM蛋白序列進行比對，采用鄰接法（Neibour-joining method），Bootstrap重復1 000次構建進化樹。利用TBtools［18］分析陸地棉TRM基因家族成員的基因結構。利用在線工具 MEME（http：//meme-suite.org/）分析TRM蛋白序列的保守結構域，最大基序設置為10，其他參數為默認值，同時利用NCBI Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析TRM蛋白序列的保守結構域，用TBtools［18］進行可視化。

1.2.2? 陸地棉TRM基因家族的染色體定位與順式作用元件

利用TBtools陸地棉TRM基因家族成員在染色體上的位置圖。TBtools［18］從基因組序列中提取TRM基因家族上游2 000 bp作為啟動子序列，運用在線工具 PlantCARE［21］分析啟動子順式作用元件。

1.2.3? 陸地棉TRM基因家族成員的共線性

利用TBtools［18］軟件分析TRM家族在陸地棉中成員的共線性關系，最小模塊設置為5個基因。

1.2.4? 陸地棉TRM基因家族的表達

從三代轉錄組數據中得到TRM基因家族在不同組織中的轉錄數據［22］，使用TBtools［18］軟件將數據制作熱圖進行可視化。

1.2.5? 陸地棉TRM基因家族成員單倍型

使用cottonMD（http：//yanglab.hzau.edu.cn/cott/PublicFun/total_jump target=vir/search&gene）所提供的基因型和表型數據［23］，以及基因內snp和Indel作為分型依據，進行基因分型，結合群體纖維品質表型數據，對各單倍型的效應進行分析。

2? 結果與分析

2.1? 陸地棉TRM基因家族數量及其理化性質

研究表明，陸地棉TRM基因家族 CDS 長度在1 131（GH_A08G1551.1與GH_D08G1569.1）～3 282（GH_A07G0755.1）bp，氨基酸數在376～1 093，分子量在42.82（GH_D08G1569.1）～120.99（GH_A07G0755.1）kD，理論等電點為4.64～9.56，其中40個基因編碼蛋白呈酸性，其余為堿性。有2個蛋白定位在細胞質中，分別為GH_A01G2363.1、GH_D01G2442.1，2個蛋白定位在液泡中，分別為GH_A09G1944.1、GH_D09G1898.1，8個蛋白定位在葉綠體中，分別為GH_A08G2091.1、GH_A09G2222.1、GH_A11G1709.1、GH_A11G3723.1、GH_D08G2107.1、GH_D10G2421.1、GH_D11G1747.1、GH_D11G3750.1，3個蛋白定位在線粒體中，分別為GH_A12G2487.1、GH_D02G0253.1、GH_D12G2500.1，其60個蛋白全部定位在細胞核內。表1

2.2? 陸地棉TRM基因家族的進化與結構

研究表明，擬南芥中34個TRM基因家族與陸地棉中的75個TRM基因家族能聚類為3個亞組。其中Cluster Ш中成員最多，TRM基因家族數量最多，包含52個（36個陸地棉TRM基因和16個擬南芥TRM基因），家族成員占總數的48%。圖1

TRM基因家族的外顯子個數在2～7個，并

從中共鑒定出10個保守基序依次命名為Motif 1 ～ Motif 10。所有TRM基因家族成員均含有相同的保守基序Motif 4，另外有47個具有N端的Motif 5 ，其余28個缺失 N端的Motif 5。保守結構域除了GH_D12G2464.1、GH_A12G2452.1、GH_D01G1490.1以外，其余都含有DUF4378結構域。圖2，圖3

2.3? 陸地棉TRM基因家族的啟動子順式作用元件

研究表明，TRM基因家族含有較多的光響應相關元件、激素反應相關元件、脅迫響應相關元件和生長發育相關元件。其中光反應元件的數量較多且種類豐富。在激素響應元件中，生長素響應元件含量較多。圖4

2.4? 陸地棉TRM基因家族的染色體分布與共線性

研究表明，陸地棉TRM基因家族在染色體上的分布比較廣泛，且數量有較大差異。其中A08、A09、A11、D07、D08、D09和D11共7條染色體均有多達5個基因，在A07染色體分布有4個基因，在A01、A12、D01、D02、D12 5條染色體分布有3個基因，在A02、A03、A05、A10、D03、D04、D05、D10 8條染色體上分布有2個基因，在A04、A13、D13三條染色體上分布有1個基因。圖5

160個共線性基因對其中A亞族有29對，D亞族有30對，AD亞族有101對，陸地棉TRM基因家族為種間協同進化。圖6

2.5? 陸地棉TRM基因家族的表達

研究表明，75個陸地棉TRM基因家族成員分為3個亞家族，其中第Ⅰ亞家族共有17個成員，普遍在纖維中優勢表達，第Ⅱ亞家族有35個成員，普遍在0 d的胚珠與早期纖維中優勢表達。第Ⅲ共有共23個成員，在植物的各個組織中都有表達。圖7

2.6? 陸地棉TRM基因家族的單倍型

研究表明，全部陸地棉TRM基因家族成員在1 245陸地棉材料中基因的單倍型個數在1～8個。其中在46個基因中鑒定出與棉花纖維的長度、強度、馬克隆值相關的優異單倍型。表2

與纖維長度相關單倍型的基因有41個，其中有14個基因攜帶顯著增長纖維長度的優異單倍型。與纖維強度相關單倍型的基因有38個，其中18個基因攜帶顯著增強纖維強度的優異單倍型。與馬克隆值相關單倍型的基因有35個，其中15個基因攜帶顯著降低馬克隆值的優異單倍型。由于其中一些優異單倍型存在一因多效，29個基因同時擁有與纖維長度、強度、馬克隆值均具有顯著差異的單倍型，其中11個基因的攜帶一因多效的優異單倍型。其中GH_D09G0775的Hap_4單倍型顯著增長纖維長度，增強纖維強度，顯著降馬克隆值；GH_D03G1434的Hap_3單倍型同樣顯著增長纖維長度，增強纖維強度，顯著降低馬克隆值。圖8

3? 討 論

有報道顯示TRM1能夠與微管蛋白結合，并通過與TON1的相互作用將其招募到微管蛋白［7］。AtTRM5對擬南芥的生長發育起著重要作用，AtTRM5突變體具有明顯的發育缺陷表型如葉片生長變慢、花發育遲緩、根變短等［8］。AtTRM4參與纖維素的合成從而調控擬南芥種子粘液質的沉積［9］。

基因組質量的完整性是全基因組水平分析基因家族的基礎。隨著基因組測序技術的不斷深入，棉花基因組從二倍體棉到四倍體陸地棉不斷更新［24，25，26］。研究通過生物信息學方法，以擬南芥中的34個TRM家族蛋白為參考從陸地棉全基因組中鑒定出75個TRM基因家族成員，依據進化可以將其與75個陸地棉TRM基因家族成員分為3個亞族，所編碼的氨基酸數量在376～1 093，都含有相同的保守結構域MOTIF4（是TON1的互作元件）。陸地棉TRM基因家族成員在除了A06與D06兩條染色體以外的24條染色體上均有分布，共線性分析結果發現其家族為種間協同進化。Ma等在群體中定位到的mqFL-lg15-3區間中出現TRM基因家族［27］，TRM基因家族成員普遍在纖維發育時期優勢表達，其可能與纖維發育相關。

4? 結 論

陸地棉TRM基因家族具有豐富的序列及理化性質變異，該基因家族在棉花中可能參與不同發育過程。陸地棉TRM家族成員可能與棉花纖維發育相關。共有50個陸地棉TRM基因在纖維中較高表達，陸地棉TRM基因潛在調控棉花纖維發育。

46個基因的不同單倍型在纖維品質性狀有表型差異，均在纖維中優勢表達，同時存在一因多效，與纖維長度相關擁有優異單倍型的基因是14個；與纖維強度相關擁有優異單倍型的基因是18個；與纖維馬克隆值相關擁有優異單倍型的基因是15個。同時擁有與纖維長度、強度、馬克隆值相關優異單倍型的基因是11個。

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Identification of TRM gene family and fiber quality related excellent haplotype analysis in Gossypium hirsutum L.

WANG Kaidi1，GAO Chenxu2，PEI Wenfeng1，2，YANG Shuxian2，ZHANG Wenqing2，SONG Jikun1，2，MA Jianjiang2，WANG Li2，YU Jiwen1，2，CHEN Quanjia1

（1.Cotton Engineering Research Center，Ministry of Education / College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Anyang Henan 455000，China）

Abstract：【Objective】 Identification of TRM gene family and fiber quality related excellent haplotype analysis in Gossypium hirsutum L.

【Methods】 Bioinformatics was used to analyze the evolutionary relationship，physicochemical properties and cluster expression of TRM gene families.Candidate genes regulating fiber quality traits（fiber length，strength，and Macron value） were screened by gene haplotype analysis.

【Results】 The analysis of physicochemical properties showed that the amino acids encoded by this family gene ranged from 376-1，093，with isoelectric points ranging from 4.64-9.56.Subcellular localization predicted that up to 60 TRM family genes were localized in the nucleus.The results of cis-acting element analysis showed that TRM gene family contained more elements related to light response，hormone response，stress response and growth and development.Transcriptome data showed that 60 TRM family genes were expressed preferentially during fiber development，which might regulate cotton fiber development.Furthermore，1，245 upland cotton materials were used to genotype TRM，and the number of haplotypes of each gene was found to be 1-8，and 14，18 and 15 excellent haplotype TRM genes related to fiber length，strength and Macron value were screened，respectively.Among them，11 genes had excellent haplotypes of length，strength and micronotype.The Hap_4 haplotype of GH_D09G0775 and the Hap_3 haplotype of GH_D03G1434 increased fiber length and strength while decreasing the Macron value.

【Conclusion】 In this study，75 TRM family members were identified on 24 chromosomes in upland cotton（Gossypium hirsutum L.），which were systematically divided into cluster evolution Ⅰ-Ⅲ3 subtribe.

Key words：Gossypium hirsutum L.; gene family; gene expression; fiber quality; haploidgenotype

Fund projects：Henan Province Agricultural Improved Seed Joint Research Project（2022010301）; Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region（2021D01B113）; Basic Research Funds for Public Welfare Research Institutes of the Central Government（1610162022013）

Correspondence author：YU Jiwen（1978-），female，Anyang，from Henan，researcher，doctors，research direction： cotton molecular breeding，（E-mail） yujw666@hotmail.com

CHEN Quanjia（1972-），male，from Urumqi， Xinjiang，professor，doctors，research direction： cotton genetic breeding，（E-mail）chqjia@126.com