紫花苜蓿炭疽病病原新記錄種(Colletotrichum liriopes)的鑒定及生物學特性分析

柳豐 祖麗皮耶·安外爾 李克梅 托倫巴特·畢亞洪

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.019

摘? 要：【目的】從炭疽病癥狀的紫花苜蓿病株分離得到一種炭疽菌，與此前報道的三葉草炭疽菌（Colletotrichum trifolii）、北美炭疽菌（C.americae-borealis）形態上略有差異，研究該菌致病性、分類地位及其生物學特性并鑒定。

【方法】采用組織分離法獲得炭疽菌菌株，經柯赫氏法則證明其致病性，并運用形態學觀察結合多基因片段PCR擴增法鑒定病原菌種類，測定不同培養基、碳源、氮源、溫度、pH值、光照對該菌菌落生長的影響。

【結果】從紫花苜蓿炭疽病病部分離獲得一種新的致病炭疽菌，為麥冬炭疽菌（Colletotrichum liriopes）。該菌在5～35℃，pH值4～11的多數供試培養基、氮源、碳源條件下均能生長。

【結論】麥冬炭疽菌（C.liriopes）可侵染紫花苜蓿引起炭疽病，其菌落最適生長溫度為28℃，最佳氮源、碳源分別是酵母和可溶性淀粉，最適pH為7，菌絲致死溫度61℃，12 h光暗交替對菌落生長有利。

關鍵詞：苜蓿炭疽??；麥冬炭疽菌；鑒定；生物學特性

中圖分類號：S435.5??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0690-09

收稿日期（Received）：

2023-08-03

基金項目：

國家重點研發計劃項目（2022YFD1401101）

作者簡介：

柳豐（1998-），女，新疆人，碩士研究生，研究方向為植物病理學，（E-mail）1968484375@qq.com

通訊作者：

李克梅（1972-），女，江蘇人，教授，博士，碩士生導師，研究方向為植物病理學，（E-mail）likemei@xjau.edu.cn

0? 引 言

【研究意義】紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，營養價值高，適口性好，產量高［1］。苜蓿還具有固氮［2］、改良土壤、防風固沙、恢復植被的能力［3］，在我國主要牧區廣泛種植，近年種植面積已達到3.77×106 hm2［4］。隨著苜蓿種植面積不斷增加，病害問題日漸突出［5］。苜蓿炭疽病是危害紫花苜蓿的主要病害之一，在世界各苜蓿主要種植區普遍發生［6］，我國主要苜蓿種植區也有發生。苜蓿炭疽病最早在新疆阿勒泰地區發生，之后在塔城地區、昌吉州、阿克蘇地區、喀什地區等主要種植區均有發現。在昌吉州呼圖壁縣種牛場，苜蓿炭疽病的發病率由2016年的7.5%增加到2020年的76%［7］，發病苜蓿枝條枯萎，植株稀疏，減產15%～20%。對新獲得的一種炭疽菌的致病性、分類地位和生物學特性開展研究，了解其菌絲生長所需營養物質和適宜的環境條件，對新疆苜蓿炭疽病的防治有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】苜蓿炭疽病在多個研究文獻中均有報道［8，9］。Maloy［10］研究發現苜蓿種子攜帶炭疽菌可能會導致苜蓿嫩枝壞死或萎蔫。Barnes［11］報道苜蓿炭疽病使北卡羅萊納州和馬里蘭州的感病苜蓿品種干草產量，且周期性復發，降低了苜蓿的產量和品質，造成嚴重經濟損失。目前已知引起苜蓿炭疽病的病原有三葉草炭疽菌（C.trifolii）、毀滅炭疽菌（C.destructivum）、平頭炭疽菌（C.truncatum）、球狀炭疽菌（C.coccodes）、束狀炭疽菌（C.dematium）、亞麻炭疽菌（C.linicola）、禾生炭疽菌（C.graminicola）、盤長孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、菜豆炭疽菌（C.incanum）、菠菜炭疽菌（C.spinaciae）和北美炭疽菌（C.americae-borealis）11種［7，12］。苜蓿炭疽病在我國甘肅酒泉、寧夏銀川、內蒙古赤峰、內蒙古圖牧吉、四川新都、云南小哨、吉林白城、河北廊坊、河北張家口、黑龍江齊齊哈爾等地均有發生，有的發病率最高可達70%［8，9］。王雪薇［13］研究報道了三葉草炭疽菌引起的苜蓿炭疽病在新疆阿勒泰地區發生。李克梅、胡文靜［13，14］報道了北美炭疽菌在新疆引起苜蓿炭疽病?！颈狙芯壳腥朦c】新疆是我國苜蓿主要種植區［15］，苜蓿炭疽病是危害苜蓿的主要病害之一。胡文靜［7］對引起新疆苜蓿炭疽病的三葉草炭疽菌（C.trifolii）、北美炭疽菌（C.americae-borealis）做了生物學特性、藥劑篩選研究，并開展了40個苜蓿品種對三葉草炭疽菌的抗性評價。但關于苜蓿炭疽病新的病原菌的分類地位、病原菌生物學特性缺少明確描述。因此需研究該菌致病性、分類地位及其生物學特性并鑒定?！緮M解決的關鍵問題】采用組織分離法分離病原菌，結合形態學和分子生物學確定病菌分類地位，并研究其生物學特性，為新疆苜蓿炭疽病的發生與防治提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

1.1.1? 供試菌株

供試菌株由新疆農業大學牧草病害課題組從紫花苜蓿炭疽病病株上分離獲得并保存。

1.1.2? 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、察氏培養基（Czapek）、燕麥片瓊脂培養基（OMA）、淀粉瓊脂培養基（SA）、葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（GPA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）、玉米粉瓊脂培養基（CMA）、平板計數培養基（PCA）、酵母浸膏瓊脂培養基（YEA）、麥芽糖瓊脂培養基（MA）。

1.1.3? 儀器及試劑

供試儀器：超凈工作臺；高壓滅菌鍋；恒溫培養箱；電子顯微鏡；電子天平；冰箱；高速冷凍離心機；PCR擴增儀；電泳儀；凝膠成像儀；水浴鍋等。

供試試劑：2×Taq PCR Mater Mix，2k bp DNA Marker，10×PCR Buffer（Mg2+），均來自上海生工生物技術有限公司。

1.2? 方 法

1.2.1? 病原菌的分離純化

采用組織分離［16］進行病原菌的分離。選取苜蓿炭疽病典型癥狀的植株材料用剪刀將苜蓿病健交接處剪成5 mm的小塊，用2%次氯酸鈉進行表面消毒1 min，再用無菌水沖洗3次，置于滅菌濾紙上，吸去多余的水分后，均勻擺放在直徑7.5 cm的PDA平板上。每個培養皿內放5個組織塊，用封口膜密封放置于25℃恒溫培養箱黑暗培養，24 h后挑取菌絲接種在PDA平板上，25℃培養7 d，經單胞分離獲得純培養，后續使用甘油法［17］進行菌種保存。

1.2.2? 病原菌的致病性測定

使用菌絲塊接種法［18］，選取健康苜蓿葉片，用2%次氯酸鈉進行葉片表面消毒，于葉片正面用無菌接種針形成傷口，在培養基上打取5 mm菌塊，菌絲朝下接種于葉片傷口處，以同樣大小的無菌PDA塊為對照，25℃培養箱培養，重復處理3次，每天觀察葉片發病情況。待葉片發病后重新分離病原菌，于顯微鏡下觀察其是否與接種病原菌一致。

1.2.3? 病原菌鑒定

1.2.3.1? 形態學

將病原菌接種到PDA平板中央，25℃培養箱培養7 d，觀察其菌落、分生孢子等形態，對病原菌進行初步鑒定。

1.2.3.2? 分子生物學

使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（生工，B518229）提取目的菌株的DNA，對核糖體內轉錄間隔區ITS（ITS1/ITS4）、肌動蛋白ACT（ACT-512F/ACT-783R）、幾丁質合成酶CHS（CHS-79F/CHS-354R）、β-微管蛋白TUB2（T1/Bt-2b）、組蛋白HIS3（CYLH3F/CYLH3R），5種基因片段進行PCR擴增，并根據各基因對應的PCR反應體系（CHS-1基因序列引物采用20 μL反應體系：1 μLDNA模板液，10 μL2×Tag PCR MaeterMix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，8 μL ddH2O；其余幾種為25 μL反應體系：1 μLDNA模板液，12.5 μL2×Tag PCR MaeterMix，1 μL上游引物，1 μL下游引物，9.5 μL ddH2O），以等量ddH2O為模板設置陰性對照，后用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，檢測合格后，送至上海生工生物工程有限公司測序。測序結果與GenBank中已發表的序列進行同源性分析比對，下載同源性高于98%的序列，后采用鄰接建樹法構建系統發育樹。苜蓿疽病菌的ITS、ACT、CHS-1、TUB2和HIS3序列提交至NCBI，獲取 GenBank 登錄號。

1.2.4? 病原菌生物學特性

菌絲最適氮源、碳源、培養基的篩選：置于以Czapek培養基為基礎培養基制成的不同氮源培養基平板上，配制方法為將其中的硝酸鈉等質量替換為蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、L-谷氨酰胺、硝酸鉀、酵母浸粉7種不同氮源；置于以Czapek培養基為基礎培養基制成的不同碳源培養基平板上，配制方法為將其中的蔗糖等質量替換為葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、木糖、乳糖、甘油、菊糖、甘露醇、10種不同碳源；置于PDA、OMA、SA、GPA、PSA、Czapek、CMA、PCA、MA、YEA培養基；

菌絲最適生長溫度、光照、pH的測定：置于溫度分別為5、10、15、20、25、28、30和35℃的不同溫度梯度的恒溫培養箱中進行培養；置于24 h連續光照、24 h連續黑暗、12 h光黑交替的三種光照處理的25℃恒溫培養箱中培養；用1 mol/L HCL和1 mol/ NaOH的溶液將PDA培養基的pH分別調試為4、5、6、7、8、9、10、11的8中不同pH的培養基平板中培養；

菌絲致死溫度的測定：將培養7 d直徑為5 mm的菌餅放到裝有1 mL無菌水的1.5 mL離心管中，將其分別置于40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65℃的金屬浴孵化器中加熱10 min，晾干后分別接種于PDA培養基平板上。

用滅菌的打孔器（5 mm）取菌餅，分別于上述條件下培養7 d，每個處理重復3次，十字交叉法測量菌落直徑。

1.3? 數據處理

使用Mega 7進行系統發育樹的構建；SPSS 2.0軟件進行數據統計分析，Prism 8.0.2軟件作圖。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌的分離純化及致病性測定

研究表明，苜蓿炭疽病主要危害苜蓿的葉片、莖稈及根部，莖稈被害后呈淡褐色凹陷病斑，菱形至長條狀，嚴重時繞莖一周；葉片受害后變薄褪綠，病斑呈針尖狀至圓形或橢圓形，呈黃褐色或赤褐色；病害發生嚴重時整株枯死。從采集的炭疽病害樣品葉片中分離純化共得到一種炭疽菌菌株，此前分離得到的三葉草炭疽菌（Colletotrichum trifolii）、北美炭疽菌（C.americae borealis）形態上略有差異。選取2個代表菌株C1-1、C1-2進行后續試驗。

將病原菌接種至健康的苜蓿葉片上，5 d后葉片褪綠并出現病斑，與田間發病癥狀相似，對照部位未見感病癥狀。從病斑處重新分離得到的菌株與接種病菌一致，該菌可侵染苜蓿引致苜蓿炭疽病。圖1

2.2? 病原菌的形態特征

研究表明，該菌于25℃恒溫條件下在PDA培養基平板上培養7 d，菌落凈生長直徑可達49.68 mm；菌落近圓形，邊緣不整齊，菌絲致密絨毛狀，白色至灰青色，菌落背面呈褐色，長時間培養菌落顏色加深；大量孢子在平板上呈橘黃色，分生孢子無色、單孢、新月形，光滑、兩頭鈍尖，中間膨大，有一個小油球，大小15.30～17.80 × 4.30～6.10 μm；剛毛褐色有隔，大小為27.10～31.40 μm。菌落形態與孢子形態均與模式種C.liriopes（CBS 119444）的形態相似，將其初步鑒定為麥冬炭疽菌。圖2

2.3? 病原菌分子生物學鑒定

研究表明，提取代表菌株Cl-1、Cl-2的DNA作為模板，采用PCR技術分別擴增其核糖體核苷酸（ITS）、肌動蛋白（ACT）、幾丁質合成酶（CHS-1）、組蛋白（HIS3）、β-微管蛋白（TUB2）基因片段，擴增得到的PCR產物經凝膠電泳檢測后分別得到大小約為550、260、270、470和400 bp的條帶；將特異性條帶回收測序，在GenBank數據庫中對各基因序列分別進行比對，2個供試菌株均與C.liriopes聚在同一分支，相似性達99%以上。將其進一步鑒定為C.liriopes。菌株C1-1、C1-2的ITS基因登錄號分別為OQ678010、OQ678011，ACT基因登錄號分別為OQ659467、OQ659468，CHS-1基因登錄號分別為OQ659469、OQ659470，HIS3基因登錄號分別為OQ659471、OQ6594772，TUB2基因登錄號分別為OQ659473、OQ6594774。圖3、圖4

2.4? 病原菌生物學特性測定

2.4.1? 菌絲最適培養基篩選

研究表明，麥冬炭疽菌（C.liriopes）在供試的10種培養基上均能生長，在25℃恒溫條件下培養7 d，菌株在PCA培養基上菌絲生長最快，菌落平均凈生長直徑可達54.55 mm，其后依次為MA、SA、PDA、OMA、YEA，與其他培養基存在顯著性差異（P<0.05）。PDA為麥冬炭疽菌（C.liriopes）菌絲生長最適培養基。圖5

2.4.2? 菌絲最適生長氮源篩選

研究表明，麥冬炭疽菌（C.liriopes）在供試的7種不同氮源培養基上均能生長。在25℃恒溫條件下培養7 d，當以蛋白胨、酵母為氮源時菌絲生長最快，菌落平均凈生長直徑分別可達58.21、59.20 mm，與其他不同含氮培養基存在顯著性差異（P<0.05）。酵母為麥冬炭疽菌（C.liriopes）最適氮源，有利于菌絲生長。圖6

2.4.3? 菌絲最適生長碳源篩選

研究表明，菌麥冬炭疽菌（C.liriopes）在供試的10種不同碳源培養基上均能生長；在25℃恒溫條件下培養7 d，菌株在含可溶性淀粉的培養基中菌絲生長最快，菌落平均凈生長直徑可達57.33 mm，在碳源分別為菊糖、麥芽糖、甘油、蔗糖時菌絲生長也較快，與其他處理存在顯著性差異（P<0.05）?？扇苄缘矸凼亲钸m宜菌麥冬炭疽菌（C.liriopes）菌絲生長的碳源。圖7

2.4.4? 菌絲最適生長溫度的測定

研究表明，菌麥冬炭疽菌（C.liriopes）在5～35℃溫度范圍內菌絲均能生長，但溫度較低時（5、10℃）菌絲生長緩慢，溫度過高（35℃）會降低菌絲生長速率。28℃時菌絲生長最快，菌落平均凈生長直徑可達56.90 mm，20、25和30℃菌絲生長也較好，菌落平均凈生長直徑分別為48.98、49.97和48.12 mm，與其他溫度處理存在顯著性差異（P<0.05）。28℃為該菌菌絲最佳生長溫度。圖8

2.4.5? 菌絲最適生長pH的測定

研究表明，菌麥冬炭疽菌（C.liriopes）在pH為4～11的培養基上均能生長，其酸堿適應性范圍較廣。當pH為7時最適合菌株生長，菌落平均凈生長直徑可達58.30 mm，與其他pH條件存在顯著性差異（P＜0.05）。該菌在中性環境下生長更適宜。圖9

2.4.6? 菌絲最適生長光照條件的測定

研究表明，在25℃恒溫培養7 d條件下，菌株在不同光照條件下均能生長，連續光照、12 h光暗交替及連續黑暗，菌落凈生長直徑分別為51.87、54.58和50.05 mm，與連續黑暗處理存在顯著性差異（P＜0.05），12 h光暗交替有利于菌株生長。圖10

2.4.7? 菌絲致死溫度的測定

研究表明，25℃恒溫培養7 d，菌株經40～60℃水浴10 min后，菌絲仍可正常生長；該菌經61℃水浴10 min后不再生長，與其他溫度處理差異顯著（P<0.05），故61℃為供試菌株致死溫度。圖11

3? 討 論

3.1

從苜蓿上分離獲得一種致病炭疽菌，采用形態學結合分子生物學的方法，將其鑒定為麥冬炭疽菌（C.liriopes），證實麥冬炭疽菌侵染苜蓿引起葉斑，為麥冬炭疽菌（C.liriopes）在國內新記錄寄主。Damm等［19］發現麥冬炭疽菌（C.liriopes）是墨西哥麥冬屬風信子的病原菌，將其記錄為新種；Yang等［20］在中國西南地區報道了麥冬炭疽菌（C.liriopes）是蘭花根莖上的內生真菌；Tao等［21］發現麥冬炭疽菌（C.liriopes）是中國白芨蘭上的內生菌。李娟［22］發現C.liriopes能引起多種植物炭疽病，無寄主專一性且在部分寄主植物上是首次發現。C.liriopes屬于白蠟樹炭疽復合種（C.spaethianum complex）下的一個種，該菌株分生孢子大小和形態與張申萍［23］報道一致，但菌落形態有所不同，可能與菌種保存多次繼代培養有關。

3.2

麥冬炭疽菌（C.liriopes）在溫度為5～35℃均可生長，28℃菌絲生長最快，與婁喜艷等［24］對引起月季炭疽病的膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）的以及胡文靜［7］對引起苜蓿炭疽病的北美炭疽菌（C.americae-borealis）研究結果一致，但與黃蔚等［25］對西瓜炭疽病以及胡文靜［7］對引起苜蓿炭疽病的三葉草炭疽菌（C.trifolii）的研究結果不同，其菌絲最適生長溫度均為25℃，可能是病原菌對不同寄主、不同地域溫度要求不同。該菌在pH為4～11時均可生長，菌絲最適生長pH為7，其生長對酸堿度要求不高，在中性環境下生長較適宜，與張寶清等［26］報道的引起四季秋海棠炭疽病的平頭炭疽菌（C.truncatum）的研究結果一致，但與余賢美等［27］報道引起柿樹炭疽病的哈銳炭疽菌（C.horii）生長最適pH為5不同，也有別于胡文靜［7］報道引起苜蓿炭疽病的北美炭疽菌（C.americae-borealis）、三葉草炭疽菌（C.trifolii）的生長最適pH均為6。上述結果表明不同炭疽菌生長所需酸堿環境不同。該菌在多數常見培養基均能生長，在PCA培養基上生長最佳，且光照對其生長影響不大，菌絲致死溫度為61℃。該菌能利用所有供試碳氮源，不同處理間差異顯著。其中最適氮源為酵母，最適碳源為可溶性淀粉，最適碳源與施玉萍等［28］對橡膠樹炭疽病菌的研究結果一致。對麥冬炭疽菌引起苜蓿炭疽病的發病率、病害嚴重程度還需要進一步開展深入調查；對該菌生物學特性研究也僅限于環境對菌絲生長特性的影響，對病菌產孢性能及致病力的影響還需要進一步研究。

4? 結 論

麥冬炭疽菌（C.liriopes）可侵染紫花苜蓿引起炭疽病，該菌菌落最適生長溫度為28℃，最佳氮源、碳源分別是酵母和可溶性淀粉，最適pH為7，菌絲致死溫度61℃，12 h光暗交替對菌落生長有利。

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Identification of new pathogens of alfalfa anthracnose（Colletotrichum liriopes） and preliminary study on biological characteristics

LIU Feng1，Zulipiye Anwaier1，LI Kemei1，Tuolunbate Biyahong2

（1. College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University/Key Laboratory of Prevention and Control of Invasive Organisms in Agriculture and Forestry in Northwest Desert Oases，Ministry of Agriculture and Rural Affairs（co-constructed by Ministry and Province）/Key Laboratory of Monitoring and Safety Prevention and Control of Agricultural and Forestry Pests，Urumqi 830052，China；2.Agriculture （animal husbandry） development center，Ergong town，Tacheng，Tacheng Xinjiang 834300，China）

Abstract：【Objective】 This project aims to isolate an anthrax strain from alfalfa with the symptoms of anthracnose，which would be slightly different from the previously reported Colletotrichum trifolii and C.americae borealis in morphology in order to clarify the pathogenicity，taxonomic status and biological characteristics of this strain through a series of studies.

【Methods】 Anthrax strain was obtained by tissue isolation，and its pathogenicity was proved by Koch's rule and morphological observation combined with PCR amplification of polygene fragments was used to identify the pathogenic bacteria.Meanwhile，the effects of different culture media，carbon source，nitrogen source，temperature，pH value and light on the colony growth of anthrax strain were determined.

【Results】? A new pathogenic anthrax strain was isolated from alfalfa，and identified as Colletotrichum liriopes.The strain could grow under the conditions of 5-35℃ and pH 4-11，and most of the test medium，nitrogen source and carbon source conditions.

【Conclusion】 C.liriopes can infect alfalfa and cause anthracnose.The optimum growth temperature of C.liriopes is 28℃，the optimum nitrogen source and carbon source are yeast and soluble starch respectively，the optimum pH is 7，the lethal temperature of mycelium is 61℃，and the alternation of light and dark for 12 h is favorable to the growth of the colony.

Key words：alfalfa anthracnose; C.liriopes; identification; biological characteristics

Fund project：Nationaal Key R&D Program of China（2022YDF1401101）

Correspondence author： LI Kemei（1972-）， female，from Jiangsu，professor，research direction is plant pathology，（E-mail）likemei@xjau.edu.cn