基于色譜指紋圖譜技術的小粒種咖啡質量控制方法

單治國　馬劍　滿紅平　劉麗　張春花

小粒種咖啡是指咖啡豆粒徑較小、產量較低的咖啡品種，主要分布于非洲、亞洲、南美洲等地區。由于生長環境、種植條件、加工工藝等方面的差異，小粒種咖啡的品質也存在著較大的差異，因此，建立一種全面、客觀、有效的咖啡品質控制方法，對于保障小粒種咖啡的品質和消費者利益具有重要意義。

色譜指紋圖譜技術是一種以色譜為基礎，結合指紋圖譜的理念，對復雜樣品進行全面、準確分析的方法，具有高分辨率、高靈敏度、高重復性等優點，被廣泛應用于食品、藥品等領域的質量控制中。近年來，有研究者將化學指紋圖譜技術應用于咖啡品質控制中，通過比較不同咖啡樣品的色譜圖，可以對咖啡中的化學成分進行分析和比較。本文旨在探討基于色譜指紋圖譜技術的小粒種咖啡質量控制方法，以期為提高小粒種咖啡品質提供理論依據和實踐指導。

一、儀器與試劑

1.主要儀器。高效液相色譜儀，型號為Agilent100；色譜柱，型號為ODS，規格為5μm；1/1萬電子分析天平，型號為BP135S；1/10萬電子分析天平，型號為BP33S；數控超聲波清洗器，型號為KG-250OE；電熱恒溫水浴鍋，型號為XNCF-3000。

2.試劑和樣品。試劑：甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、磷酸二氫鈉，甲醇和乙腈為色譜純，其余均為分析純。小粒種咖啡實驗用對照品：咖啡酸（質量分數為99.7%）、阿魏酸、木犀草素、單咖啡酞。實驗用水：娃哈哈純凈水。10批小粒種咖啡樣品：5批（S1-S5）為小粒種咖啡，4批（Z1-Z4）為混偽品野生小粒種咖啡，1批（R）為優異小粒種咖啡。10批次樣品均用封口袋盛裝，置于干燥器中備用。

二、實驗與方法

1.對照品溶液的制備?？Х人?、阿魏酸、木犀草素和單咖啡酞各稱取0.5g置于5mL量瓶中，向其中添加甲醇，使樣品完全溶解。依次制得質量濃度為0.7856mg/mL、0.9085mg/mL、0.8511mg/mL、0.2182mg/mL的標準溶液。吸取以上四個標準品各2mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，混合均勻，制得咖啡酸為0.1571mg/mL、阿魏酸為0.1817mg/mL、木犀草素為0.4256mg/mL、單咖啡酞為0.0218mg/mL。

2.供試品溶液的制備。將10批小粒種咖啡試樣粉碎成粉后過四號篩，各取0.5g放入10個有塞的錐形瓶中，加入甲醇，將其定容到5mL容量瓶中。在100kHz下超聲波萃取40min，在室溫下冷卻，用0.45mm的微孔濾膜過濾，取出濾液，最后得到濃度為0.69mg/mL的供試品溶液。

3.色譜條件。采用梯度洗脫方法進行洗脫，所使用的流動相為0.1%甲醇（A）和乙腈（B），柱溫為250℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為360nm，進樣量為10μL。

4.建立小粒種咖啡色譜指紋圖譜。制備10批小粒種咖啡溶液，利用高效液相色譜儀對其進行色譜分析，生成小粒種咖啡色譜圖。將獲得的色譜信息輸入到指紋圖譜評估體系，以小粒種咖啡R批為基準，設定時間窗口寬度0.1min，采用中值方法進行多點修正，得到指紋圖譜。

5.小粒種咖啡含量測定。通過高效液相色譜法生成小粒種咖啡的指紋圖譜后，仍然無法有效區分小粒種咖啡與混偽品野生小粒種咖啡，因此需要對兩者指紋圖譜中指認的4個共有成分進行含量測定，為小粒種咖啡的質量控制提供依據。

（1）線性關系。每次選取5μL，以待測化合物的峰面積和對照品的濃度進行線性回歸，前者為縱坐標，后者為橫坐標，通過逐漸增加對照品溶液的濃度，記錄峰面積和濃度數據，運用線性回歸分析確定峰面積和濃度之間的線性關系，最終確定保持良好直線性質的濃度范圍，據此得到各成分的標準曲線，如表1所示。由表1可知，各成分之間的線性關系良好，可進行后續操作。

（2）含量測定。將所需要的咖啡酸、阿魏酸、木犀草素和單咖啡酞4種成分的含量作為變量，測定5批小粒種咖啡和4批混偽品野生小粒種咖啡。以9批小粒種咖啡樣品和9個共有峰的峰面積為變量，利用組間連接法對樣品進行CA，結果見圖1。利用主成分分析（PCA）將9批小粒種咖啡樣品的共有峰峰面積進行標準化處理，在此基礎上，以所測各成分的含量作為自變量，利用各成分間的線性關系對各成分進行主成分分析。

三、結果與分析

1.指紋圖譜結果分析。10批小粒種咖啡樣品的對照色譜指紋圖譜如圖2所示。由圖2可知，R為小粒種咖啡對照圖譜，最終確定了9個共有峰。對比對照品溶液的色譜圖，在色譜指紋圖譜共有峰中共指認出4個成分，2號峰為咖啡酸、4號峰為阿魏酸、5號峰為木犀草素、7號峰為單咖啡酞。綜合發現，本次實驗選取的小粒種咖啡和優良小粒種咖啡色譜圖大體上相似。

2.相似度結果分析。當相似度越接近1，說明兩個色譜越相似。將對照圖譜與10批小粒種咖啡樣品的色譜指紋圖譜進行相似度分析，結果見表2。由表2可知，小粒種咖啡相似度均大于0.940，表明本次實驗選取的小粒種咖啡與優良小粒種咖啡的差異性不大，證明本次實驗選取的小粒種咖啡質量好，建立的色譜指紋圖譜方法可用于小粒種咖啡的鑒別和整體的質量控制。

3.含量測定結果分析。小粒種咖啡樣品的PCA得分圖如圖3所示。由圖3可知，5批小粒種咖啡和4批混偽品野生小粒種咖啡均含有咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、單咖啡酞，對比兩者中的咖啡酸含量發現，小粒種咖啡所含咖啡酸的含量普遍高于混偽品野生小粒種咖啡，因此可以通過比較咖啡酸的含量，較好地區分小粒種咖啡和混偽品野生小粒種咖啡。

綜上所述，本研究所建立的基于色譜指紋圖譜技術的小粒種咖啡質量控制方法，不僅簡便、準確，還能進行定性和定量雙重分析，為小粒種咖啡的質量評價提供了參考依據。

基金項目：2022年度普洱市科技局普洱學院咖啡研究專項（2022KFZX03）。

作者簡介：單治國（1979-），男，漢族，山東兗州人，副教授，博士，主要研究方向為茶葉與咖啡科學技術。

張春花（1984-），女，彝族，云南瀘西人，副教授，博士，主要研究方向為茶葉與咖啡科學技術。