紅花Aux/IAA基因家族鑒定及鹽脅迫響應分析

劉湘楠 胡祥祥 喬夢燚 周丹寧 朱畇昊

摘要：為了對紅花Aux/IAA基因家族進行生物信息學分析，研究該基因在紅花生長發育中的調控作用，利用生物信息學方法，在紅花全基因組中鑒定出28個Aux/IAA基因。根據其與擬南芥Aux/IAA基因的系統發育關系，使用MEGA 7.0做出系統發育進化樹。經理化性質分析，紅花Aux/IAA蛋白為親水性蛋白，且79%位于細胞核中，大多數紅花Aux/IAA蛋白表現為偏酸性；經聚類分析，將紅花Aux/IAA基因分為5個亞族?；蚪Y構分析表明，所有基因均含有 1～9個內含子。這些基因在紅花的9條染色體上非均勻地分布，其中9號染色體上分布最多，有7個Aux/IAA基因。紅花Aux/IAA基因在不同發育期及不同外源激素處理下表達量各不相同。對保守基序作圖分析發現，大部分紅花Aux/IAA 蛋白具有 4 個共同的保守基序，分別為motif 1、motif 2、motif 3、motif 4，qRT-PCR結果表明，不同濃度鹽脅迫處理24 h后，基因CtAux/IAA1相對表達量呈上調趨勢，推測此基因可能與提高紅花抗鹽脅迫能力有關。本研究結果將有助于了解紅花Aux/IAA基因家族在生長發育過程中的功能并篩選優良基因。

關鍵詞：紅花；Aux/IAA基因家族；生物信息學分析；鹽脅迫

中圖分類號：S567.21⁺9.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0068-09

收稿日期：2023-06-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：81603232）；國家重點研發計劃（編號：2017YFC1702800）；河南省重大科技專項（編號：171100310500）；河南省科技攻關項目（編號：172102310539）。

作者簡介：劉湘楠（2000—），女，河南許昌人，碩士研究生，主要從事藥用植物分子生物研究。E-mail：1296969180@qq.com。

通信作者：朱畇昊，博士，副教授，主要從事藥用植物分子生物研究。E-mail：guxinhan123@163.com。

紅花（Carthamus tinctorius L.）是《中華人民共和國藥典》1963年版至2015年版收載藥物，屬常用中藥，具有活血化瘀，通經止痛的功效^[1]。近年來，由于分子生物學技術的飛速發展，大多數中藥材的藥理成分和化學成分被深入研究，對紅花進行基因信息分析已成為一個熱門課題。截至目前，有關紅花基因的生物學信息還很少見。

生長素普遍存在于所有植物中，參與到植物的各個生長發育階段，其在植物細胞分裂、胚胎發育、建成形態、向性反應、加長休眠、頂端優勢和組織分化等多種生長發育過程中發揮著極其重要的作用^[2]。Aux/IAA是生長素信號早期響應因子之一，被認為是最有活力和最重要的基因調節系統之一^[3]，其編碼的蛋白質能通過與生長素響應因子特異性結合來調控生長素響應基因的表達，在整個植物生長素信號轉導過程中具有重要作用^[4]。大多數Aux/IAA基因具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個保守結構域，保守結構域Ⅰ含有保守的亮氨酸重復基序LxLxLx，抑制生長素下游調控基因；結構域Ⅱ是AUX/IAA不穩定的關鍵成分^[5]，存在高度保守序列（GWPPV）；結構域Ⅲ和Ⅳ含有與ARF相結合的位點，但這些結構域通常會有所缺失。

近年來，有關 Aux/IAA基因家族成員在某些植物中的作用已逐漸受到人們的關注，且有了較大的進展。此后針對Aux/IAA基因家族各個成員之間的關系、這些成員與其他家族基因的調節控制關系以及基因編碼蛋白的調節控制作用及其協同作用的機制，它們與生長素之間的調控機制還有待深入探討，這些都將有助于闡明植物生長發育的機制，為植物分子水平改良提供理論依據^[6]。

1? 材料與方法

1.1? 樣品處理及試驗地點

紅花種子購自河北萬草種業有限公司。種子采用土培，培養至真葉期18 d后，選取長勢一致的紅花幼苗，分別用蒸餾水以及100、200、300 mmol/L的NaCl溶液處理24 h 后取樣，每個濃度5個生物學重復，做好標記，并立即放入液氮中速凍，儲存于 -80 ℃ 冰箱。試驗于2023年4月21日在河南中醫藥大學河南省道地藥材生態種植工程技術研究中心進行。

1.2? 試驗材料

從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載Aux/IAA結構域的HMM 模型文件（Pfam02309），基于HMM 模型，從紅花基因組中檢索得到候選Aux/IAA蛋白，使用Pfam數據庫檢索的結果整合、去冗余和去除不完整序列，共篩選出28個紅花Aux/IAA基因。在文獻[7]中查到擬南芥Aux/IAA基因家族的基因共29個。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 紅花Aux/IAA蛋白的理化性質分析及亞細胞定位預測

對得到的紅花Aux/IAA基因家族的候選序列，利用在線預測軟件ORF Finder篩選具有全長核苷酸的紅花Aux/IAA基因家族序列。通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）軟件在線對紅花Aux/IAA基因家族蛋白的相對分子質量、等電點（pI）和親水性平均系數（GRAVY）等指標進行預測；使用SOPMA （https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）預測紅花Aux/IAA蛋白二級結構；利用WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件分析紅花Aux/IAA蛋白亞細胞定位。

1.3.2? 紅花Aux/IAA基因染色體定位分析

使用Mapchart軟件，按照Aux/IAA基因家族每條染色體的長度和每個基因序列在紅花染色體上的物理位置，對28個紅花Aux/IAA基因進行染色體定位分析。

1.3.3? 紅花Aux/IAA基因家族系統進化樹分析

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載擬南芥Aux/IAA基因家族的氨基酸序列共29個，用于進化分析。采用MEGA 7.0軟件內置的Clustal W 算法對紅花和擬南芥Aux/IAA基因家族的多個氨基酸序列進行比對，重復次數為500 次，其他參數使用默認值，將比對的結果構建系統發育樹。

1.3.4? 紅花Aux/IAA基因家族基因結構分析

根據紅花Aux/IAA基因家族的核苷酸序列與編碼序列，使用GSDS網站（http：//gsds.gao-lab.org/）繪出紅花Aux/IAA基因家族基因結構圖。從基因組注釋文件中下載紅花Aux/IAA的基因結構注釋信息，使用在線軟件 MEME（http：//meme-suite.org/）將預測的基序數目設置為20，對紅花Aux/IAA基因家族的保守基序進行預測與分析。使用TBtools將MEME預測結果可視化。

1.3.5? 紅花Aux/IAA基因家族蛋白互作網絡分析

在STRING數據庫輸入28個紅花Aux/IAA蛋白氨基酸序列，選擇擬南芥進行同源比對，得出蛋白互作網絡圖（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.3.6? 紅花Aux/IAA基因表達模式分析

從NCBI數據庫下載紅花Aux/IAA基因在不同外源激素誘導后以及5個時期（小芽期、中芽期、初花期、盛花期、衰花期）的基因表達數據，使用TBtools軟件繪制28個紅花Aux/IAA基因在不同外源激素處理下及5個發育時期的基因表達量熱圖。

1.3.7? 紅花Aux/IAA基因鹽脅迫的表達分析

使用Trizol法提取不同濃度NaCl處理紅花幼苗的RNA。使用BeyoRT^TMⅢcDNA第一鏈合成試劑盒對提取的RNA進行反轉錄得到紅花幼苗 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。從28個紅花Aux/IAA基因中挑選5個基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA3、CtAux/IAA11、CtAux/IAA14、CtAux/IAA15，進行qRT-PCR驗證，引物序列如表1所示，內參基因為Ct60s。采用康為UItraSYBR Mixture（Low ROX）兩步法進行試驗，2^-ΔΔC_T計算相對表達量，SPSS和Graph對計算結果進行分析并繪制柱狀圖。qRT-PCR反應體系：UItraSYBR Mixture qPCR Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 1.5 μL，雙蒸水補至20 μL。qRT-PCR反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

2? 結果與分析

2.1? 紅花Aux/IAA基因序列的鑒定及結構特征

利用BLAST在線分析軟件對紅花基因組數據庫進行同源序列比對，篩選出含有全長的核苷酸序列，最終在紅花中鑒定獲得Aux/IAA基因28個（表2）。

2.2? 紅花Aux/IAA蛋白的理化性質及蛋白特性分析

紅花Aux/IAA蛋白的理化性質分析結果（表2）表明，28個紅花Aux/IAA蛋白氨基酸長度為 150～427 aa；平均相對分子質量為26.106 09 ku；其理論等電點平均值為 6.92，說明大多數紅花Aux/IAA蛋白表現為偏酸性。其中27個紅花Aux/IAA蛋白的親水性平均系數均小于零，說明27個紅花Aux/IAA蛋白屬于親水性蛋白。利用PSORT軟件得出紅花Aux/IAA蛋白的亞細胞定位，結果（表2）顯示，紅花Aux/IAA蛋白可能主要分布在細胞核、細胞質、葉綠體中。其中，79%紅花Aux/IAA蛋白被定位于細胞核，這表明紅花Aux/IAA蛋白可能在細胞核中起作用。

2.3? 紅花Aux/IAA基因染色體定位分析

利用紅花基因組信息，繪制Aux/IAA基因在染色體上的位置，如圖1所示，9條染色體上非均勻地分布著28個基因，其中1號染色體上分布的基因最少，只有一個CtAux/IAA8，9號染色體上分布的基因最多，有7個基因，基因CtAux/IAA22、CtAux/IAA23、CtAux/IAA24、CtAux/IAA25在9號染色體上形成基因簇。2號、6號和11號染色體上均只有2個Aux/IAA基因；有3條Aux/IAA基因分布于3號和12號染色體上。

2.4? 紅花Aux/IAA基因家族系統進化樹分析

將29個擬南芥和30個紅花的蛋白序列進行多序列比對，結果表明，紅花和擬南芥的Aux/IAA 蛋白共可分為5個亞類，分別命名為 A、B、C、D、E組（圖2）。每組包含的2種植物基因家族蛋白數各不相同，同一個亞組中蛋白的同源性較高。

2.5? 紅花Aux/IAA基因結構分析

已有研究顯示，基因結構的多樣性是眾多基因

家族演化的動力^[8]。進一步對紅花Aux/IAA基因結構進行分析，研究其結構的多樣性。結果顯示，所有基因均含有1～9個內含子?；駽tAux/IAA19的內含子最多，為9個。根據進化樹結果（圖3）顯示，同一亞組的基因具有相似的基因結構，比如，基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA6、CtAux/IAA28的結構相似，且都在亞組D。對紅花Aux/IAA保守基序分析發現，大多數（20個）紅花Aux/IAA 蛋白序列包含 4 個保守基序：motif1、motif2、motif3和 motif4，其余8個紅花Aux/IAA蛋白序列均有缺失，這種有缺失的基因被稱為非標準類型Aux/IAA基因^[9]。結構域缺失或突變現象，可能會導致基因功能異常^[10]。28個紅花Aux/IAA蛋白中有 1個缺失 motif1，4個缺失 motif2，2個缺失 motif3，4個缺失 motif4。在保守基序分布相似的基因在進化樹中也聚在一起，表明保守基序相似基因的結構功能也相似，例如，motif10只存在于基因CtAux/IAA11、CtAux/IAA12中，而這2個基因經聚類分析都在亞組D。除了4種典型的保守基序外，紅花Aux/IAA 蛋白還存在其他 6 種保守基序，各成員間保守基序的重疊與差異某種程度上能反映它們的功能特征^[11]。由圖4可知，大多數Aux/IAA基因具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個保守結構域，保守結構域Ⅰ含有保守的亮氨酸重復基序LxLxLx；結構域Ⅱ存在高度保守序列（GWPPV）；結構域Ⅲ和Ⅳ含有與ARF相結合的位點，但這些結構域通常會有所缺失。

2.6? 紅花Aux/IAA基因家族蛋白互作網絡分析

由圖5可知，蛋白SHY2、AXR3與紅花Aux/IAA蛋白具有相互作用。AXR可能在葉片老化過程中有調節控制作用^[12]；SHY2是作為生長素、細胞分裂素和油菜素內酯調控根分生組織發育的一個節點^[13]。其中，IAA19蛋白的互作通路最多，高達16條。紅花Aux/IAA蛋白與這2種蛋白聯系密切，推測紅花Aux/IAA蛋白與其功能相似。

2.7? 紅花對Aux/IAA基因表達模式分析

使用TBtools軟件繪制紅花Aux/IAA基因在空白組和加入油菜素內酯（BR）、茉莉酸甲酯（MEJA）以及在5個時期的基因表達量熱圖。油菜素內酯是一種具有增加坐果率、促進作物生長、增大果實、增強作物耐寒能力、減輕藥害、提高抗病能力作用的植物源植物生長調節劑。由圖6-a可知，加BR后，基因CtAux/IAA1、CtAux/IAA4、CtAux/IAA5、CtAux/IAA26表達量增幅較大，表明這些基因可能最先與BR響應從而增強紅花抗逆性，而基因CtAux/IAA10、CtAux/IAA24、CtAux/IAA27在加入BR后表達量均大幅下降，可能是BR響應抑制了這些基因的表達。MEJA的外源使用可刺激植物防御基因的表達，誘導植物的化學防御，其作用類似于機械傷害和昆蟲取食。在加入MEJA后，基因CtAux/IAA3、CtAux/IAA5、CtAux/IAA8、CtAux/IAA16、CtAux/IAA19表達量較空白組有所增加，而基因CtAux/IAA2、CtAux/IAA7、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA15、CtAux/IAA21、CtAux/IAA26、CtAux/IAA27表達量大幅降低，基因CtAux/IAA17始終不表達，表明這個基因可能不參與BR、MEJA的相應過程。

由圖6-b可知，幾乎全部Aux/IAA基因在植物生長的5個時期均有表達，基因CtAux/IAA18僅在小芽期有非常微量的表達，而基因CtAux/IAA7、CtAux/IAA19在衰花期表達水平較高，從小芽期直到衰花期基因CtAux/IAA3的表達量幾乎都比其他基因高，基因CtAux/IAA2、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA26的表達量均在盛花期達到最高值，據此可以找出7個高表達的基因，分別為

CtAux/IAA2、CtAux/IAA3、CtAux/IAA7、CtAux/IAA11、CtAux/IAA13、CtAux/IAA14、CtAux/IAA26，可以為更深入的紅花Aux/IAA基因家族生長機制研究提供依據。

2.8? 紅花Aux/IAA基因鹽脅迫的表達分析

為研究紅花Aux/IAA基因在不同濃度鹽脅迫下的表達水平，本研究選取不同亞組中表達量較高的5個基因，用q-PCR檢測這5個基因在不同濃度NaCl脅迫下的表達量。由圖7可知，在鹽脅迫下，5個基因的表達量存在差異，CtAux/IAA3的表達量隨著鹽濃度的升高呈下調趨勢，說明鹽脅迫抑制了該基因的表達，CtAux/IAA1在200 mmol/L NaCl處理下的相對表達量最高，響應了鹽脅迫，推測此基因可以提高紅花的抗鹽能力，但其響應脅迫機制待研究。

3? 結論與討論

Aux/IAA基因家族在植物生長素的響應途徑中發揮著關鍵作用。最早從大豆受生長素誘導的基因中分離得到Aux/IAA基因，之后更多物種Aux/IAA基因家族的理化性質及特異性功能得到挖掘與鑒定。對其他物種Aux/IAA基因家族的研究表明，該基因家族在不同物種內的數量不一^[14]，包括在擬南芥中發現了29個Aux/IAA基因家族成員，在桃^[15]、大白菜^[16]、 黃瓜^[17]、高粱^[18]、粗山羊草^[19]中分別發現了22、59、28、25、28 個Aux/IAA基因家族成員，不同基因家族成員在植物生長發育過程中具有不同的功能，例如楊樹中PtrI AA14.1的突變會產生葉片卷曲、分枝增多、育性下降等表型^[20]；在擬南芥中穩定表達桉樹IAA4基因會造成根系向地性消失，莖木質部纖維消失，木質部維管發育受阻，束間纖維發育遲緩^[21]。水稻IAA13基因影響根系的發育，iaa13突變體中側根的數量下降，組成性通氣組織數量減少^[22]。

為了更好地理解紅花生長素的響應途徑，揭示Aux/IAA基因家族在紅花生長發育和和抗逆境脅迫中的功能^[23]。本試驗對紅花Aux/IAA基因家族進行了分析研究，共鑒定到28個紅花Aux/IAA家族基因，與擬南芥中的Aux/IAA家族成員數量基本一致。根據系統發育樹分析，這57個家族成員可分為5個亞組，同一組中大多數Aux/IAA基因的結構都非常相似，少數基因的結構有特異性。Aux/IAA基因家族編碼的蛋白一般由4個保守基序組成。經染色體定位圖分析，9號染色體上端有4個基因形成的基因簇，可能是由于串聯復制導致了基因家族的擴張^[24]。通過基因結構分析，發現所有基因均含有 1～9個內含子。在BR和MEJA的脅迫下，各基因的相對表達量發生變化，表明紅花Aux/IAA基因在響應BR和MEJA脅迫過程中具有重要作用。根據紅花Aux/IAA基因家族的表達熱圖，找到了7個高表達基因，它們可能在紅花的整個生長發育過程中起重要作用。qRT-PCR結果表明，CtAux/IAA1可能有提高紅花抗鹽脅迫的能力。這些發現將有助于進一步分析紅花Aux/IAA基因在生長發育過程中的功能。

隨著分子生物信息學和中醫藥的快速發展，許多中藥材的基因信息解析逐步成為研究的熱點。但是對于紅花Aux/IAA基因家族生物信息學分析較少，紅花Aux/IAA家族成員在紅花生長發育過程中的調控機制尚不明確。因此，本研究通過生物信息學分析紅花Aux/IAA基因家族的基因結構等，鑒定紅花基因組中的Aux/IAA基因家族成員并分析它們的理化性質、保守基序、基因結構、蛋白互作網絡、表達模式、鹽脅迫等，了解到Aux/IAA家族基因在整個紅花生長素信號轉導過程中具有重要作用。本研究可為深入了解紅花Aux/IAA基因家族在生長發育過程中的功能及分子育種篩選優良基因提供一定的理論依據^[25]。

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