miRNA-375 在食管鱗狀細胞癌中的研究進展

馬永明 ，耿玉涵, ，孫敬陽 ，金剛，楊毅，劉佳偉，馬龍 ，朱自江

1 甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，蘭州 730000

2 甘肅省人民醫院胸外二科，蘭州 730000

3 寧夏醫科大學第一臨床醫學院，銀川 750004

食管癌是世界范圍內常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率分別居全部惡性腫瘤第7位和第6 位，患者的5 年生存率為15%～20%[1]。食管癌的預防措施及其臨床管理因組織學亞型不同而不同，食管癌的兩種主要組織學亞型是食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）[2]。ESCC 是食管癌最常見的組織學類型，起源于食管的鱗狀上皮細胞。近年來在西方國家，起源于食管和胃交界部EAC 的發病率和病死率均在上升[3]。據統計，全世界的食管癌患者約半數在中國[4]，發達國家以EAC 為主，發展中國家以ESCC 更為常見，在中國，ESCC 一直是主要的組織學亞型[5]。食管癌的危險因素包括吸煙、飲酒、不良飲食習慣（食用加工肉類、熱飲熱食、食用腌制蔬菜等）、營養素缺乏（包括維生素以及礦物質鋅、硒、鉬等缺乏）、感染、家族遺傳等[4]。ESCC 的危險因素包括男性、家族吸煙、飲酒、不良飲食習慣及不良口腔衛生。食管癌早期通常無癥狀或癥狀比較輕微，大多數患者確診時已發展至晚期，因此，食管癌患者的5 年生存率仍不理想[6]。目前食管癌檢測和篩查方法的特異度及靈敏度均較低，無法滿足臨床檢測及治療需求，需要尋求更多的生物標志物來進行早期預測、輔助診斷、臨床治療和預后評估。微小RNA（microRNA，miRNA）-375 作為miRNA 家族重要的一員，參與包括食管癌在內的多種腫瘤的發生過程，通過調控原癌基因和抑癌基因的表達，在腫瘤細胞的分化、增殖、微環境改變、凋亡、遷移和侵襲等過程中扮演極其重要的角色。本文總結miRNA-375 在ESCC 發生發展中的作用及靶向調控機制，旨在為ESCC 的臨床診斷、治療方案制訂及預后評估提供參考依據。

1 miRNA 的起源

miRNA 是一類高度保守、非編碼、單鏈小分子RNA，長度為21～23 個核苷酸，廣泛存在于真核生物中。miRNA 存在多種形式，在RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉錄生成最原始的初始微小RNA（primiRNA），其長度為300～1000 個堿基，在蛋白復合物Drosha-DGCR8 的作用下進一步被加工為前體微小RNA（pre-miRNA），其長度為70～90 個堿基，pre-miRNA 經Dicer 酶酶切后，成為長度為20～23個核苷酸的成熟miRNA[7]。miRNA 在動植物中參與轉錄后基因表達調控，Lee 等[8]于1993 年在研究線蟲異慢性基因lin-4編碼過程中首次發現了miRNA，lin-4基因表達與lin-14 蛋白表達呈負相關，會使線蟲發育過程的總體時間縮短。

2000 年，Reinhart 等[9]研究發現了let-7。隨后多個研究小組在包括線蟲、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRNA，并發現miRNA 在轉錄后基因表達調控中具有重要作用。許多miRNA在基因序列上聚集分布，這意味著機體可能會同時表達一類miRNA，導致不同或者協同的生物學效應。miRNA 轉錄后可抑制靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）表達，通過與靶基因的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）相互作用進而抑制靶基因的翻譯及降解。這與小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和靶基因完全匹配不同，miRNA 與靶基因之間可能會存在錯配，miRNA 與靶基因結合后，可能會導致mRNA 進入P 小體進行降解[10]。

2 miRNA 與腫瘤的關系

miRNA 與腫瘤的關系十分密切。研究表明，miRNA 的異常表達是由多種腫瘤的基因畸變引起的，并通過使靶基因表達失調在腫瘤的發生、發展過程中發揮作用。因此，很多miRNA 與腫瘤的發病機制密切相關，包括細胞增殖、分化、微環境改變、凋亡、遷移和侵襲等。已有研究表明，miRNA通過調控癌基因或抑癌基因的表達，誘導腫瘤細胞增殖或凋亡。miRNA 可表現出不同的功能，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等過程，在腫瘤的基因調控方面發揮積極作用[9]。魏雪源等[11]研究顯示，miRNA 參與了高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）癌蛋白（特別是E6/E7 蛋白）所致宮頸癌細胞的遷移、侵襲過程，且miRNA 是一種重要的腫瘤調控因子，靶向調控腫瘤的一系列復雜轉化。目前，已有研究發現miRNA 可以分為兩大類，即致癌miRNA 和抑癌miRNA，前者在腫瘤細胞及腫瘤組織中靶向降解抑癌基因，后者則是針對癌基因進行靶向降解。丁昊等[12]研究發現，miRNA 表達失調影響前列腺腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、微環境改變、遷移和侵襲等過程。鑒于miRNA 的這些功能特性，其有望為前列腺癌的早期診斷、治療和預后評估提供新的靶點。Inoue 和Inazawa[13]的研究分析了各種腫瘤相關miRNA 及其在腫瘤治療中的臨床應用，結果發現，腫瘤抑制微小RNA（tumor suppressor miRNA，TS-miRNA）參與多種腫瘤的發生發展過程，TS-miRNA 可同時抑制多種癌基因的表達，ds-miRNA-634 模擬物的引入顯著增加了包括ESCC 細胞在內的多種腫瘤細胞對順鉑的敏感性，并且在ESCC 異種移植小鼠模型中，將dsmiRNA-634 模擬物局部注射到腫瘤周圍的皮下空間，也增加了順鉑藥物的抗腫瘤作用，證實了ds-miRNA-634 模擬物作為抗腫瘤藥物的潛力。Menon 等[14]研究進一步說明miRNA 與腫瘤具有高度相關性，這在Kim 等[15]研究中也有體現。miRNA 是一類潛在的腫瘤標志物，在多種腫瘤的基因調控、早期篩查、診斷、治療及預后評估等方面具有廣闊的應用前景。近年來研究發現，miRNA-375 與腫瘤的發生發展關系密切。Censi等[16]研究表明，miRNA-375 可作為甲狀腺髓樣癌診斷和預后評估標志物。Pietrus 等[17]研究也證明了miRNA-375 與子宮內膜癌患者的預后存在相關性。Wu 等[18]研究證實miRNA-375 可通過靶向異嗜性和多嗜性逆轉錄病毒受體1（xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1，XPR1），抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲，為ESCC 患者的精準治療提供了新的潛在靶點。miRNA-375 參與調控腫瘤發生的多個環節，例如腫瘤細胞增殖、組織侵襲、淋巴結轉移或遠處轉移等，在不同腫瘤中分別扮演了癌基因或抑癌基因的角色。

3 miRNA-375 在ESCC 中的表達

miRNA-375 是miRNA 家族的一員，主要參與細胞分化、增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。劉陽等[19]研究表明，miRNA-375 表達水平與ESCC 患者的臨床病理特征及預后均存在相關性。Hu 等[20]研究對ESCC 患者ESCC 組織中miRNA-375 表達情況進行分析，結果發現，miRNA-375 在ESCC 患者ESCC 組織中的表達顯著降低，此外，與正常食管上皮Het-1A 細胞相比，食管癌EC109 細胞中miRNA-375 表達水平顯著下調，表明miRNA-375 表達下調可能與食管癌的發生有關。張雪梅等[21]研究分析miRNA-375 與食管癌的相關性，結果表明，miRNA-375 在食管癌組織中的表達水平低于癌旁組織，miRNA-375 通過調控星形細胞上調基因-1（astrosyte elevated gene-1，AEG-1）的表達參與食管癌的發生、發展過程。此外，Liu 等[22]研究表明，miRNA-375 在ESCC 中作為抑癌基因，在腫瘤細胞生長、增殖及分化過程中發揮重要的負調節作用。

Li 等[23]通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測38 例ESCC 患者和19 例健康受試者血漿中miRNA-375 水平，結果顯示，miRNA-375 低表達與ESCC 的發生有關，其可作為診斷ESCC 的潛在生物標志物。

國內外進行了大量有關miRNA-375 在ESCC組織和癌旁組織及ESCC 患者和健康人群中表達水平的研究，發現miRNA-375 在ESCC 中低表達，表明miRNA-375 在ESCC 的發生發展過程中可作為抑癌因子。Wang 等[24]進行的一項薈萃分析納入13 項研究共1340 例ESCC 患者，結果表明，miRNA-375 低表達與ESCC 患者總生存期（overall survival，OS）較短有關，提示miRNA-375 可作為評估ESCC 患者預后的潛在生物學指標。Zhang 等[25]研究發現，與健康者相比，ESCC 患者miRNA-375 表達水平較低，而miRNA-21 和miRNA-223 均過表達，表明miRNA-375 可作為診斷ESCC 的非侵入性生物標志物。Osako 等[26]研究表明，miRNA-375在ESCC 組織中的表達明顯下調，其低表達可增強ESCC 細胞的侵襲能力，并且miRNA-375 的異位表達對ESCC 細胞的遷移和侵襲具有顯著的抑制作用。通過對ESCC 中miRNA-375 的表達進行研究發現，ESCC 中miRNA-375 存在異常表達調控，并且這種異常表達調控可以影響ESCC 發展的不同階段及過程。在ESCC 發生的早期階段，借助早期篩查方法可發現miRNA-375 低表達，這也意味著miRNA-375 是一類極其敏感的腫瘤標志物。因此，準確地檢測患者血液或組織中miRNA-375 的表達水平，對ESCC 的篩查、臨床治療及預后評估具有重要意義。

4 miRNA-375 對ESCC 的靶向調控

miRNA 靶位點的尋找方法主要包括mRNA 和蛋白質水平檢測。雙熒光素酶基因法是目前最為常用的miRNA 靶位點鑒定方法，其基本原理如下：通過構建熒光素酶表達載體，將待鑒定的miRNA 靶基因的3'-UTR 構建到熒光素酶基因的3'-UTR 中；之后將構建好的載體轉染細胞并改變細胞中相應miRNA 的表達水平；最后檢測熒光素酶的表達情況，分析轉染3'-UTR 中是否含有miRNA的靶位點[27]。Ren 等[28]對食管癌與人表皮生長因子受體2（ human epidermal growth factor receptor 2，HER2，也稱ERBB2）的相關性進行研究，結果表明，miRNA-375 過表達會抑制食管癌細胞的增殖和侵襲，ERBB2是miRNA-375 的潛在靶基因，參與ERBB2/血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）信號通路的調控。該研究證實miRNA-375 是腫瘤抑制因子，其通過與靶基因的3'-UTR 結合，影響ERBB2/VEGFA 信號通路，直接抑制ERBB2 的表達，進而調控ESCC 組織中VEGFA 的表達水平。miRNA-375 的發現有助于為ESCC 提供新的研究方向及治療靶點。Luo等[29]研究納入44 例ESCC 患者的組織標本，采用qRT-PCR 和蛋白質印跡法兩種技術測定circ_0000654、E2F 轉錄因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）和miRNA-375 表達水平，結果發現，miRNA-375 與circ_0000654、E2F3 表達水平均呈負相關，miRNA-375 過表達會導致circ_0000654 耗竭，促使細胞凋亡，抑制體外腫瘤細胞增殖和糖酵解等過程，從而抑制腫瘤生長。一項關于miRNA-375 在食管癌中作用機制的研究顯示，miRNA-375是ESCC 的抑癌因子，其可通過下調直接靶標異黏蛋白（metadherin，MTDH）的表達來抑制腫瘤細胞的生長和浸潤，調控miRNA-375/MTDH 信號通路可作為臨床治療ESCC 的潛在方法[20]。金立等[30]選取兩種人ESCC 細胞（kyse-70、kyse-30），通過一系列體外細胞功能學實驗，檢測miRNA-375、矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）對ESCC 細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及miRNA-375 對SHOX2 的靶向調控作用，結果表明，miRNA-375 作為抑癌因子，能有效抑制ESCC 細胞生長和浸潤；SHOX2可能是癌基因，促進ESCC 細胞增殖和侵襲；miRNA-375 與SHOX2 的表達呈負相關，miRNA-375 可靶向負調控SHOX2 的表達，對ESCC 細胞的增殖和侵襲具有重要調控作用，Yi等[31]研究也證實了這一觀點。另有研究發現，miRNA-375/基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）13 信號通路在ESCC 細胞侵襲過程中具有關鍵作用[26]。He 等[32]通過分離轉染后的人臍帶間充質干細胞來源的外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosome，hUCMSC-exo），并將其與ESCC 細胞共培養，檢測hUCMSC-exo 遞送的miRNA-375 對ESCC 發展的影響，結果顯示，在ESCC 中，miRNA-375 表達降低，而ENAH 蛋白表達升高，ENAH是miRNA-375的靶基因，通過上調miRNA-375 的表達或降低ENAH 的表達來抑制ESCC 細胞增殖、侵襲、遷移并促進細胞凋亡，進而抑制腫瘤生長。張雪梅等[21]研究發現，miRNA-375 在ESCC 組織中的表達低于癌旁組織，可能與miRNA-375 調控AEG-1 的機制有關。研究表明，胰島素樣生長因子1 受體（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）是miRNA-375 的靶基因，miRNA-375 可以與IGF1R的3'-UTR 相互作用，進而抑制ESCC 細胞增殖[32]。這些研究進一步證實了miRNA-375 在ESCC 發生、發展、早期篩查、細胞周期、分化、增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中有關鍵作用，準確快速地預測miRNA 靶基因對于研究miRNA-375 的功能，并分析miRNA-375 參與的靶向調控過程具有十分重要的意義。

5 miRNA-375 有望用于ESCC 的診斷和治療

很多研究已經證實miRNA-375 與ESCC 具有密切聯系，miRNA-375 通過調控靶基因的表達，參與ESCC 細胞的分化、增殖、遷移和侵襲等過程。一項薈萃分析顯示，miRNA-375 表達下調與ESCC患者OS 縮短有關，其在ESCC 患者中具有高度特異性，可能是診斷ESCC 的潛在生物標志物[33]。Jamali 等[34]對食管癌生物標志物進行研究，結果發現，miRNA-375 與ESCC 的發生和發展密切相關，可作為ESCC 診斷和治療的生物標志物。Sun 等[35]通過酶聯免疫吸附試驗和qRT-PCR 檢測125 例ESCC 患者和125 例健康者血漿中腫瘤相關抗原自身抗體（autoantibody against tumor-associated antigen，TAAb）和miRNA 表達情況，結果顯示，采用TAAb 和miRNA 聯合診斷ESCC 具有很大優勢，特別是對于早期ESCC 的診斷；miRNA-375 在ESCC中不僅作為腫瘤抑制因子來抑制腫瘤的發展與侵襲，也是ESCC 診斷及治療的潛在標志物，為臨床治療ESCC 患者提供新的方法。

6 miRNA-375 對ESCC 患者預后的影響

食管癌是世界性難題，患者的5 年生存率依舊很低。miRNA-375 表達情況與ESCC 患者的預后密切相關。Fang 等[36]的薈萃分析結果顯示，miRNA-375 高表達與ESCC 患者較長的OS 有關，也就是說miRNA-375 高表達與ESCC 的良好預后有關。Wu 等[37]研究檢測ESCC 患者的血清miRNA-375 水平，結果顯示，血清miRNA-375 低表達與ESCC 患者生存率較低有關，表明miRNA-375 異常表達直接影響ESCC 患者的預后，是ESCC 患者潛在的預后標志物。Isozaki 等[38]研究表明，miRNA-21 高表達和miRNA-375 低表達ESCC 患者的預后明顯更差，miRNA-21、miRNA-375 是評價ESCC 患者預后的可靠生物標志物。另外一項研究發現，miRNA-375 低表達與淋巴浸潤有關，且與ESCC 患者的不良預后有關[19]。Gao 等[39]薈萃分析結果顯示，食管癌組織中miRNA-21、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-138、miRNA-203、miRNA-375、miRNA-655 表達水平以及血液中miRNA-21 和miRNA-223 表達水平對于食管癌具有重要的預后預測價值，miRNA-21 高表達和miRNA-375 低表達食管癌患者的OS 明顯較短。劉陽等[19]研究表明，miRNA-375 異常表達與ESCC 患者的臨床病理特征及預后均有關。Li 等[23]研究顯示，miRNA-21、miRNA-375 表達情況與ESCC 患者的預后有關。miRNA-375 作為miRNA 家族中的重要一員，已被多項研究證實參與ESCC 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程，miRNA-375 有望成為ESCC 診斷及治療的新型靶點，同時也是評估患者預后的重要指標。

7 小結與展望

綜上所述，ESCC 患者的5 年生存率仍不理想，miRNA-375 作為抑癌基因，在ESCC 細胞的增殖、分化、遷移、侵襲等過程中發揮重要作用，不僅可用于ESCC 的篩查，也可用于ESCC 的診斷、療效評估和預后判斷。ESCC 篩查的主要目的是檢測食管鱗狀異型增生和早期ESCC，以達到治愈的目的。早期ESCC 能夠通過手術治療，患者的5 年生存率可達80%～90%[40]，因此，早診斷、早治療有助于控制ESCC 的進展和轉移。miRNA-375 在腫瘤中扮演極其重要的角色，有望為腫瘤的癌前診斷、臨床治療及預后評估提供更加強有力的證據，為腫瘤患者帶來更大的益處。但目前有關miRNA-375 在ESCC 中調控機制的研究較少，需要更多研究進一步證實。