中性粒細胞胞外陷阱在慢性阻塞性肺疾病中的作用

許金回，岳紅梅，2，劉苗苗，李雅亭，武興東，朱浩斌

1蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000 2蘭州大學第一醫院呼吸與危重癥醫學科，蘭州 730000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由于呼吸道和肺泡異常所引起的慢性疾病，其發病機制與肺部異常炎癥有關[1]，主要特征是持續性氣流受限、中性粒細胞浸潤增加和反復感染[2]。中性粒細胞是COPD病情進程中肺內浸潤的關鍵細胞，作為抵御病原體侵襲的第一道防線，發生感染時中性粒細胞首先趨化至損傷部位，通過脫芽、吞噬、分泌細胞因子及形成中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)的方式清除病原體，在呼吸道疾病調控中發揮核心作用[3]。

NETs是一種網狀結構，由中性粒細胞釋放的染色質和顆粒蛋白[如中性粒細胞彈性酶(neutrophil elastase，NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)]等內容物形成，并以非定向方式在侵入機體的微生物附近釋放，發揮捕獲和消滅病原菌的作用，從而抵御感染，尤其在因體積過大導致中性粒細胞無法吞噬病原體的清除中發揮重要作用[4]。最新研究認為，NETs可直接對肺上皮和內皮細胞產生細胞毒性，在肺炎、COPD和哮喘等慢性呼吸道疾病中均可見NETs過量產生，對已形成的NETs進行破壞有望成為COPD治療的一種新模式[5]。雖然吸煙、遺傳、早期生活事件、有害環境暴露等傳統危險因素與COPD的發生均具有一定相關性，但由于發病機制復雜，不同危險因素所致的COPD在病理生理機制和臨床表現方面存在一定程度的差異，從而影響臨床診療，故迫切需要可靶向治療COPD的藥物，而NETs作為中性粒細胞衍生物，參與了COPD病情進展，有望作為COPD的潛在治療靶點。本文主要圍繞COPD發病機制、NETs形成機制、NETs在COPD進展與治療中的作用展開論述，以期為進一步研究提供更多理論依據。

1 COPD發病機制

COPD是一種漸進性的肺部異質性疾病，其發生是多種因素共同作用的結果，如長期暴露于煙草煙霧、粉塵或其他有害環境時，大量外源物和氧自由基將引起免疫細胞激活、募集，從而破壞肺內穩態，引起肺形態和功能發生不可逆性改變[6]；反復的細菌感染、中性粒細胞浸潤將影響平滑肌功能，最終促使呼吸道發生結構重塑和瘢痕形成[7]。目前普遍認為氧化應激、低級別慢性呼吸道炎癥以及蛋白酶-抗蛋白酶表達失衡是COPD發生與病情進展的主要機制。

1.1 氧化應激

氧化應激是COPD發病的關鍵機制。在多種有害因子的長期刺激下，外源性氧化劑與肺部炎癥均可誘導內源性活性氧(reactive Oxygen species，ROS)過量產生，以致機體氧化應激增強，直接破壞多種生物大分子結構，引起細胞代謝異常。大量研究揭示Nrf2介導的氧化應激途徑和線粒體功能障礙途徑，可通過全身氧化應激引起DNA損傷，導致肌無力、肺纖維化、肺氣腫、肺部衰老加速，同時具有慢性炎癥放大效應，可驅動黏蛋白、低聚黏液形成以阻塞呼吸道，加劇COPD惡化[8-9]。Zhang等[10]研究表明，氧化應激可影響sirtuin家族成員表達與活化，通過調節核因子-κappa B(nuclear factor-κappa B，NF-κB)、轉化生長因子β1 (transforming growth factor-β，TGF-β1)及PI3K/mTOR信號通路調控炎癥反應、自噬和凋亡過程，進而影響COPD病程。此外，氧化應激可直接作用于端粒并影響其長度，從而加速細胞衰老、影響肺功能[11]。

1.2 低級別慢性呼吸道炎癥

呼吸道和肺實質慢性炎癥浸潤是COPD的主要特征，其發生與適應性和先天性免疫系統激活有關。首先，在有害因素的刺激下，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CXC 趨化因子配體8(cysteine X chemokine ligand 8，CXCL8)等被大量釋放，驅動了呼吸道炎癥級聯反應[12]，其引起的肺組織損傷為COPD的發生創造了條件。其次，發生COPD后，PI3K信號通路及其下游介質(如蛋白激酶B、磷酸酶和緊張素同源物)表達增多，可誘發炎癥、先天性和適應性免疫、氧化應激惡性循環[13]。此外，中性粒細胞在呼吸道黏膜抗微生物侵襲中發揮重要作用，一方面，作為先天性免疫的重要組成部分，中性粒細胞通過吞噬、脫顆粒及釋放NETs抵抗病原體侵襲和細胞碎片清除[14]；另一方面，其衍生的蛋白酶可直接干擾IL-22/IL-22R信號通路的活性，降低抗菌效應物表達，繼而有利于病原體復制，導致COPD病情加重[15]。

1.3 蛋白酶-抗蛋白酶表達失衡

蛋白酶對組織有損傷、降解作用，而抗蛋白酶對多種蛋白酶具有抑制作用，蛋白酶-抗蛋白酶表達平衡是維持機體正常免疫反應的重要基礎，故蛋白酶和抗蛋白酶表達失衡將導致肺實質被破壞，是COPD發生和發展的另一關鍵因素[16]。生理條件下蛋白酶-抗蛋白酶處于平衡狀態，在內外源性影響因素的作用下，如遺傳因素所致α-1抗胰蛋白酶缺乏、外界有害環境的長期刺激，該平衡被打破后可上調中性粒細胞和巨噬細胞分泌的蛋白酶水平，使細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、彈性蛋白纖維及膠原發生降解，可直接破壞肺實質正常結構，促進COPD進展[17]；此外，降解的ECM可產生趨化肽片段，誘使巨噬細胞和中性粒細胞持續存在，從而加劇COPD炎癥反應和蛋白酶-抗蛋白酶表達失衡，進一步加重COPD[18]。

1.4 其他發病機制

COPD在老年人群中具有較高的發病率，表明年齡相關改變可能是COPD的促進因素，這可能與細胞衰老、端?？s短以及DNA修復缺陷相關[19]。但目前此方面尚缺乏系統性研究，有待高質量臨床試驗加以驗證。

2 NETs形成機制

NETs是由中性粒細胞活化后釋放，以DNA為骨架，表面嵌有組蛋白、MPO、NE，具有殺菌作用的網狀蛋白[20]。早期研究認為，NETs通過捕獲細菌并限制其傳播而對機體發揮有益作用，近年大量研究揭示NETs具有多方面功能，如在慢性炎癥過程中，過度形成或無法清除的NETs可引起組織損傷、不受控制的炎癥和纖維化，并阻止中性粒細胞發揮組織修復功能。目前認為，NETs主要包含以下3種形成機制。

2.1 NADPH氧化酶依賴性NETs的形成

作為最先被發現的NETs形成機制，NADPH氧化酶依賴性NETs主要形成于中性粒細胞被各種刺激物激活后的3～8 h。在形成過程中，中性粒細胞將經歷核膜解體、染色質去濃縮、中性粒細胞死亡等一系列反應，其中染色質去濃縮為關鍵步驟。此類NETs形成過程主要通過PKC-Raf-MERK-ERK途徑激活NADPH氧化酶復合物，產生高濃度ROS、觸發下游染色質去濃縮的級聯信號、激活MPO和NE，而激活的NE易位至細胞核，可通過核心蛋白降解的方式破壞染色質外包裝，隨后MPO與染色質相結合并與NE協作進一步去濃縮，為NETs的形成奠定了基礎[21]。即一方面通過ROS將NE和MPO轉移至細胞核以促進染色質去濃縮；另一方面，細胞外Ca2+內流可激活肽?；彼崦搧啺泵?(protein arginine deiminase 4，PAD4)，使組蛋白發生瓜氨酸化并下調與DNA的結合力，最終導致染色質去濃縮、NETs被釋放至細胞質中，在質膜滲透、中性粒細胞死亡時將NETs排出[22]。

2.2 非NADPH氧化酶依賴性NETs的形成

此類NETs的形成通常發生于中性粒細胞活化后的5～60 min內，其不依賴于NADPH氧化酶，主要在中性粒細胞抵抗金黃色葡萄球菌和白色念珠菌過程中由Toll樣受體2/4和補體蛋白C3所觸發。在此過程中，細胞核DNA與細胞質發生融合，DNA-蛋白質復合物包裹于囊泡中，在特定情況下排出細胞形成NETs。此類NETs的形成不影響中性粒細胞壽命，其仍可正常吞噬病原體[23]。

2.3 線粒體相關NETs的形成

該途徑NETs的形成通常發生于中性粒細胞激活后15 min內。當中性粒細胞接收到粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子或補體因子5a的刺激信號時，線粒體DNA被釋放并形成NETs，而中性粒細胞亦不會死亡[24]。

3 NETs在COPD中的作用

作為全球性健康問題，目前臨床治療COPD的藥物尚無法逆轉病情或完全抑制炎癥狀態，亟需探尋新的治療策略，以打破COPD疾病進程、減少肺功能衰退、降低不良事件發生率及死亡率。中性粒細胞持續聚集是COPD的重要特征之一，作為中性粒細胞釋放的重要介質，NETs可通過其組分的細胞毒性及促炎作用，調節COPD病情進展。研究顯示，COPD患者中NETs及其組分水平與先天性免疫應答標志物具有相關性，可通過促進自身免疫反應以間接誘導肺組織損傷[4]。如NE作為NETs發揮免疫防御功能的關鍵成分，可直接消化抗炎分子顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)并通過其產物誘導IL-8表達，以形成炎癥惡性循環，引起ROS大量累積、呼吸道上皮與肺泡血管內皮功能損傷，增加COPD發生風險[25]。在感染所致的COPD中，病原體可通過多種機制驅動NETs形成，以降解呼吸道上皮宿主防御蛋白、損害機體的防御功能，使患者更易受到細菌感染，從而發生全身炎癥和組織損傷，促進COPD進展[26]。商安全等[27]研究顯示，中性粒細胞持續聚集可引起NETs異常釋放，以致呼吸道阻塞、肺功能下降，可能為COPD的誘發因素。吸煙導致COPD患者外周血中性粒細胞更易誘導、表達NETs，且與非吸煙者相比，吸煙者痰液中NETs相關蛋白含量更高，并加劇炎癥和肺組織損傷，加速COPD病程[28]；游離DNA、MPO等NETs活性成分在COPD患者外周血中呈高水平表達，亦可促進炎癥級聯放大和持續進展，使呼吸道炎癥和組織損傷永久化[29]。此外，COPD患者的肺組織巨噬細胞清除能力呈降低狀態，高水平促炎細胞因子和中性粒細胞趨化因子可形成正反饋，使呼吸道中性粒細胞數量持續增加、NETs水平持續升高，而NETs可與呼吸道上皮細胞受體相結合并促進其釋放炎癥因子，以致呼吸道黏液高分泌；同時NE作為呼吸道杯狀細胞的促分泌劑，可誘導低聚黏液形成，進一步加劇呼吸道阻塞，引起持續性氣流受限，導致COPD進展[30-31]。臨床報道顯示，COPD穩定期患者痰液中NETs形成增多，并與呼吸道中性粒細胞數量、氣流受限程度、肺功能受損及疾病嚴重程度呈正相關[32]；在COPD急性加重期，90%以上患者痰液中可檢測到NETs且其濃度與疾病加重頻率、疾病嚴重程度亦具有相關性[33]。故NETs及其組分介導的組織損傷可能是COPD進展的重要機制，可通過靶向調控NETs形成進行COPD防治。目前臨床針對COPD的治療方法(尤其在急性發作期時)均為廣泛的對癥性治療，若結合COPD病因，探尋有效的生物標志物，將有助于指導當前的臨床干預策略，實現更精準的個體化治療。

4 靶向NETs的COPD治療策略

中性粒細胞作為多種慢性肺部疾病病理生理的重要組成部分，通過局部而非全身應用拮抗劑對中性粒細胞的IL-8受體進行干預已成為減輕中性粒細胞所致肺組織損傷的有效方法。調控NETs形成的治療策略被證實可減輕慢性呼吸道炎癥，降低疾病嚴重程度，相關臨床試驗在陸續開展中。研究證實，CXCR2拮抗劑有助于減少肺部中性粒細胞浸潤，從而限制肺組織進一步損傷[34]，提示靶向調控NETs形成一定程度上對中性粒細胞的功能具有調節作用，最終達到治療COPD的目的。目前，通過抑制NETs形成進而發揮COPD治療作用的藥物靶點主要包括蛋白酶抑制劑、CXCR2拮抗劑、NADPH/ROS抑制劑、脫氧核糖核酸酶及其他抑制劑。

4.1 蛋白酶抑制劑

在NADPH氧化酶依賴性NETs形成過程中，NE和MPO參與了染色質去濃縮，故抑制此兩種蛋白功能理論上可達到減少NETs產生的目的。α-1抗胰蛋白酶和分泌性白細胞蛋白酶抑制因子均為內源性NE抑制劑，有助于維持蛋白酶-抗蛋白酶平衡，防止蛋白酶異常所引起的組織損傷，二者缺乏與呼吸道疾病流行具有相關性。AZD9668為一種口服性NE抑制劑，主要用于α-1抗胰蛋白酶缺乏癥的治療，隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗顯示，AZD9668可改善COPD患者的炎癥狀態，但對肺功能的逆轉效果不顯著，且部分患者出現轉氨酶升高，其是否由藥物副作用引起尚存爭論，給藥劑量及藥物服用時間亦不清晰[35]。GW311616A為一種選擇性NE抑制劑，通過阻斷NE核易位和染色質去濃縮進而干擾NETs的形成，在COPD小鼠模型中被證實可阻止ROS和NETs生成，并具有改善肺功能的作用[6]。針對MPO的抑制劑正在研發中，如AZM198通過抑制MPO活性在體外實驗中可顯著阻礙NETs形成、減輕中性粒細胞介導的內皮細胞損傷[36]。與之類似，MPO抑制劑氨基苯甲酸酰肼亦可延緩NETs形成，減輕中性粒細胞引起的炎癥損傷[37]?？傮w而言，雖然蛋白酶抑制劑在COPD的治療中具有巨大的應用潛能，但相關文獻多為動物實驗或體外研究，其在臨床中的治療效果尚待驗證，且治療劑量與潛在毒性作用等亦需警惕。

4.2 CXCR2拮抗劑

在COPD患者呼吸道分泌物中，CXCL8作為主要的中性粒細胞趨化因子，可通過CXC趨化因子受體(cysteine X chemokine receptor 1，CXCR)1和CXCR2發揮作用，其中CXCR1可促進中性粒細胞脫顆粒，CXCR2可誘導中性粒細胞通過循環系統向局部組織募集。臨床數據顯示，COPD急性加重期患者支氣管分泌物中CXCR1和CXCR2表達均升高，而體外實驗表明，中性粒細胞釋放NETs主要受CXCR2的調控[38]。AZD5069是一種選擇性CXCR2拮抗劑，可抑制COPD患者痰液和血清中性粒細胞形成NETs，以減弱炎癥損傷，促進組織修復，但并未顯著改善臨床結局[39]。另一種選擇性CXCR2抑制劑SCH527123在小鼠模型中可觀察到具有降低呼吸道分泌物中性粒細胞、MPO水平的作用，從而減少NETs形成[40]。與上述研究類似，在一項雙盲安慰劑對照研究中發現，CXCR2拮抗劑(MK-7123，50 mg)可顯著減低中重度COPD患者痰液中性粒細胞水平，改善吸煙者第1秒用力呼氣容積[41]。綜上，CXCR2拮抗劑可有效阻斷中性粒細胞向呼吸道遷移，阻止其向呼吸道釋放炎癥蛋白酶，繼而弱化了中性粒細胞相關炎癥損傷，可作為COPD潛在的抗炎治療藥物，但此類抑制劑對肺功能的改善作用尚存爭議。

4.3 NADPH氧化酶/ROS抑制劑

NADPH氧化酶是NETs形成的重要介質，而ROS是NETs形成的重要誘導劑，通過對二者進行功能抑制有助于干擾NETs形成。研究顯示，二苯二氯銨(DPI)可通過抑制NADPH氧化酶的活性，進而下調氧化應激反應、減少NETs形成[42]。與之類似，作為一種抗氧化劑，n-乙酰半胱氨酸可降低痰液黏度，其與DPI均可減少炎癥細胞因子和ROS產生，從而阻礙NETs的形成，改善哮喘患者肺功能[34，43]，且在COPD患者中n-乙酰半胱氨酸可降低急性加重期風險[44]。羥氯喹是一種抗瘧疾藥物，通過抑制體內NADPH氧化酶及細胞因子，下調ROS產生，并介導基質金屬蛋白酶-金屬蛋白酶組織抑制因子的相互作用，有助于維持ECM穩態，對NETs的形成具有抑制作用[45]，有望應用于類風濕關節炎、COPD等炎癥疾病的治療，擴寬臨床適應證。作為廣泛應用的降糖藥二甲雙胍，在糖尿病前期患者中一方面可通過抑制NADPH氧化酶活性，另一方面可減少NETs有效組分如NE、組蛋白、細胞外DNA表達，對NETs的形成產生阻礙[46]。

4.4 脫氧核糖核酸酶

DNA為NETs的重要支架結構，亦具有抗菌成分，細胞外DNA水平增加與多種慢性肺部疾病嚴重程度具有相關性，故通過脫氧核糖核酸酶降解DNA有望成為潛在的COPD治療靶點。在嗜中性粒細胞哮喘小鼠模型中，脫氧核糖核酸酶可顯著降低MPO表達水平，減輕氣道高反應性和呼吸道黏液阻塞，繼而改善肺功能，減少病情惡化[47]。此結果在臨床研究中得到了進一步驗證，Lachowic-Scroggins等[48]研究證明，通過脫氧核糖核酸酶破壞DNA結構，進而干擾NETs的形成可發揮預防NETs對哮喘患者呼吸道上皮損傷作用，期待后續針對COPD患者的相關研究成果發表。此外，該酶亦會對肺組織造成損傷，并可能加重病情，需提高警惕。

4.5 其他抑制劑

白三烯是炎癥細胞合成的重要炎癥介質，參與炎癥反應的誘導并被視為潛在的抗炎靶點，一項納入17例接受口服白三烯抑制劑治療的慢性支氣管炎伴COPD患者的研究顯示，該藥物對中性粒細胞介導的炎癥反應具有一定程度的緩解作用[26]。甲氰咪胍作為PAD4抑制劑在小鼠模型中可觀察到具有下調中性粒細胞計數、降低瓜氨酸組蛋白和炎癥因子水平的作用，進而抑制NETs形成和組織損傷[49]，且該結果在一項針對鏈霉素(PAD4抑制劑)的臨床研究中得到進一步驗證，研究者發現鏈霉素可降低潰瘍性結腸炎患者結腸活檢組織中瓜氨酸組蛋白和促炎細胞因子表達水平[50]。此外，PAD4抑制劑對流感嗜血桿菌感染誘導的中性粒細胞形成、NETs釋放亦具有抑制作用[51]。作為抗菌類藥物，大環內酯類被證實可抑制NETs形成，在免疫調節中發揮重要作用。動物實驗顯示，接受紅霉素治療的小鼠呼吸道NETs減少、肺部炎癥減輕，且后續研究證實紅霉素對NETs的形成具有抑制作用[52]，提示大環內酯類藥物可能通過抑制NETs形成進而發揮慢性炎癥治療作用。

5 小結

作為中性粒細胞發揮免疫調節功能的重要形式，NETs被證實在COPD患者中常呈異常表達，并與病情進展具有一定相關性，而靶向NETs的治療策略為COPD的治療提供了新選擇，且動物模型及小樣本臨床研究數據表明具有較好的應用前景，但基于NETs對COPD進行治療的方案仍面臨諸多挑戰：(1)相關研究成果多來源于動物實驗，且異質性較大；(2)尚缺乏高質量的臨床試驗對靶向藥物進行安全性和有效性驗證，以闡明相關藥物的具體作用機制、患者病理改變、有效劑量與劑量反應關系、不良反應等，且在應用于臨床實踐前，尚需制定明確的用藥指導指南。相信未來隨著對NETs治療COPD作用機制的進一步明確，將為NETs靶向藥物的臨床應用提供更多依據和理論基礎，同時有助于探尋更多的潛在治療靶點，為COPD靶向藥物的研發提供新思路。

作者貢獻：許金回負責文獻檢索、論文撰寫；劉苗苗、李雅亭、武興東、朱浩斌負責論文修訂；岳紅梅負責提供論文寫作思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突