不同脫鈣液對牙齒牙周聯合石蠟切片HE染色的影響

066100 北京軍區北戴河療養院 潘利鋒 吳 旭 夏建軍

400042 第三軍醫大學大坪醫院 毛成毅

·臨床·

不同脫鈣液對牙齒牙周聯合石蠟切片HE染色的影響

066100 北京軍區北戴河療養院 潘利鋒 吳 旭 夏建軍

400042 第三軍醫大學大坪醫院 毛成毅

目的 探討不同脫鈣液對牙齒牙周聯合切片HE染色質量的影響。方法 選用10%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、復合酸(Plank-Rychlo脫鈣液)和5%硝酸3種不同的脫鈣液，分成A、B、C 3組用于犬和大鼠牙齒牙周組織聯合石蠟切片脫鈣，通過記錄脫鈣時間，觀察HE染色效果，評價室溫下(20℃～28℃)不同脫鈣液對切片制作的影響。結果 A組脫鈣液所制切片染色效果良好，但脫鈣速度緩慢，所需時間較長；B組脫鈣液脫鈣速度快，所制切片染色好；C組脫鈣液所制切片的染色強度和對比度均不如前兩種脫鈣液。結論 在制作牙齒牙周聯合切片時，EDTA脫鈣液和Plank-Rychlo脫鈣液所制切片均能取得良好的染色效果，但EDTA脫鈣液脫鈣周期過長；Plank-Rychlo脫鈣液脫鈣均勻，速度快，更適合于臨床速檢工作；硝酸脫鈣液組染色效果較差。

脫鈣；牙齒；牙周組織；石蠟切片；HE染色

在涉及口腔組織病理的研究中，需要制作牙齒牙周組織聯合切片進行診斷、觀察和對比分析，但由于牙齒是全身硬度最高的組織，特別是牙釉質，其無機物成分羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]含量占97%，硬度與石英相似；牙本質、牙骨質及牙槽骨堅硬致密、易碎難切，而牙髓、牙齦、牙周膜等軟組織在切片過程中易受擠壓、牽拉、分離變形甚至脫落。如果硬組織不能很好地進行脫鈣處理，很難制得優良的切片并獲得滿意的染色結果。為更好地了解脫鈣技術對牙齒牙周聯合切片制作的影響，我們就室溫條件下3種脫鈣液的脫鈣效果以及對切片HE染色質量的影響進行了對比探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 SAKURA Tissue-Teb vip全自動脫水機(日本)；Leica石蠟包埋機 (德國)；Leica 2245輪轉式石蠟切片機(德國)。

1.2 脫鈣液配制 A液(EDTA脫鈣液)：EDTA 10 g，PBS緩沖液(pH 7.2)100 mL，加NaOH攪拌溶解后，用1 mol/L HCL調pH至7.2，再加甲醛15 mL[1]。B液(Plank-Rychlo脫鈣液)：氯化鋁7 g，鹽酸8.5 mL，甲酸5 mL，加蒸餾水至100 mL。C液(硝酸脫鈣液)：硝酸5 mL，甲醛10 mL，蒸餾水加至100 mL[2]。

1.3 標本制備及分組 標本為本院實驗動物中心提供的大鼠和犬，大鼠、犬牙頜組織在取材前均用5%戊二醛-4%多聚甲醛內固定。大鼠開胸從右心房開口，經左心室行主動脈灌注，犬斷頭后從左右頸動脈灌注，之后將其浸入4%多聚甲醛固定液內固定24 h。固定好的標本用金剛砂外圓分割器進行修整，將犬牙頜組織沿唇舌向全層鋸成大小約為1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm的組織塊。大鼠取完整的上下頜組織進行脫鈣。每組脫鈣液分別制作大鼠及犬牙頜組織標本各20例。

圖1 EDTA脫鈣液脫鈣10周(HE×200)

1.4 脫鈣及脫鈣終點的判定 采用上述3種不同脫鈣液，在室溫下進行脫鈣，定期更換脫鈣液，每間隔30 min探查脫鈣程度，以標本肉眼觀察至半透明狀，手感有彈性，針灸針能輕松刺入，無砂粒感為脫鈣完成，結合X-ray法確定脫鈣終點。

1.5 脫水和常規HE染色 酸性脫鈣液組脫鈣完成后流水沖洗2～4 h，經除酸處理后入脫水機脫水，EDTA脫鈣液組可直接入脫水機梯度酒精脫水，經透明，石蠟包埋，切片厚4 μm。行常規HE染色。

2 結果

2.1 脫鈣時間 A液脫鈣所需時間明顯長于其他兩種脫鈣液，約需8～10周，標本脫鈣比較完全；而B液能使標本在5 d內達到完全脫鈣的效果，所制切片均勻完整；C液是許多病理科用來處理骨標本的常用脫鈣液，但由于牙齒硬脆難切等特性，用于牙齒脫鈣卻往往效果不佳，需時約1周以上且脫鈣不均勻，切之有砂粒感。

2.2 HE染色效果 A液和B液脫鈣充分均勻，無膨脹現象；切片完整，無劃痕破碎情況。牙體組織(包括牙本質及其中的牙小管及牙骨質)結構清晰、完整。而且其中的牙髓組織、成牙本質細胞、牙髓細胞、骨和成骨細胞以及牙周組織中各種組織細胞結構均清晰，色質鮮艷，紅藍反差好，核染色質顯示清楚。從層次上來看，很容易區分牙齦、牙周膜、牙髓、牙本質、牙骨質和牙槽骨等結構 (圖1～2)。C液組切片顏色欠鮮艷，核不易著色，背景偏藍，對比度較差，組織細胞結構欠清晰(圖3)。

圖2 Plank-Rychlo脫鈣液脫鈣5 d(HE×200)

圖3 硝酸脫鈣液脫鈣6 d(HE×200)

3 討論

對牙齒牙周組織進行組織學觀察研究時，組織切片的制作是關鍵。但由于牙齒和骨組織都是鈣化的硬組織，特別是牙釉質高度鈣化，如果脫鈣不徹底可導致切片破碎甚至無法切片，因此組織制片前選擇合適的脫鈣液就顯得尤為重要。

EDTA是目前臨床最常用的螯合脫鈣劑，其脫鈣機制主要是EDTA與羥基磷灰石結晶的外層鈣結合，形成可溶性的非離子化合物，同時又促進晶體內層的結合鈣向外轉移，借助這種連續性的作用使羥基磷灰石晶體逐漸溶解，是最理想的制作HE染色和免疫組化染色的脫鈣劑。但因其脫鈣周期過長，EDTA脫鈣技術很難滿足臨床活檢病理診斷和鑒別診斷的需要，在臨床病理診斷中應用很少，僅在研究中有一些報告。雖然也有許多研究報告微波或光波輔助能縮短EDTA對骨組織脫鈣時間[3-5]，但其程序繁瑣且溫度不易控制。也有研究報告低溫下EDTA脫鈣保存組織結構的完整性優于加熱脫鈣，不主張對其進行加熱。我們研究認為室溫條件下EDTA脫鈣液對組織損傷小，HE染色效果好，但由于其脫鈣時間過長，不適用于臨床速檢工作，更適合作為科研實驗用脫鈣液。復合酸類脫鈣液是將兩種或兩種以上酸類脫鈣液一起使用，或在單純酸內加入另一種脫鈣液或少量的其他試劑所配制的脫鈣液，這類脫鈣液的特點是脫鈣完全、快速，可防止纖維組織過度膨脹，減少組織破壞及對染色的影響，還可以通過加入不同的化學成分來彌補單純酸類脫鈣液的不足。脫鈣液中三氯化鋁的加入可降低溶液的pH值，進一步加速脫鈣，鋁離子易被吸附而起到保護作用，又是蘇木素等媒染助染劑，染色效果好，越來越受到好評[3]。Plank-Rychlo脫鈣液是一種溫和、高效的脫鈣液，標本經過充分的內、外固定和良好的修整，使用該脫鈣液進行切片HE染色效果與EDTA相似，而且脫鈣時間大大縮短。本研究結果表明Plank-Rychlo脫鈣液是一種適合用于口腔病理常規速檢工作的脫鈣液，可以推廣使用。硝酸脫鈣液是多數病理科常用的骨脫鈣液，用于制作牙齒牙周聯合切片時，可使組織結構發生溶解破壞和疏松。此外使用硝酸脫鈣液時脫鈣時間也不易掌握，常出現局部脫鈣不均勻的現象，脫鈣時間過長組織細胞細微結構破壞嚴重，脫鈣時間過短，脫鈣又不徹底，不易制作切片且損壞切片刀。硝酸在脫鈣過程中可產生二氧化碳，氣泡從組織中溢出時可造成脫鈣后結締組織分離。用硝酸作脫鈣液時硝酸易形成亞硝酸使脫鈣液呈黃色，產生顏色后迅即影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色反應。在硝酸內加入1 g/L的尿素可以防止變黃而使其無色，但尿素僅有暫時作用，一旦硝酸顯淡黃色時需再加尿素(Clayden氏法)。硝酸在對組織脫鈣的同時也對組織酸化，因此HE染色容易造成細胞核著色欠佳。經本實驗驗證硝酸脫鈣液不太適用于牙齒及牙周組織脫鈣。

可見，制作出優質的牙體牙周聯合切片，選擇合適的脫鈣液是關鍵，此外還應注意以下幾點：①標本應充分固定，以便更好保護組織結構。②標本經過良好修整可提高脫鈣質量，難以一次成型的大標本可邊脫鈣邊修整。③脫鈣液的體積應不少于標本體積的20倍，為保證脫鈣效果，應經常更換脫鈣液，以保持脫鈣液濃度。④為獲得最佳的染色效果，酸性脫鈣液處理過的標本脫鈣完畢后應充分除酸。

[1]EmansPJ,Bulstra SK,KuijerR.The effectsofdifferent decalcification protocols on TUNEL and general cartilage staining[J].Biotech Histochem,2005,80(3-4):111-115.

[2]Fugaro JO,Nordahl I,Fugaro OJ,et al.Pulp reaction to vital bleaching[J].Operative Dentistry,2004,29(4):363-368.

[3]劉大維，初同偉，張良，等.微波脫鈣骨的免疫組化染色[J].第三軍醫大學學報，2003，25(1)：77-78.

[4]Tinling,Giberson,Kullar.Microwave exposureincreasesbone demineralization rate independent of temperature[J].Microsc,2004,215(3):230-235.

[5]Cunningham CD,SchulteBA,BianchiLM,etal.Microwave decalcification of human temporalbones[J].Laryngoscope,2001,111(2):278-282.

Objective To investigate the effect of different decalcifying fluid on HE color of teeth and periodontal tissue united sections.Methods10%EDTA decalcifying fluid, mixed acid (Plank-Rychlo)and 5% nitric acid were divided into three groups: group A, group B and Group C, which were used to decalcify the united paraffin sections of tooth and periodontal tissue from dogs and rats.The effect of three kinds of decalcifying fluid on manufacture of united sections was evaluated at room temperature(20℃～28℃)by decalcification time and HE staining quality.Results Group A had a good effect of HE staining, but its decalcification time was too long. Group B had either high speed decalcification or high staining quality.Group C was the last choice with the regard of poor staining intensity and contrast.Conclusion EDTA decalcifying fluid and Plank-Rychlo decalcifying fluid can get a favorable staining effect,but has a long decalcification period,Plank-Rychlo decalcifying fluid is more suited to clinical quick examination due to well-distributed and high speed decalcification.Nitric acid decalcifying fluid has a poor staining effect.

Decalcification;Tooth;Periodontal tissue;Paraffin section;Hematoxylin/eosin staining

2009-05-08)

1005-619X(2009)12-1123-03